實驗結果與討論 - 酸鹼開關複合型奈米藥物傳輸系統之研發及其在癌症治療上之應用

4-1、酸鹼應答型接枝共聚物 PLA-g-P(NVI-co-NVP)之製備與 鑑定

酸鹼應答型接枝共聚物 PLA-g-P(NVI-co-NVP)是由單體 N-Vinylimidazole(NVI)、N-Vinyl-2-pyrrolidone(NVP)以及巨單體 PLA-HEMA 所構成。其合成步驟主要由兩個聚合反應組成：

(1) 陽離子開環聚合反應 (cationic ring-opening polymerization)，其反應機構如圖 4-1 所示，陽離子開環反應之特性為反應之聚合度(degree of polymerization)可以控制的非常理想，即單體進料比與產物組成比非常接近；分子量分佈也相當均一。本研究首先是利用 stannous octoate(Sn(Oct)₂)作為反應之觸媒，與反應單體

D,L

-lactide 之 carbonyl group 形成配位鍵結以提高 carbonyl group 之反應活性，進一步地使 2-hydroxyethyl methacrylate(HEMA) 末端帶有孤對電子對之 hydroxy group 進行 SN₂ 反應，攻打缺乏電荷密度之 carbonyl group，此即為聚合反應之起始反應 (initiation)。而後反應活性種將會轉移至下一個

D,L

-lactide 單體上，之後便是成長反應 (propagation)的發生，高分子鏈便由此慢慢成長至預期之分子量，待反應時間終了，才加入 0.1N 之 KOH/methanol 與觸媒作用，中止其反應活性。陽離子開環反應所合成之 PLA-HEMA 經由 ¹H-NMR 分析，可鑑定其結構 (如圖 4-2 所示 )：δ 1.4-1.7(m, CH3 from PLA)；δ 1.92(s, CH3 from HEMA )；δ 4.33(s, CH2CH2

from HEMA)； δ 5.1-5.2(m, CH from PLA)； δ 5.58、 δ 6.10(s,

(2) 自由基共聚合反應 (free radical polymerization)，因自由基成長的快且其終止反應就包刮了再結合(recombination)、

不均化(disproportionation)以及自由基轉移 (radical transfer)三種，故其本身之特性為成長反應相當快速但較難得到分子量均一之高分子。本研究是利用巨單體 PLA-HEMA 與 NVI、 NVP 行自由基接枝共聚合反應，相較於傳統之接枝共聚合反應而言，此法可得到結構較明確之接枝共聚合物。因傳統之接枝共聚合是先將主鏈製備完成，再將其與側鏈單體進行聚合反應，但不容易將未反應之巨單體鏈段與分枝共聚合物分離，造成分枝的數目和長度不均一。本研究所合成之 PLA-g-PNVP(主鏈不含酸鹼應答之單體 NVI，即 G0)與 PLA-g-P(NVI-co-NVP)接枝共聚物經 ¹H-NMR 分析，可鑑定其結構 (如圖 4-3、圖 4-4 所示)、組成比 (表 4-1)與數目平均分子量 (表 4-2)：δ 1.27(s, CH₃

from PLA-HEMA) ； δ 1.4-1.5(m, CH₃ from PLA-HEMA) ； δ1.6-1.9(broad, CH₂ from NVI 、 NVP and PLA-HEMA) ；

δ2.0-2.1(broad, -COCH₂CH₂from NVP )；δ 2.2(broad, -COCH₂ from NVP)；δ 3.1-3.2(broad, CH₂NCH₂ from NVP；-NCH₂ from NVI)； δ 4.19(s, CH₂CH₂ from PLA-HEMA)； δ 5.1-5.2(m, CH from PLA-HEMA)； δ 6.9-7.8(broad, CH from NVI)。

