本 研 究 係 利 用 具 有 酸 鹼 應 答、生 物 相 容 性 及 生 物 可 降 解 性 之 接 枝 共 聚 物 Poly(
D,L
-lactide)-g-Poly(N-vinylimidazole-co-N- vinyl-2-pyrrolidone)(PLA-g-P(NVI-co-NVP))，與 具 有 免 疫 隱 蔽 性 及 生 物 可 降 解 性 之 二 團 聯 共 聚 物 methoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(D,L
-lactide)(mPEG-PLA)，設 計 出 一 同 時 具 有 環 境 酸 鹼 應 答 行 為、可 逆 開 關 行 為 及 免 疫 隱 蔽 性 之 複 合 型 高 分 子 奈 米 微 胞。mPEG 可 隱 蔽 內 核 結 構 的 強 正 電 性 與 疏 水 特 性 進 而 增 加 於 體 內 循 環 之 穩 定 性 與 細 胞 吞 噬 量 ； 而 NVI 可 藉 由 其 酸 鹼 應 答 行 為，待 藥 物 載 體 被 細 胞 吞 噬 後，可 藉 由 正 電 排 斥 力 造 成 結 構 的 膨 潤 進 而 釋 放 藥 物 ；PLA 則 具 有 包 覆 輸 水 抗 癌 藥 物 的 能 力 。 研 究 中 對 mPEG-PLA 及 PLA-g-P(NVI-co-NVP)之 合 成 與 性 質、臨 界 微 胞 濃 度(CMC)、奈 米 微 胞 之 製 備、複 合 型 奈 米 微 胞 之 形 成 機 制、酸 鹼 開 關 行 為、微 胞 型 態 之 分 析、體 外 藥 物 釋 放 模 擬、材 料 毒 性、細 胞 毒 殺 分 析 與 內 吞 作 用 進 行 探 討 並 得 到 以 下 結 論 ：1.利 用 陽 離 子 開 環 聚 合 反 應 可 以 合 成 分 子 量 準 確 且 分 子 量 分 佈 狹 窄 的 巨 單 體 PLA-HEMA， 再 將 PLA-HEMA 與 NVI 及 NVP 單 體 藉 由 自 由 基 共 聚 合 反 應 可 合 成 出 結 構 明 確 之 接 枝 共 聚 物 PLA-g-P(NIPAAm-co-MAAc)。經 由 1H-NMR 與 FT-IR 之 分 析，
可 確 定 成 功 地 合 成 出 不 同 主 鏈 組 成 比 之 G0、 G1、 G2、 G3、
G4、G5 接 枝 共 聚 物，且 主 鏈 與 側 鏈 之 總 分 子 量 約 為 5：3 時 ， 奈 米 微 胞 有 較 小 的 粒 徑 大 小 與 較 窄 的 粒 徑 分 佈 。
P(NVI-co-NVP)後 性 質 差 異 太 大 ， 與 層 析 管 柱 作 用 力 不 同 ， 因 此 PLA-g-P(NVI-co-NVP)之 分 子 量 須 以 1H-NMR 計 算 得 知 。 3.利 用 methoxy poly(ethylene glycol)為巨單體進行
D,L
-lactide 之 陽 離子 開 環 聚 合 反 應 可 以 成 功 地 合 成 出 mPEG-PLA ， 且 經 由
1H-NMR、 FT-IR 與 GPC 之 鑑 定 ， 可 確 定 成 功 地 合 成 出 三 種 不 同 鏈 段 比 之 B1、 B2、 B3 二 團 連 共 聚 物 。
4.經 由 臨 界 微 胞 濃 度 (CMC)之 鑑 定 可 發 現，降 低 雙 性 共 聚 物 親 水 端 之 親 水 作 用 力，可 稍 微 地 降 低 CMC(NVI 組 成 比 提 高，CMC 降 低)； 提 高 雙 性 共 聚 物 疏 水 端 之 疏 水 作 用 力 ， 可 明 顯 地 降 低 CMC(PLA 分 子 量 變 大，CMC 變 小 )。接 枝 共 聚 合 物 之 CMC 大 抵 上 皆 較 二 團 聯 共 聚 物 低 ， 這 是 因 為 PLA 接 於 其 側 鏈 ， 造 成 共 聚 物 本 身 之 活 動 性 降 低 使 得 聚 集 力 變 強，且 因 為 接 枝 型 共 聚 物 之 PLA 鏈 段 皆 較 二 團 聯 共 聚 物 長 ， 接 枝 密 度 亦 較 高 ， 故 其 有 較 強 之 疏 水 作 用 力 ， 即 聚 集 力 較 強 之 故 。
