第一節 斑蝥類化合物對 2.2.15 細胞毒殺性的影響
將斑蝥類化合物濃度由高至低序列稀釋，用來篩選較合適的藥物 有效劑量。經不同濃度藥物處理 1、3、6、9 天的 2.2.15 細胞 (人類 肝癌細胞)，以錐藍排除法 (trypan blue exclusion)來決定細胞的存活 量，所計算出的細胞數與添加溶媒 H2O 及 1% DMSO 的控制組作比 較，再除以控制組的細胞數，即為藥物影響細胞的抑制百分比。
在這一系列化合物中，對於 2.2.15 細胞株都具有不同程度的毒殺 性 (表 1)，其中以斑蝥酸鈉 (Na CTD)對於細胞數目的影響最為顯 著，在 12.5µM Na CTD 作用到第三天時，對細胞增殖抑制百分比已 高達 90%以上。其次是去甲基斑蝥素 (NCTD)、去氫去甲基斑蝥素 (DHNCTD)兩種化合物，在濃度 12.5µM 影響下，觀察第 6、9 天的細 胞數，也都有超過 50%以上的細胞毒殺性。相較之下，去氫去甲基斑 蝥酸鈉 (Na DHNCTD)對於細胞的毒殺性較不如其他相關衍生物顯 著，而這些斑蝥類化合物對於 2.2.15 細胞的增殖抑制，大部分都具有 劑量依賴性 (dose-dependent)。
Trypan Blue Exclusion
Table 1. Quantitation of viable 2.2.15 cells. 1X105 cells were seeded in 25cm2 flask for each flask with or without various concentrations of cantharidin analogues. The total number of viable cells in each of these flasks was quantitated by counting cells which exclude trypan blue.
第二節 斑蝥類化合物對 2.2.15 細胞型態的影響
將細胞接種到 24-well plate，待 16-18 小時細胞融合後，加入不 同濃度的斑蝥類化合物再培養 3 天，用來觀察藥物在短時間內對於 2.2.15 細胞型態上的變異情形。藉由光學顯微鏡 200X 視野觀察
Wright– Giemsa stain 染色後的細胞 (圖 3)，與控制組比較可發現，在 高濃度的斑蝥類化合物作用下，固定視野內的細胞數目明顯減少，其 中以 Na CTD 最為顯著，有出現細胞質萎縮、細胞核濃染，趨向死亡 的細胞增加，有別於控制組的平整細胞外膜、紡綞狀融合重疊的細胞 形態。在 12.5µM NCTD 和 DHNCTD 二種化合物作用下，也出現細 胞退化、變形。而 Na DHNCTD 對細胞的變化雖然並不顯著，還是可 見到細胞膨脹、細胞核偏側的情形。
為了進一步瞭解斑蝥類化合物在 2.2.15 細胞培養長時間後，受到 藥物影響的情形，將細胞接種於 25cm2 flask 中，經藥物影響 12 天後，
以 trypsin 處理細胞呈單一懸浮液，藉細胞抹片機 (cytospin)固定細胞 在玻片上，利用 Wright– Giemsa 染劑加以染色，在光學顯微鏡 400X 視野下觀察 (圖 4)。
用 12.5µM Na CTD 處理 12 天後的 2.2.15 細胞，明顯發現有形態 改變、空泡化的情形，細胞膜邊緣破碎、細胞核偏向單側，部分細胞 已趨向分解、死亡。在更高濃度作用下，幾乎見不到存活細胞。
第三節 斑蝥類化合物對 2.2.15 細胞週期的影響
近年來，應用流式細胞分析儀 (flow cytometry)來分析細胞在不 同階段的生化特性及生理功能狀態，藉由加入不同種類的藥物，探索 藥物在細胞週期中所影響的階段。
先將細胞製成單一懸浮液後與螢光性染料反應，在本實驗選用螢 光性染料為 Propidium Iodide (PI)，PI 是一種嵌入性螢光染料，能嵌 入雙股 DNA 及 RNA 的鹼基對中，再將此懸浮液送入流式細胞分析 儀 FACSCaliburTM System (Becton Dickinson Immunocytometry System)，此時細胞經液相懸浮系統分離，幾乎以單一細胞狀態通過 管路，藉由光學系統雷射光照射後激發 PI，以 ModFitTM LT 細胞週期 分析軟體收集細胞，再應用 CELLQuestTM軟體進行定量分析。
選用斑蝥類化合物處理 2.2.15 細胞，觀察 1、3、6、9 中細胞週 期的變化。細胞培養至第 9 天，12.5µM 和 6.25µM Na CTD 因為藥物 毒殺性過高，細胞幾乎都已趨向死亡，而無法進行細胞週期的分析，
但觀察高濃度的 Na CTD 作用在培養第 1 天會對 S 期有 72.5%的抑 制，第 3 天對 S 期有 39.4%的抑制 (表 2-1)。在 12.5µM NCTD 在加 藥後第 3 天對 S 期有 64.8%的抑制 (表 2-3)。而 DHNCTD 會隨濃度 升高出現 G0-G1期上升、S 期下降的情形，在 DHNCTD 高濃度 12.5µM 作用下第 6 天對 G -G 期有 14.7%的促進，以及對 S 期有 42.8%的抑
制 (表 2-4)。至於 Na DHNCTD 的藥物作用，在 2.2.15 細胞中細胞週 期的影響並不顯著 (表 2-2)。
Percent of cells number (%) (1)Na CTD
Treatment time
(day) G0-G1 S G2-M
：significantly death of 2.2.15 cells were not assayed by FACS.