此外，接枝共聚物亦利用傅立葉紅外線光譜儀 (FT-IR)進行結構分析(如圖 4-5 所示 )：1660 cm^{- 1}為 NVP 上的 amide group 行 stretching vibration 之吸收； 1750 cm^{- 1}為 PLA-HEMA 上的 ester group 行 stretching vibration 之吸收。綜合上述，可確認已成功地合成出 PLA-g-P(NVI-co-NVP)接枝共聚物。

圖 4-3、 PLA-g-PNVP 之 ¹H-NMR 光譜圖

圖 4-4、 PLA-g-P(NVI-co-NVP)之 ¹H-NMR 光譜圖

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 60

65 70 75 80

T ran sm itt a n c e ( % )

Wavenumber (cm

^-1

) PLA-g-P(NVI-co-NVP)

Ester C=O at 1750 cm^-1

Amide C=O at 1660 cm^-1

圖 4-5、 PLA-g-P(NVI-co-NVP)之 FT-IR 光譜圖

表 4-1、接枝共聚物 PLA-g-P(NVI-co-NVP)之組成比

PLA NVI NVP PLA NVI NVP PLA-g-PNVP G0 3.4 0 96.6 3.6 0 96.4

(a) Mn of backbone & side chain determined by ¹H-NMR.

(b) Total Mn of Graft copolymer = Mn of backbone + Mn of side chain

4-2、二團聯共聚物 mPEG-PLA 之製備與鑑定

二團聯共聚合物 mPEG-PLA 是由巨單體 mPEG 及 poly(

D,L

-lactide) 所構成。其合成反應步驟是由 mPEG 與 D,L-lactide 以 Sn(OCt)2 為觸媒進行陽離子開環聚合反應而形成共聚物。反應機制則與 PLA-HEMA 之合成反應類似，本研究首先是利用 stannous octoate(Sn(Oct)2)作為反應之觸媒，與反應單體 D,L-lactide 之 carbonyl group 形成配位鍵結以提高 carbonyl group 之反應活性，進一步地使 mPEG 末端帶有孤對電子對之 hydroxy group 進行 SN₂反應，攻打缺乏電荷密度之 carbonyl group，後續之反應皆與 PLA-HEMA 類似，差別在於 mPEG 末端所形成之活性自由基較不容易攻打 D,L-lactide 單體(因高分子鏈可能會隱蔽末端之活性自由基，降低其與單體反應之機率)，進而提高反應之困難度。

所合成之 mPEG-PLA 經由 1H-NMR 之分析，可鑑定其結構 ( 如圖 4-6 所示 ) ： δ 1.4-1.6 (m, CH3 from PLA) ； δ 2.34(broad, -OH from PLA)； δ 3.36(s, -OCH3 from mPEG)； δ 3.59-3.62(s, -OCH2CH2 from mPEG)； δ 4.3-4.4(m, -OCH2CH2 from mPEG conjugated with PLA) ； δ 5.1-5.2(m, CH from PLA)。本研究合成三種不同分子量之 mPEG-PLA 共聚合物，經由 1H-NMR 可推算出數目平均分子量，再輔以凝膠滲透層析儀 (GPC) 之測試，可得其 polydispersity index (PDI)，列於表 4-3。

此外，mPEG-PLA 二團聯共聚物亦利用傅立葉紅外線光譜儀(FT-IR)進行結構分析 (如圖 4-7 所示 )： 1100 cm-1 為 mPEG 與 PLA 上的 ether group 行 stretching vibration 之吸收； 1750 cm-1 為 PLA 上的 ester group 行 stretching vibration 之吸收。綜合上述，可確認已成功地合成出 mPEG-PLA 二團聯共聚物。

圖 4-6、 mPEG-PLA 之 ¹H-NMR 光譜圖

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

(b) PDI determined by GPC

4-3、臨界微胞濃度 (critical micelle concentration, CMC)之 鑑定

微胞形成機制一直以來皆是各界探討之研究重點之一，而微胞之模型最早是由 Hartley 於 1936 年所提出 (但此模型是以界面活性劑為組成微胞之小單元所提出) 【 94】，後繼的一些研究如中子散射實驗、光散射實驗，均證實此結構確實存在且符合熱力學平衡與結構穩定性平衡之原理。