5.由 奈 米 微 胞 形 成 機 制 之 探 討 可 知，微 胞 在 形 成 過 程 中 包 含 三 個 主 要 步 驟，而 此 三 步 驟 之 轉 換 對 於 微 胞 形 成 與 藥 物 包 覆 具 有 非 常 重 要 之 影 響 ：(1)高 分 子 於 溶 液 中 由 自 由 捲 曲 狀 逐 漸 形 成 微 胞 前 趨 體 膨 潤 結 構 。(2)微 胞 前 趨 體 膨 潤 結 構 排 除 核 內 有 機 溶 劑 轉 變 為 緊 密 結 構 。(3)隨 著 水 含 量 的 增 加 ， 微 胞 由 緊 密 結 構 逐 漸 固 化 。
6.由 初 期 水 含 量 對 於 奈 米 微 胞 透 析 結 果 之 探 討 可 知 ， G0、 G3、
G5 接 枝 型 奈 米 微 胞 分 別 於 5%、 10%、 10%之 初 期 水 含 量 下 可 得 到 較 混 亂 的 微 胞 型 態，並 於 此 初 期 水 含 量 下 進 行 藥 物 包 覆 實 驗，可 得 到 較 大 的 藥 物 包 覆 量；而 又 分 別 皆 於 20%之 初 期 水 含
量 下 可 得 到 最 佳 的 粒 徑 大 小 與 分 佈(平 均 粒 徑 皆 約 為 80 nm；
粒 徑 分 佈 則 皆 小 於 0.1)。
7.由 動 態 光 散 射 儀 與 介 面 電 位 分 析 儀 之 測 試 可 知 複 合 型 奈 米 微 胞 確 實 成 功 地 被 製 備 出 來，其 中，B2 及 B3 二 團 聯 共 聚 物 之 疏 水 端 PLA 皆 比 B1 二 團 聯 共 聚 物 長，故 可 與 G0、G3、G5 等 接 枝 共 聚 物 形 成 粒 徑 大 小 與 粒 徑 分 佈 較 佳 的 複 合 型 奈 米 微 胞。而 接 枝 共 聚 物 與 二 團 聯 共 聚 物 之 重 量 比 為 1： 1 時 又 可 得 到 較 小 的 粒 徑 大 小 與 較 窄 的 粒 徑 分 佈。即 G0B2、G0B3、G3B2、G3B3、
G5B2 以 及 G5B3 等 組 合 皆 可 得 到 結 構 較 穩 定 的 複 合 型 奈 米 微 胞 。
8.接 枝 /複 合 型 奈 米 微 胞 經 由 動 態 光 散 射 儀 可 確 定 其 粒 徑 大 小 與 分 佈 情 形 ； 藉 由 AFM 影 像 分 析 ， 可 確 認 微 胞 之 球 型 結 構 與 表 面 型 態；藉 由 TEM 影 像 分 析，更 可 證 明 其 殼 核 結 構 確 實 存 在。
9.由 接 枝 /複 合 型 奈 米 微 胞 之 酸 鹼 應 答 行 為 分 析 可 知 ， 主 鏈 具 有 48% NVI 之 G5 接 枝 型 奈 米 微 胞 有 較 高 的 膨 潤 情 形，於 酸 性 環 境 下 ， 其 結 構 可 膨 潤 約 48.7%。 而 G5B2 複 合 型 奈 米 微 胞 之 酸 鹼 應 答 行 為 又 比 G5B3 複 合 型 奈 米 微 胞 佳 (G5B2 複 合 型 奈 米 微 胞 之 膨 潤 比 為 47.9%； G5B3 則 為 37.1%)， 因 B3 二 團 聯 共 聚 物 之 PLA 分 子 量 為 1750， 雖 可 大 大 地 穩 定 奈 米 微 胞 的 結 構 ， 但 卻 遏 止 了 其 膨 潤 效 果 。
