第一節 實驗材料與儀器
(一) 藥品
1. 斑蝥及其化合物 (Beijing Fourth Pharmaceutical Work, China) (1) 斑蝥酸鈉 Na CTD (disodium cantharidate)，M.W.=258.16。
(2) 去 氫 去 甲 基 斑 蝥 酸 鈉 Na DHNCTD (disodium dehydronorcantharidate)，M.W.=256.16。
(3) 去甲基斑蝥素 NCTD (norcantharidin)，M.W.=168.15 。
(4) 去 氫 去 甲 基 斑 蝥 素 DHNCTD (dehydronorcantharidin) ， M.W.=166.13。
2. 購自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) 的試劑
Absoluted ethanol 、 Agarose 、 BamHI 、 Denhardt’s reagent 、 Dideoxycytidine (DDC) 、 Dimethylsulfoxide (DMSO) 、 Ethidium bromide (EtBr) 、Formamide、Glucose、LB broth、Lysozyme、Propidium iodide (PI) 、Proteinase K、Ribonuclease A (RNase) 、 Tris-HCl、
Triton-X100、0.4% Trypan blue solution、Wright-Giemsa stain solution 3. 購自 Gibco Laboratories (Grand Island, NY) 的試劑
Antibiotics (penicillin, streptomycin) 、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 、Fetal bovine serum (FBS) 、Glacial acetic acid、
L-glutamine、Non-essential amino acid 4. 購自德國默克公司 Merck Co. 的試劑
Chloroform 、Disodium ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) 、 Ethanol、Polyethylene glycol (PEG) 、Potassium acetate 、Sodium chloride (NaCl) 、Sodium dodecyl sulfate (SDS)
5. 購自日本和光純藥工業公司 Wako Pure Chemical Industries, LTD.
的試劑
Sodium citrate dihydrate、Sodium hydroxide (NaOH)
6. 購自保健科技股份有限公司 General Biologicals Corp. 的試劑 Surase B-96 (HBsAg EIA Kit; B 型肝炎表面抗原試劑)
(二) 儀器
流式細胞分析儀【FACSCaliburTM System (Becton Dickinson)】
細胞抹片機 【Cytospin 3 (Shandon Inc.)】
水浴槽 【ZC-4000（Kansin Instruments Co., LTD）】 電泳槽 【Mupid®-2 (Cosmo Bio Co., LTD)】
短波長紫外線燈【SpectroLine® Model TC-312A UV transilluminator】
拍立得照相機 【Camera（Kodak Co., LTD）】
垂直式無菌操作檯 【Laminar Flow (Tang Ocean Co., LTD)】
倒立式光學顯微鏡【Nikon Ellipse TE300 (Nikon Co., Japan)】
高速離心機【Hettich EBA 12R (Hettich Co., Japan)】
細胞培養箱 【Revco 3000TVBA】
細菌培養箱 【Orbital Shaker Incubator LM-570R】
(三) 細胞株 (cell lines)
2.2.15 細胞株：由台大醫學院董馨蓮老師提供
以包含 B 型肝炎病毒基因組 (HBV genome)的質體轉染 HepG2細胞 (人類肝腫瘤細胞株；Human hepatoblastoma cell line)，經過 G418 selection，選擇出具有分泌 HBsAg particle，nucleocapsid 和 virion 的 細胞株 (Sells et al., 1987 and 1988)。
PLC/PRF/5 細胞株：由中國醫藥學院醫學系病理科提供
人 類 肝 腫 瘤 細 胞 株 (Human hepatoblastoma cell line) ， 具 有 mycoplasma 污染，以及分泌 B 型肝炎表面抗原 (HBsAg)的能力。