雙性共聚物(amphiphilic copolymer)於水溶液中欲組裝成高分子微胞之最低濃度即稱為臨界微胞濃度(critical micelle concentration, CMC)，臨界微胞濃度之概念應用於癌症治療之藥物微胞載體上可以提供一個淺顯易懂的概念。即當藥物微胞於體內循環時，勢必會被體內大量的血液稀釋，如果臨界微胞濃度太高將造成微胞結構的不穩定而使高分子鏈段脫離瓦解，進一步地造成藥物毒殺正常組織之副作用。因此，在設計與研究一新型態高分子奈米微胞之首要研究重點即是鑑定高分子奈米微胞之臨界微胞濃度。

臨界微胞濃度之測量是利用疏水性分子 pyrene 當作螢光染劑，pyrene 的激發波長會隨著其本身所處環境極性的改變而改變。亦即，在低濃度微胞尚未形成的情況下，pyrene 會分散於水溶液中(極性環境 )，此時 pyrene 之激發波長為 335nm；而當共聚物濃度提高時，開始有所謂的微胞前趨體的產生，此時疏水性的 pyrene 分子會傾向於疏水之微胞內核 ( 非極性環境)，此時 pyrene 之激發波長為 337nm，如圖 4-8 所示【 95-97】。本實驗是利用螢光光譜儀，固定放射波長(emission wavelength)

在 390nm 的情況下，觀察激發波長在 335nm 與 337nm 之強度變化。而臨界微胞濃度可由吸收強度在 337nm 與 335nm 之比值與激發波長作圖(即 I3 3 7

/I

3 3 5 對激發波長作圖)，再將兩條直線做外插，可求得交點，即臨界微胞濃度。

本實驗共探討： (1)設計三種不同主鏈組成比之接枝共聚物 PLA-g-P(NVI-co-NVP)，探討其臨界微胞濃度的變化； (2) 設計三種不同鏈段長度比之二團聯共聚物 mPEG-PLA，探討其臨界微胞濃度的變化。實驗結果如圖 4-9 與圖 4-10 所示，並整理於表 4-4。由實驗結果，可知當接枝共聚物主鏈之 NVI 含量提高時，臨界微胞濃度有些微下降，這是因為接枝共聚物主鏈之親水性降低了，但這並不代表 NVI 為疏水之單體 (查文獻可知，NVI 為親水單體 )，只是相對於 NVI 而言， NVP 之親水性較 NVI 好，故 NVP 在整個接枝共聚物主鏈之含量降低造成主鏈之親水性降低，進一步地使臨界微胞濃度降低。另外，在二團聯共聚物方面，可知當提高疏水端 PLA 之長度，臨界微胞濃度有顯著地下降，這是因為二團聯共聚物之疏水作用力有顯著的提高所造成。

綜合上述，我們可以得到下列結論：

(1) 降低雙性共聚物親水端之親水作用力，可稍微地降低其臨界微胞濃度。

(2) 提高雙性共聚物疏水端之疏水作用力，可明顯地降低其臨界微胞濃度。

(3) 接枝共聚合物之臨界微胞濃度大抵上皆較二團聯共聚物

性降低使得聚集力變強，且因為接枝型共聚物之 PLA 鏈段皆較二團聯共聚物長，且接枝密度也較高，故其有較強之疏水作用力，即聚集力較強之故。

300 310 320 330 340 350

B2

16.0 mPEG-PLA (Mn5000:1050)

B3

5.4 mPEG-PLA (Mn5000:1750)

(A)

(D)