10.而 由 On-Off 酸 鹼 應 答 行 為 分 析 可 知 ， 不 論 是 G3、 G5 接 枝 型 奈 米 微 胞 亦 或 是 G3B2、 G5B2 複 合 型 奈 米 微 胞 於 長 時 間 高 分 子 鏈 有 足 夠 的 反 應 時 間 進 行 重 新 組 裝 的 前 提 之 下，皆 有 穩 定 的
收 縮 的 改 變 ， 粒 徑 分 佈 卻 不 會 隨 著 On-Off 次 數 增 加 而 變 雜 亂 。 另 外 於 短 時 間 的 快 速 On-Off 酸 鹼 應 答 行 為 測 試 ， 發 現 僅 有 G5 接 枝 型 奈 米 微 胞 與 G5B2 複 合 型 奈 米 微 胞 有 穩 定 的 On-Off 酸 鹼 應 答 行 為 。
11.由 On-Off 酸 鹼 應 答 之 TEM 影 像 可 知 ， pH 值 降 低 會 使 位 於 微 胞 外 殼 的 NVI 因 酸 化 造 成 正 電 排 斥 力 ， 進 而 使 微 胞 變 得 較 為 混 亂 但 仍 為 一 球 型 結 構 ； 而 pH 值 一 旦 又 回 復 為 中 性 時 ，微 胞 又 會 重 組 回 殼 核 結 構，但 結 構 較 原 先 稍 為 混 亂，但 整 體 仍 不 失 為 一 個 具 有 良 好 On-Off 酸 鹼 應 答 性 質 的 奈 米 微 胞 。
12.於 相 同 的 製 備 條 件 下，接 枝 型 藥 物 微 胞 之 藥 物 包 覆 量 以 G5 接 枝 型 藥 物 微 胞 較 高，高 達 42.3%；G3 接 枝 型 藥 物 微 胞 雖 較 低 ， 但 也 有 36.9%之 藥 物 包 覆 率，缺 點 是 其 粒 徑 分 佈 過 於 雜 亂，故 予 已 淘 汰。而 G5B2 複 合 型 藥 物 微 胞 可 用 較 少 的 藥 物 劑 量 卻 達 到 相 同 劑 量 下 較 高 的 包 覆 率 。
13.比 較 接 枝 /複 合 型 藥 物 微 胞 之 藥 物 釋 放 效 果 ， 於 pH5.0 時 兩 者 並 無 明 顯 差 別 ， 且 於 釋 放 24 小 時 後 ， 皆 可 達 到 將 近 50%的 藥 物 釋 放 量 ； 而 於 pH7.4 時 兩 者 差 別 相 當 明 顯 ， G5B2 複 合 型 藥 物 微 胞 由 於 表 面 具 有 mPEG 之 穩 定 與 遮 蔽 作 用 ， 故 可 於 中 性 環 境 下 穩 定 包 覆 藥 物 ， 釋 放 量 僅 約 5%， 而 G5 接 枝 型 藥 物 微 胞 卻 有 10%的 藥 物 損 失 。 另 外 在 不 斷 地 改 變 pH 值 的 條 件 之 下，接 枝/複 合 型 藥 物 微 胞 仍 具 有 On-Off 酸 鹼 應 答 的 藥 物 釋 放 行 為 。
14.以 牛 血 清 蛋 白 (BSA)進 行 載 體 穩 定 性 測 試 ， 實 驗 結 果 發 現 由 於 接 枝 型 奈 米 微 胞 於 中 性 環 境 下 表 面 帶 有 弱 正 電，因 此 較 易 與 表
面 帶 負 電 的 蛋 白 質 互 相 吸 引，進 而 造 成 蛋 白 質 與 疏 水 內 核 因 疏 水 作 用 力 的 關 係 造 成 大 量 的 聚 集 ， 其 穩 定 性 僅 維 持 48 小 時 。 而 複 合 型 奈 米 微 胞 由 於 有 mPEG 的 隱 蔽 作 用 ， 穩 定 性 可 持 續 96 小 時 之 久 。
15.將 單 純 的 接 枝 /複 合 型 奈 米 微 胞 與 人 類 纖 維 母 細 胞 (Hs68)共 同 培 養 ， 發 現 複 合 型 奈 米 微 胞 有 較 低 的 材 料 毒 性(即 較 高 的 生 物 相 容 性)，且 於 72 小 時 的 培 養 下，其 IC50僅 為 接 枝 型 奈 米 微 胞 的 三 分 子 一 。 由 此 可 知 ， 複 合 型 奈 米 微 胞 外 殼 的 mPEG 確 實 能 夠 隱 蔽 內 核 NVI 的 正 電 性 ， 大 大 地 提 高 載 體 實 際 應 用 於 動 物 實 驗 上 的 學 術 價 值 。
