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第二章實驗材料方法
1.實驗動物
本實驗使用 long evans 品系的大鼠（訂購於國家動物中心），年紀為兩個 月大的公鼠，體重約 275–300g。飼養於 12:12 小時晝夜循環（上午七點開始到 晚上七點為白晝），溫度維持於 23℃，濕度維持於 60％，給予充足的飼料和水。
實驗人員對動物福祉的規範均遵守行政院農委會（1998）動物保護法相關規定。
2.腎上腺摘除手術（Adrenalectomy）
等待老鼠三個月大後進行腎上腺摘除手術，手術前先測量體重，手術後每一 個禮拜測量體重直到第十週，以最後一次測量體重扣除術前體重之增加重量作為 初步判斷 ADX 是否成功。
手術前 30 分鐘打開高溫玻璃珠滅菌器預熱，到手術開始時將手術器具放入 高溫玻璃珠內 10 秒後取出達到滅菌效果。準備吸入性全身麻醉藥-愛沙氟倫
（Isoflurane,Halocarbon products corporation,USA）置於氣麻機，開啟氧氣 控制閥將氧氣與氣麻藥一同送到壓克力盒（此時給予較高濃度麻藥），當壓克力 盒充滿麻藥時將老鼠放入盒中進行麻醉。待老鼠進入深沈麻醉狀態時，把老鼠從 壓克力盒中取出放置在乾淨的擦手紙上;首先老鼠平躺背部向上開始剃毛（腎上 腺位於脊椎與肋骨的交接處附近，左右各一顆），剃毛完成後清理手術檯面鋪上 保溫滅菌的布將老鼠平躺背部向上，接著轉調節氣體流向的三向閥門，把氣體送 至訂製的動物面罩，面罩戴上老鼠口鼻，此時打開氣體回收桶避免實驗者吸入。
以打耳洞方式作為標記區分不同隻老鼠，從左方腎上腺開始摘除，將老鼠朝左側 躺手術處朝上，為避免在手術過程中受感染，我們會換上手術專用滅菌手套。當 手術處已乾淨後使用大剪開皮，再將肌肉打開，當腎上腺成功移除後，使用可吸 收縫線（UNIK Surgical Sutures MFG.CO,Taiwan）縫合。右邊摘取如同左邊步
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驟。手術後，將老鼠移至乾淨無墊料的籠子恢復，替老鼠蓋上乾淨紗布避免失溫。
當老鼠甦醒後，為了讓 ADX 的老鼠保持離子濃度的平衡我們會給予 0.9%的 Sodium hydrochloride(Sigma,USA)作為飲用水。手術後隔天將老鼠放回有墊料的籠子以 及給予充足的飼料和 Saline。
ADX 的對照組-Sham 組手術步驟除了未將腎上腺摘除外，其餘與 ADX 組一樣，
而術後給予充足的飼料和水。
3.在手術前一天準備埋管的材料
本實驗使用 2001 型 mini-osmotic pump(連續打入七天，流速 1.0 µl/hr，
可放入 200 µl 液體，Alzet,CA)，搭配 Brain Infusion Kit2 (Alzet,CA)使用。
因為直接打入腦內，所以物質都溶在自行配製的人工腦脊髓液（Artificial cerebrospinal fluid-aCSF 配方：NaCl-8.66g、KCl-0.224g、CaCl2-2HOH-0.206g、
MgCl2-6HOH-0.163g、Na2HPO4、NaH2PO4-0.0235g），會事先使用细胞做 aCSF 滲 透壓測試，每一次取 aCSF 時會過濾，確保此 aCSF 為無菌。
整個 priming 的動作都在無菌操作檯（Laminar flow）操作，操作前開啟紫 外燈照射 30 分鐘滅菌並開啟抽氣裝置，之後以 70% 酒精擦拭無菌操作檯面，換 上滅菌手套確保整個 priming 過程不受到污染。首先把 Brain Infusion Kit 2 的透明管和含不鏽鋼管的帽子結合，使用 pump 專用針頭吸取液體，將液體緩緩 打入 pump 與透明管中，最後取 pump 與透明管連接的帽子將兩物結合，完成液體 置入 pump 的動作。將 pump 泡在 aCSF 中放置 4℃冰箱，priming 的動作即完成，
埋管前半小時取出回溫。
本實驗打入的液體內容物分兩種：