4-4、接枝型奈米微胞之製備與鑑定

高分子雙團聯共聚物欲在水溶液中自我組裝成一有序列之結構，通常其結構皆必須具有親疏水性差異明顯的兩段高分子鏈，而隨著親疏水鏈段比列之不同，其在水溶液中之組裝結構亦不相同，常見的結構有微胞(micelle)、棒狀 (cylinder)、層板狀(lamella)等結構。當我們提高親疏水端之組成比例時 (增加親水鏈段比；降低疏水鏈段比)，組裝之結構會由層板狀或棒狀轉為微胞之結構。而高分子微胞之形成取決於親疏水性分子鏈段的比例。在水相環境下，當親水性鏈段之分子量大於疏水性鏈段時，高分子鏈會因在水溶液中親疏水性之不同而排列成核殼結構(core-shell structure)的高分子微胞。

高分子微胞形成之過程包含了兩種作用力的平衡，其一是使高分子互相聚集的疏水性作用力，其二是避免高分子微胞無限聚集而形成微相(microdomain)的高分子鏈段排斥力。其熱力學行為與小分子量的界面活性劑相似，形成微胞的驅動力主要是因為在水溶液中，雙性共聚合物的疏水性鏈段為了減少與水的接觸面積而自我聚集，再加上覆蓋在疏水性鏈段外層的親水性鏈段使得疏水性鏈段與水的接觸面積減到最低，因此使系統的自由能達到最小值而形成最穩定的狀態。

本研究製備之接枝型奈米微胞的方式與一般雙性二團聯共聚物奈米微胞之製備方式相同，是採用傳統的透析(dialysis) 方式，先將接枝型共聚物溶解於 DMSO 有機溶劑中，再將溶液置入透析膜(dialysis bag)，利用透析膜內外濃度梯度之差異，緩慢地將 DMSO 置換成水溶液。此法之優點在於可避免

雙性共聚物在初期快速且過度地聚集，利用緩慢地置換水與有機溶劑，最終將可得到規則排列且具有核殼結構(core-shell structure)的奈米微胞。實驗之結果整理於表 4-5。

而本論文對於接枝型奈米微胞之研究重點是在探討接枝共聚物主鏈組成比之不同對於其應答行為之關係，探討之重點將著重於：NVI(酸鹼應答材料 )含量的多寡與接枝型奈米微胞之粒徑大小、粒徑分布、酸鹼應答型為、膨潤行為、開關行為、藥物包覆含量、藥物釋放行為及癌細胞毒殺行為等的關係。故由表 4-5 及圖 4-11 所得之實驗結果，我們選用平均粒徑較小且粒徑分佈較均一的 G3(NVI 28.4%)與 G5(NVI 48%)作為往後實驗探討的對象；並選用主鏈不含 NVI 之 G0(NVI 0%)做為實驗的對照組。

表 4-5、接枝型奈米微胞之平均粒徑與 PI 值

Code^{( a )} Average Diameter

±SD(nm)^{( b )}

Polydispersity Index

±SD^{( b )}

G0 107.3±0.5 0.113±0.006 G1 129.4±1.4 0.1±0.009 G2 87.5±0.6 0.14±0.002 G3 118.2±1.1 0.067±0.008 G4 114.2±1.8 0.165±0.035 G5 96.8±1.3 0.072±0.005

(a) Graft copolymer with NVI X*10 %

(b) SD-standard deviation of three independent measurements

(A) G0 (NVI _0%) (B) G1 (NVI _9.9%)

(E) G4 (NVI _39.4%) (F) G5 (NVI _48%)

圖4-11、不同組成比接枝型奈米微胞之平均粒徑與 PI 值

4-5、接枝型奈米微胞之聚集行為探討

(H2O 含量介於 15~30%時 )，造成疏水端 PLA 作用力不斷增強，於是便慢慢地形成微胞前趨體(precursor)，在此區間，儀器已經可以偵測到奈米微胞的粒徑大小，但是其粒徑分佈仍然處於一混亂狀態，我們可藉此推測此時微胞內核呈現一膨潤狀態，亦即溶劑與疏水端 PLA 共處；而後隨著 H2O 含量不斷地

在文檔中酸鹼開關複合型奈米藥物傳輸系統之研發及其在癌症治療上之應用 (頁 77-155)