16.由 接 枝 /複 合 型 藥 物 微 胞 對 於 HeLa 細 胞 與 HepG2 細 胞 之 毒 殺 結 果 可 知 ，G5 接 枝 型 藥 物 微 胞 與 G5B2 複 合 型 藥 物 微 胞 皆 對 癌 細 胞 有 良 好 的 生 長 抑 制 能 力，而 又 以 G5B2 複 合 型 藥 物 微 胞 於 低 濃 度 下 有 較 佳 的 毒 殺 效 果(IC50 較 低)。 就 癌 細 胞 而 言 ， doxorubicin 對 HeLa 細 胞 有 較 佳 的 生 長 抑 制 效 果。若 排 除 藥 物 載 體 本 身 的 藥 物 釋 放 率 ， 其 毒 殺 效 果 幾 乎 與 free DOX 沒 有 差 別 ， 可 再 次 證 明 細 胞 毒 殺 確 為 doxorubicin 所 致 而 非 載 體 本 身 造 成 的 毒 性 。
17.經 由 共 軛 焦 顯 微 鏡 影 像 證 實 接 枝 /複 合 型 藥 物 微 胞 是 藉 由 胞 飲 作 用 於 酸 性 胞 器 處 進 行 藥 物 釋 放，意 即 抗 癌 藥 物 於 溶 酶 體 內 釋 放 後 再 經 由 擴 散 作 用 累 積 至 細 胞 質，而 後 快 速 進 入 細 胞 核 進 行 毒 殺。其 中 又 以 G5B2 複 合 型 藥 物 微 胞 較 易 被 細 胞 吞 噬，有 較 快 及 較 佳 的 毒 殺 行 為。另 外，由 於 擴 散 作 用 比 胞 飲 作 用 快，因 此 未 經 包 覆 的 DOX·HCl 有較強及較快的細胞毒殺能力。
綜 合 上 述 ， 本 研 究 所 製 備 之 接 枝 /複 合 型 奈 米 微 胞 皆 具 有 相 當 均 一 的 粒 徑 大 小 與 分 佈 ， 單 純 就 On-Off 酸 鹼 應 答 的 觀 點 來 說，接 枝 型 奈 米 微 胞 有 較 佳 的 表 現 效 果，即 其 結 構 具 有 較 明 顯 的 環 境 應 答 可 逆 膨 潤 行 為 與 藥 物 開 關 釋 放 行 為。然 而，一 個 理 想 的 藥 物 傳 輸 載 體，必 須 同 時 具 備 許 多 優 點，而 本 研 究 所 製 備 之 複 合 型 奈 米 微 胞 即 同 時 具 有 快 速 的 環 境 應 答 行 為 以 及 良 好 的 免 疫 隱 蔽 能 力。也 就 說 此 複 合 型 藥 物 傳 輸 載 體 不 僅 可 藉 由 靜 脈 注 射 於 血 液 中 穩 定 地 循 環 ， 並 藉 由 EPR 效 應 大 量 地 累 積 於 腫 瘤 組 織 附 近 ， 而 後 藉 由 其 快 速 的 On-Off 酸 鹼 應 答 行 為 進 行 細 胞 毒 殺。最 重 要 的 是，細 胞 凋 亡 後，載 體 本 身 可 藉 由 On-Off 的 特 性，於 中 性 環 境 下 穩 定 地 存 在，待 再 次 累 積 於 腫 瘤 組 織 附 近 時，進 行 第 二 次 的 毒 殺 機 制。此 特 性 不 僅 可 減 少 藥 物 傳 輸 載 體 對 於 正 常 細 胞 的 毒 殺 機 率 亦 可 降 低 藥 物 的 使 用 劑 量，可 說 是 一 舉 數 得 的 好 載 體，必 定 可 成 為 未 來 奈 米 藥 物 傳 輸 系 統 上 的 明 日 之 星 。
第 六 章 、 參 考 文 獻
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