（1） SHH+Brdu+aCSF+0.1%BSA：將 Brdu 溶在 aCSF 中用來標的新生成的細胞，
SHH 溶在 aCSF 中用來刺激神經細胞增生，其中 0.1%BSA 是要穩定 SHH protein。
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（2） Brdu+aCSF+0.1%BSA：將 BrdU 溶在 aCSF 中用來標的新生成的細胞，其中 0.1%BSA 是要與第一組一樣，都加 BSA 避免有不必要的差異。
4.立體定位手術（Stereotaxic surgery）與埋管
為了讓老鼠先適應埋管後所待的環境，當老鼠做完 ADX 手術後八週會將老鼠 移至埋管後將待的環境，待 ADX 手術後十週開始進行埋管手術。
手術前 30 分鐘打開高溫玻璃珠滅菌器預熱，到手術開始時將手術器具放入 高溫玻璃珠內 10 秒後取出達到滅菌效果。準備吸入性全身麻醉藥-愛沙氟倫
（Isoflurane,Halocarbon products corporation,USA）置於氣麻機，開啟氧氣 控制閥將氧氣與氣麻藥一同送到壓克力盒，當壓克力盒充滿麻藥時將老鼠放入盒 中進行麻醉。待老鼠進入深沈麻醉狀態時，把老鼠從壓克力盒中取出放置在乾淨 的擦手紙上;用手抬起老鼠頭部開始剃頭部毛（剃眼中到耳中的區域），剃毛完成 後清理手術檯面。
前置動作完成後，接著轉調節氣體流向的三向閥門，此時氣體從門牙固定桿
（Tooth bar）上的面罩送出，此時打開氣體回收桶避免實驗者吸入。當氣體轉 換到面罩後，將老鼠門牙固定於門牙固定桿（標高為-2.4mm），頭部固定於立體 定位儀(Stereotaxic instrument)上，此時要確認老鼠頭部前後左右是否有平衡。
為避免在手術過程中受感染，我們會換上手術專用滅菌手套，接著將手術處做清 潔。當手術處已乾淨後以手術刀劃開頭皮，以止血鉗將肌膜與頭皮固定於四方位 讓頭骨露出；將頭骨清理乾淨後明顯觀察到前囪（Bregam）位置，即可進行座標 定位。依據大鼠腦部定位圖譜，以前囪位置為原點，定出後方 0.9mm、左側 1.8mm、
深度 4mm 為左側腦室的位置，利用電鑽鑽孔。接下來將準備好的 pump 取出，將 管子埋入固定。為了加強埋管的穩固，在頭骨上會鎖上一根螺絲，再以牙科粉將 帽子與螺絲連接固定於頭骨上。當 pump 成功埋入後，使用可吸收縫線（UNIK Surgical Sutures MFG.CO,Taiwan）將頭皮縫合。手術後，將老鼠移至乾淨無墊
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料的籠子恢復，替老鼠蓋上乾淨紗布避免失溫。手術後隔天將老鼠放入豐富環境 的老鼠公寓或者有墊料的籠子以及給予充足的飼料和 saline 或水;老鼠直到犧 牲後才將整個 pump 裝置拆除。
5.埋管後飼養環境
（1） 豐富環境（Environmental enrichment）：
a. 平行式鼠公寓：自己裁 60 公分 x 90 公分 x160 公分木板組合成的老鼠 公寓，內面使用 PP 板黏貼避免老鼠啃咬，上方使用網子覆蓋。
b. 直立式鼠公寓：訂做 60 公分 x 90 公分 x180 公分不鏽鋼的老鼠公寓。
每日更新老鼠公寓內的物品（紙箱、木板、紙袋、木棒、鐵盒、鐵棒、管 子……等），每隔三天兩公寓的老鼠會互換環境，增加環境上的刺激。
（2） 一般鼠籠環境（Cage）：
平時飼養老鼠的透明壓克力籠子。
6.給予 Corticosterone（CORT）
當腎上腺摘除後的老鼠不會產生 CORT，會影響海馬迴的神經細胞，使其細 胞大量死亡。本實驗我們觀察海馬迴腦區所新生成的神經細胞，所以必須恢復海 馬迴腦區原本有 CORT 的環境，我們採用口服方式每天下午四點給予 CORT。而 Sham 組則給予 300ul DMSO 加到 25ml 純大豆油，每天每一隻 Sham 老鼠給予的量為 0.25ml 加至四分之一大的餅乾（半徑約 2.5 公分圓餅）。
在埋管前一週開始訓練老鼠吃餅乾，並且給予 CORT 或 DMSO，先讓海馬迴恢 復有 CORT 的環境（避免埋管液體打入開始作用而無 CORT 環境下影響實驗）。