Table 2-1. Cell cycle phase distribution of 2.2.15 cells treated with cantharidin analogues. 2.2.15 cells were treated with or without various concentration of (1)Na CTD and harvest at 1, 3, 6days. The distributions of cell cycle phase were determined by FACS analysis, as described in method. Values are mean ±SD, N≥3.
* significantly different between control and treatment group.
(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.001，Student’s t-test)
Percent of cells number (%) (2)NaDHNCTD
Treatment time
(day) G0-G1 S G2-M
Table 2-2. Cell cycle phase distribution of 2.2.15 cells treated with cantharidin analogues. 2.2.15 cells were treated with or without various concentration of (2)Na DHNCTD and harvest at 1, 3, 6, 9days. The distributions of cell cycle phase were determined by FACS analysis, as described in method. Values are mean ±SD, N≥3.
* significantly different between control and treatment group.
(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.001，Student’s t-test)
Percent of cells number (%) (3)NCTD
Treatment time
(day) G0-G1 S G2-M
Table 2-3. Cell cycle phase distribution of 2.2.15 cells treated with cantharidin analogues. 2.2.15 cells were treated with or without various concentration of (3)NCTD and harvest at 1, 3, 6, 9days. The distributions of cell cycle phase were determined by FACS analysis, as described in method. Values are mean ±SD, N≥3.
* significantly different between control and treatment group.
(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.001，Student’s t-test)
Percent of cells number (%) (4)DHNCTD
Treatment time
(day) G0-G1 S G2-M
Table 2-4. Cell cycle phase distribution of 2.2.15 cells treated with cantharidin analogues. 2.2.15 cells were treated with or without various concentration of (4)DHNCTD and harvest at 1, 3, 6, 9days. The distributions of cell cycle phase were determined by FACS analysis, as described in method. Values are mean ±SD, N≥3.
* significantly different between control and treatment group.
(*p<0.05, **p<0.005, ***p<0.001，Student’s t-test)
第四節 斑蝥類化合物對 2.2.15 細胞 DNA 的影響
2.2.15 細胞經培養於不同濃度的斑蝥類化合物中，在第十二天收 集細胞，抽取細胞內染色體去氧核糖核酸 (chromosome DNA)，藉由 電泳分離 DNA 片段，經 ethidium bromide (EtBr)染色後，於 UV 燈下 觀察藥物對於細胞 chromosome DNA 的影響。
與不加任何藥物的控制組作對照，斑蝥類化合物會隨濃度增加出 現 DNA 損傷 (damage)，有劑量依賴性 (dose-dependent)。在 50µM Na CTD 和 NCTD 高濃度影響下，幾乎所有細胞在第十二天都已呈現死 亡狀態，細胞裂解、DNA 片段不易清楚觀察，而 DHNCTD 作用會使 chromosome DNA 看到明顯破壞，DNA 碎片隨濃度上升而增多。在 Na DHNCTD 亦有 DNA 損傷情形出現，相較於其他斑蝥類化合物影 響較不明顯。由移動的 DNA 碎片多寡及 DNA 損傷情形加深，可以 確定斑蝥類化合物會破壞人類肝癌細胞 2.2.15 細胞的染色體 DNA。
第五節 斑蝥類化合物對 B 型肝炎表面抗原的影響
為測試 B 型肝炎表面抗原 (HBsAg)，將細胞培養於 24-well plate 加藥 3 天後，收集上層培養液，以 B 型肝炎表面抗原 EIA 試劑 (Surase B-96)，初步篩選斑蝥類化合物對於 HBsAg 的影響。
在多次選用加藥培養的 2.2.15 細胞來測試 B 型肝炎表面抗原，發 現 2.2.15 細胞可能因為釋出病毒量不足，不適用於 EIA 試劑，故改用 PLC/PRF/5 肝癌細胞株來測試，在相同細胞數的培養液中，PLC/PRF/5 細胞的 B 型肝炎表面抗原表現量較高，適用於本實驗。
初步篩選斑蝥類化合物抑制 B 型肝炎表面抗原的結果發現，Na CTD、NCTD、DHNCTD 三種藥物有較明顯效果。經加藥後的培養液 HBsAg 濃度會受到藥物影響，具有劑量依賴性，而 Na DHNCTD 對 於 HBsAg 的作用並不顯著 (表 3)。在測試 HBsAg 表現量減少的同 時，還必須考慮藥物對於 PLC/PRF/5 細胞株的毒殺性，實驗結果顯示 Na CTD 對細胞毒殺性最強 (表 3)。
為比較藥物間對於治療 HBV 的有效程度，我們依藥物濃度、細 胞數目、病毒濃度的相關性，使用線性回歸方程式計算出 CC50 (影響 50%細胞數目的藥物濃度)及 IC50 (影響 50% HBsAg 分泌量的藥物濃 度)，來評估斑蝥類化合物對於 HBV 病毒抑制程度的差異性 (表 4) 。
ELISA 1%DMSO 1.26±0.17 0.314±0.003 2X101.90 50µM DDC 0.90±0.17 0.278±0.004 2X101.80 3.12µM 1.38±0.08 0.414±0.013 2X102.13 6.25µM 1.32±0.08 0.339±0.025 2X101.96 12.5µM 0.57±0.21 0.331±0.008 2X101.94 25.0µM 0.45±0.13 0.282±0.001 2X101.81 50.0µM 0.12±0.08 0.244±0.001 2X101.69 (2)Na DHNCTD Cell number OD value HBsAg conc.