第二節 斑蝥類化合物的配製
配製斑蝥類化合物 (cantharidin analogues)：
斑蝥酸鈉 Na CTD， 以及去氫去甲基斑蝥酸鈉 Na DHNCTD 溶 於 水 中 ； 而 去 甲 基 斑 蝥 素 NCTD， 以 及 去 氫 去 甲 基 斑 蝥 素 DHNCTD 溶於 DMSO (dimethylsulfoxide)中；配置濃度為 1.25、
0.625、0.312、0.156、0.078 mM 五個序列稀釋濃度。(Tsauer et al.,
在培養液中加入 2, 3- dideoxycytidine (DDC) 終濃度 50µM，
可完全抑制 HBV 釋放，當作正控制組 (positive control)；而負控 制組 (negative control)即不在培養液中加入任何藥物。
第三節 2.2.15 肝癌細胞的培養
2.2.15 肝癌細胞培養：
2.2.15 細胞株 (HepG2 were transferred with a plasmid contain HBV DNA)，培養在每個 25 cm2 flask 中，含有 1X105個細胞及 5ml DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培養，DMEM 中含 10% fetal bovine serum/ 1% non-essential amino acid/ 1% glutamine/
1% pencillin-streptomycin 等成分，將它們置於 37℃，5% CO2的培 養箱中培養。隔天，分別加入 50µl 不同濃度的藥物，至終濃度為 12.5、6.25、3.12、1.56、0.78µM，每隔三天更換一次細胞培養液，
並添加藥物，細胞暴露於藥物中共計 12 天。(Korba and Milman, 1991; Doong et al., 1991)
第四節 斑蝥類化合物對 2.2.15 細胞毒殺性的影響
藥物對細胞的毒殺性 (Cytotoxicity)：
將細胞培養於 10% FBS (fetal bovin serum)的 DMEM 培養液 中，起始細胞密度為 1X105/5ml DMEM，在接種到 25cm2 flask 經
過 16~18 小時後，加入各種濃度 (0.78-12.5µM)的藥物，培養至欲 觀察的時間 (1、3、6、9、12 天)後，取出以 trypsin 處理成單一細 胞懸浮液，以錐藍 (0.4% trypan blue)取定量細胞液來染色，滴在 血球計數盤，200X 顯微鏡下觀察並計算細胞總數。為瞭解藥物對 培養細胞增殖的影響，應用錐蘭排除法 (trypan blue exclusion)來決 定細胞的存活，活細胞不會讓 trypan blue 進入而呈現透明完整的 外觀，而死細胞會讓 trypan blue 進入而呈現淡藍色。
第五節 斑蝥類化合物對 2.2.15 細胞型態的影響
細胞型態的觀察 (Morphology)：
(1) Wright-Giemsa stain
將 1X105/well 細胞接種到 24-well plate 中，培養於含 10% FBS (fetal bovin serum)的 DMEM 培養液，置於 37℃，5% CO2培養箱，
在經過 16~18 小時，加入各種濃度 (0.78-12.5µM)的藥物，再經 3 天培養後取出，移去上層培養液，以 1X PBS (phosphate buffered saline, pH=7.2) (0.14M NaCl/ 0.002M KH2PO4/ 0.012M Na2HPO4/ 0.0027M KCl)清洗二次，加入 100% 絕對酒精浸潤 20 分鐘後，吸 除多餘酒精，待室溫風乾後，存放於-20℃冰箱隔夜。
從冰箱取出 24-well plate 之後，置於室溫下待回溫後，取 200µl
後，再加入等量的去離子水 (pH = 6.8-7.2)，均勻搖晃使其混合，
待 1-3 分鐘取大量去離子水，將染劑輕輕沖洗乾淨，並置於室溫中 晾乾，經由光學顯微鏡以 200X 視野觀察並照相紀錄。
(2) Cytospin
將 1X105細胞接種到 25cm2 flask 中，培養於含 10% FBS 的 DMEM 培養液 5ml，置於 37℃，5% CO2培養箱，在經過 16~18 小時，加入各種濃度的藥物，每隔 3 天更換培養液，並添加藥物，
經 12 天培養後取出，移去上層培養液，以 trypsin 處理成單一細胞 懸浮液，取細胞約 1X104/ 0.5ml 置於細胞抹片裝置中的漏斗內，然 後將整個裝置放入細胞抹片機中，以 300 rpm，離心 5 分鐘，取出 細胞抹片置於 100% 絕對酒精浸潤 20 分鐘後取出，待室溫風乾 後，存放於 -20℃冰箱中隔夜。
從冰箱取出細胞抹片之後，置於室溫下待回復室溫後，取 20µl