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7.行為測試-物品與情境聯合試驗（Object-context association）
當埋管後將老鼠放入老鼠公寓或一般飼養籠子，經過十週飼養後進行行為實 驗（其中在第八週先 Handle 老鼠直到做行為實驗，讓老鼠適應被抓取感覺）。
實驗分成兩個房間進行：A 房間為亮白燈，使用 60 公分 x 60 公分 x 60 公 分的正方型白色行為箱;B 房間為 12 瓦（W）黃燈，使用高 60 公分的半徑 30 公 分黑色圓柱箱行為箱。箱子底部放老鼠墊料，每一次老鼠進入行為箱後產生的氣 味以 20% 酒精去除（清理行為箱與測試物品），若有排泄物產生也立即清除，以 免影響行為實驗準確度。
物品與情境聯合試驗行為測試分三階段：適應階段（habituation session）， 訓練階段（training session），記憶階段（retention session）。行為實驗於 早上十一點開始，總共分成四天進行：（1）第一天與第二天為適應階段，將老鼠 放進有乾淨墊料的籠子，運送至行為房，第一天進入其中一個行為箱 10 分鐘，
第二天換至另一個行為箱適應 10 分鐘，確定老鼠都有探索過不同環境與行為箱。
（2）第三天也是適應階段（讓老鼠習慣第四天的行為流程），以 A-B 或 B-A 的 交替方式讓老鼠在一天內進入兩個行為箱，每次進入時間為 5 分鐘，中間間隔也 要清理行為箱，此時老鼠放回籠子在行為房外等待。當結束第二個行為箱的探索 後，將老鼠放回籠子在行為房外等待七分鐘再放回原本的生活環境。（3）第四天 分為訓練階段和記憶階段，老鼠會進入行為箱三次（A-B-A, B-A-B, A-B-B, B-A-A），前兩次為訓練階段。在訓練階段時，A 箱會擺上兩個一樣的 x 物品，B 箱則為兩個一樣的 y 物品，讓老鼠記憶 A 箱與 B 箱的環境對應 xx 和 yy 物品，探 索時間為五分鐘。第三次為記憶階段，老鼠最後要進去的行為箱將其中一個物品 換成另一個不是對應此行為箱的物品（行為箱內物品：xy），所以有一個是原本 環境對應的物品（matched object）和一個非對應的物品（mismatched object），
探索三分鐘。老鼠生性好奇，對於原來不是放在那個箱子的物品會比較有興趣，
而探索時間相對於原本的物品高。當結束行為測試後，將老鼠放回籠子在動物房
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等候，一個半小時後犧牲。
Day1 or
Day2 or
Day3
Day4
8.腦組織的灌流製備與切片
行為實驗後一個半小時進行犧牲灌流，首先對老鼠以腹腔注射過量 chloral hydrate (300-450mg/kg, Sigma,USA)。在老鼠心跳停止前（但失去知覺），將老 鼠移至抽氣櫃流裡臺，以大剪剪開胸腔及橫隔膜，心臟露出後採血（取 3c.c，
馬上以 10000rpm 離心十五分鐘，將血清取出冰至-80℃冰箱，之後以 ELISA 測血 清中 CORT 濃度）。以止血鉗夾住下循環的動脈（只灌頸部以上區域），取 18 號針 頭插入左心室，以止血鉗夾將針頭與心臟夾緊，使用泵浦機（Major science, USA）
進行灌流。取 1X phosphate buffer saline (PBS) 灌入左心室將血液清除（在 右心房開小洞讓液體流出）約 300C.C，待確定流出的液體為透明後再灌入固定 液（4% Paraformaldehyde,PFA,Sigma,USA）約 200C.C，待確定頸部以上已僵硬，
即可將腦取出浸泡在固定液中 24 小時，再浸泡於 30% sucrose（J.T.Baker,USA）
中脫水，其中 sucrose 配於 PBS 中，內含 0.02% sodium azide（Amresco,USA），
直到腦沉在容器底部即可進行冷凍切片。
直到腦沉在容器底部即可進行冷凍切片。