Control 1.41±0.13 0.446±0.027 2X102.19 1%DMSO 1.26±0.17 0.314±0.003 2X101.90 50µM DDC 0.90±0.17 0.278±0.004 2X101.80 3.12µM 1.08±0.25 0.421±0.045 2X102.14 6.25µM 0.96±0.08 0.334±0.006 2X101.95 12.5µM 0.96±0.25 0.331±0.009 2X101.94 25.0µM 0.90±0.08 0.319±0.030 2X101.91 50.0µM 0.96±0.08 0.320±0.011 2X101.91 (3)NCTD Cell number OD value HBsAg conc.
Control 1.41±0.13 0.446±0.027 2X102.19 1%DMSO 1.26±0.17 0.314±0.003 2X101.90 50µM DDC 0.90±0.17 0.278±0.004 2X101.80 3.12µM 1.38±0.08 0.291±0.001 2X101.83 6.25µM 1.32±0.08 0.262±0.003 2X101.75 12.5µM 1.32±0.08 0.252±0.001 2X101.71 25.0µM 1.32±0.01 0.252±0.002 2X101.71 50.0µM 1.20±0.17 0.243±0.001 2X101.68 (4)DHNCTD Cell number OD value HBsAg conc.
Control 1.41±0.13 0.446±0.027 2X102.19 1%DMSO 1.26±0.17 0.314±0.003 2X101.90 50µM DDC 0.90±0.17 0.278±0.004 2X101.80 3.12µM 1.35±0.04 0.345±0.006 2X101.98 6.25µM 1.29±0.21 0.288±0.003 2X101.83 12.5µM 1.23±0.13 0.291±0.001 2X101.75 25.0µM 1.20±0.25 0.265±0.002 2X101.84 50.0µM 1.12±0.25 0.294±0.009 2X101.83
Table 3. Effect of HBsAg section on PLC/ PRF/ 5 cells treated with or without various concentrations of cantharidin analogues for 3 days. The total number of viable cells was quantitated by trypan blue exclusion.
Measure the OD value with a spectrophotometer at the wavelength of 570nm. Calculate the HBsAg concentration of each specimen by linear regression of standard. Values are mean ±SD, N=2.
在四種斑蝥類化合物中，其 SI 值由高至低分別為 NCTD＞ Na DHNCTD＞ DHNCTD＞ Na CTD，比較四種化合物以 NCTD 較具 B 型肝炎表面抗原抑制作用，且對於 PLC/ PRF/ 5 細胞毒殺性較小，可 用來進一步考慮藥物對抗病毒的療效。
Compounds CC
50( µM) IC
50( µM) SI (1)Na CTD 21.72 52.11 0.42 (2)Na DHNCTD 200.41 112.81 1.78 (3)NCTD 203.71 70.76 2.88 (4)DHNCTD 186.78 137.38 1.36
Table 4. Comparative potencies of cantharidin analogues as monitored by HBsAg section, cytotoxicity. Effect of HBsAg section on PLC/ PRF/ 5 cells treated with cantharidin analogues for 3days. Calculate the CC50 and IC50 values of each specimen by linear regression of standard.
SI, selective index (CC50/ IC50)
CC50 is the concentration of cantharidin analogues that showed 50%
cellular cytotoxicity in PLC/ PRF/ 5 cells.
IC50 is the concentration of cantharidin analogues that exerted 50%
reduction on HBsAg secretion in PLC/ PRF/ 5cells.