的 Wright-Giemsa stain solution 滴在細胞抹片上，經反應 1 分鐘 後，再加入等量的去離子水 (pH = 6.8-7.2)，均勻搖晃使其混合，
待 1-3 分鐘取大量去離子水，將染劑輕輕沖洗乾淨，並置於室溫中 晾乾，經由光學顯微鏡以 400X 視野觀察並照相紀錄。
第六節 斑蝥類化合物對 2.2.15 細胞週期的影響
將 1X105 細胞分別加藥培養 1、3、6、9 天，以便觀察加藥 (0.78-12.5µM)後不同時間對於細胞週期的影響。以 trypsin 處理每 個 25 cm2 flask 中經加藥培養的 2.2.15 細胞，使成單一細胞懸浮 液，收集到離心管中經離心後移去上清液，以 1X PBS 清洗細胞，
離心 1000 g，5 分鐘，吸除上清液，並將底部細胞打散。震盪混合 細胞懸浮液，同時加入 70% 酒精後，靜置 -20℃冰箱中。
從冰箱中取出離心管，離心 1000 g，5 分鐘，移除上清液，打 散底部細胞，以 1X PBS 清洗細胞二次後，盡量吸除上清液，並將 細胞團塊均勻打散。加入 1ml 的 stain solution (終濃度為 1% Triton X-100，0.1mg/ml RNase A，4µg/ml Propidum Iodide)，混合後置於 室 溫 下 避 光 30 分 鐘 ， 在 一 小 時 內 利 用 流 式 細 胞 分 析 儀 FACSCaliburTM System (Becton Dickinson Immunocytometry System)，以 ModFitTM LT 細胞週期分析軟體收集細胞，再應用 CELLQuestTM軟體進行分析。
第七節 斑蝥類化合物對 2.2.15 細胞 DNA 的影響
萃取培養細胞 DNA：
將加藥培養 12 天後的 2.2.15 細胞，以 trypsin 作用形成單一細胞懸浮 液，加 1X PBS 沖洗細胞，打散後離心 1000 g，5 分鐘，重覆二次，
Tris-HCl, pH7.5/ 5mM EDTA/ 150mM NaCl/ 1%SDS)，打散細胞成懸浮 狀 ，加入 proteinase K 至終濃度 100µg/ml，置於 55℃水浴隔夜。小 心取出溶液至 eppendorff，並加入等量體積的 phenol/ chloroform (1:1) (vol/vol)，經均勻搖晃後，離心 10000 g，5 分鐘，待分層將上清液移 至新 eppendorff 中，重覆上述步驟兩次，混合震盪均勻，離心 10000 g，
10 分鐘。小心移取上清液至 eppendorff 中，使用 0.8% agarose gel/ 0.5X TAE system 跑電泳分離 DNA，以 EtBr 染色後，拍立得照相觀察。
(Doong et al., 1991；modified from Blin and Stafford, 1976)
第八節 斑蝥類化合物對 B 型肝炎表面抗原的影響
測試 B 型肝炎表面抗原 (Surase B-96； HBsAg EIA assay)：
將 1X105/ well 的 PLC/ PRF/ 5 細胞接種到 24-well 平盤中，培 養於含 10% FBS 的 DMEM 培養液，置於 37℃，5% CO2培養箱，
在經過 16~18 小時，加入各種濃度 (3.12-50µM)的藥物，再經 3 天 培養後取出，收集上層培養液，經離心 2000 g，10 分鐘，將上清 液移至新 eppendorff 中。各取 50µl 檢體至 96-well 反應盤中，包 括 負 控 制 組 (negative control) ， 以 及 呈 序 列 稀 釋 的 正 控 制 組 (positive control)，再加入 Anti-HBs•Peroxidase Solution 50µl，置 於室溫反應 20± 4 小時後，以稀釋 20X 的 washing solution 清洗反
應盤，加入 OPD Solution 100µl，室溫反應 30 分鐘，再加入 2N H2SO4
100µl 終止反應，在 570nm 波長下測 OD 值。以此套裝試劑所附之 positive control 所測得 OD 值，計算 OD 值與 HBsAg 濃度的線性回 歸方程式，再由所測得的各檢體 OD 值換算出 HBsAg 濃度，作為 定量分析。
(換算公式出自 HBsAg EIA kit 所附之換算公式)
Standard curve： Y= a + bX by linear regression of standard.
Y：Log10 (OD values of standard)
X：Log10 (Values of HBsAg concentration) a：Intercept
b：Slope
各檢體 OD 值換算出 HBsAg 濃度= (10X ng/ ml) X 稀釋倍數