第三章、 結果
4. 新生成神經細胞參與學習記憶行為
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4.新生成神經細胞參與學習記憶行為
（1）新生成細胞比較
接下來我們先比較新生成細胞數量上在六組老鼠中是否有差異，當埋管時每 一隻大鼠都給予 BrdU，連續標的新生成細胞七天，經過一般鼠籠環境/豐富環境 十週後犧牲，以大腦切片觀察在給予 Shh 的第一週所新生成的細胞數有多少在十 週後存活下來。圖五為齒狀迴所計數到 BrdU 的數量，我們觀察到 E-ADX-Shh（n=10）
組染到 BrdU 的數量與 E-Sham(n=8)組並沒有差別（E-ADX-Shh＝32854.96±
1673.66、E-Sham＝34653.69±2163.21，p= 0.50，one-way ANOVA），相反地 E-ADX(n=8)組 BrdU 的數量明顯低於 E-ADX-Shh 組和 E-Sham（E-ADX=14798.91±
1475.21，與 E-ADX+Shh 相比 p＜0.001，與 E-Sham 相比 p＜0.001，one-way ANOVA），代表經過 Shh 和豐富環境刺激後的 ADX 大鼠會有大量的細胞增生而且生 存下來。一般鼠籠環境下的組別發現 C-ADX-Shh(n=6)組與 C-ADX(n=7)組觀察到 BrdU 的 數 量 都 比 C-Sham(n=4) 組 還 低 （ C-ADX-Shh=12671.88 ± 855.96 、 C-ADX=13715.56±1469.83、C-Sham＝22030.08±1890.89，C-ADX-Shh 與 C-Sham 相比 p=0.01，C-ADX 與 C-Sham 相比 p= 0.02，one-way ANOVA），而 C-Sham 組 所觀察到 BrdU 的數量比 E-Sham 組明顯少 22.27%(C-Sham＝22030.08±1890.89、
E-Sham＝34653.69±2163.21，p= 0.009，one-way ANOVA)；在都有加 Shh 情況下，
E-ADX-Shh 組 相 較 於 C-ADX-Shh 組 所 觀 察 到 BrdU 的 數 量 明 顯 高 出 44.3%( E-ADX-Shh＝32854.96±1673.66、C-ADX-Shh＝12671.88±855.96，p＜
0.001，one-way ANOVA)，代表豐富環境刺激是讓這些新生成細胞存活的關鍵，
即使有給予 Shh 而沒有豐富環境還是無法讓新生成細胞存活下來。
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圖五、BrdU 計數數目表示新生成細胞數量比較圖。曲線圖以 mean ± SEM 表示。 ， p＜0.05。
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000
C-SHAM C-ADX C-ADX-SHH E-SHAM E-ADX E-ADX-SHH
No. of BrdU(+) cells
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（2）新生成神經細胞參與行為
為了驗證前面的推論，接下來我們要觀察是否新生成的神經細胞是否參與在 海馬迴之學習記憶上。我們觀察這些新生成神經細胞是否被海馬迴之學習記憶行 為實驗活化，以立即表現基因 Arc 作為指標，判斷這些新生成神經細胞是否參與 在其中。在過去研究中發現 Arc 在刺激後會快速表現，在不同刺激上 Arc 表現的 時間點會有所不同，但這些文獻中約刺激後一小時以後可以看到 Arc 蛋白質表現 比在沒刺激下表現量達顯著差異(Alberi et al., 2011; Messaoudi et al., 2007;
Plath et al., 2006)，所以我們觀察行為測試後三十分鐘（n=4）、一個小時（n=4）、 一個半小時（n=4）Arc 蛋白表現量。從圖六結果上可以觀察到 Arc 在三十分鐘 和一個小時表現量是一樣的，而一個半小時後 Arc 表現量可以看得出比前面兩個 時間點高（30min=2631159.06±53298.72、1hr=2665766.31±82792.92、1.5hr＝
3807566.06±74209.63，30min 與 1hr 相比 p=0.70，30min 與 1.5hr 相比 p＜0.001，
1hr 與 1.5hr 相比 p＜0.001，one-way ANOVA），最後我們採用一個半小時後的 時間點作為觀察。我們也比較在行為前一天、第四天行為測試前、第四天行為測 試後一個半小時後犧牲以上三個不同的時間點觀察 Arc 表現差異。從圖七結果顯 示，在正式行為測試前無論是否已經做過行為測試 Arc 表現量並無差異，而在第 四天行為測試一個半小時後 Arc 才有顯著表現（行為前一天=1715780.58±
78244.52、第四天行為測試前＝1734018.79±47590.24、第四天行為測試後一個 半小時後＝3593645.17±62546.31，行為前一天與第四天行為測試前相比 p=
0.81，行為前一天與第四天行為測試後一個半小時後相比 p＜0.001，第四天行為 測試前與第四天行為測試後一個半小時後相比 p＜0.001，one-way ANOVA），代表 大部分 Arc 是經過學習記憶的行為測試後受刺激才表現出來。圖八為齒狀迴所計 數到 BrdU 和 Arc 同時表現之數量，代表在三個月前新生成並參與學習記憶活動 之神經細胞，結果如同 BrdU 染色一樣 E-ADX-Shh（n=10）組與 E-Sham(n=8)組都 比 E-ADX(n=8)組共同染到 BrdU 和 Arc 數量多（E-ADX-Shh=26052.22±1462.19、
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E-Sham＝26618.30±2016.36、E-ADX＝10987.73±1441.78，E-ADX 與 E-ADX-Shh 相比 p＜0.001，E-ADX 與 E-Sham p＜0.001，one-way ANOVA），而 E-ADX-Shh 與 E-Sham 之間沒差異(p=0.80，one-way ANOVA)代表著經過 Shh 和豐富環境刺激後 的 ADX 大鼠所生成的神經細胞在學習記憶行為測試後活化，代表著這些新神經細 胞大量參與在學習記憶上，推估因為這些新神經細胞大量參與在學習記憶上，所 以恢復了海馬迴之學習記憶功能。一般鼠籠環境下的組別也是如同 BrdU 染色一 樣，C-ADX-Shh(n=6)組與 C-ADX(n=7)組觀察到共同染到 BrdU 和 Arc 數量都比 C-Sham(n=4)組還低（C-ADX-Shh＝9194.71±529.76、C-ADX＝11863.72±2217.45、
C-Sham＝16980.89±1881.16，C-ADX-Shh 與 C-Sham 相比 p=0.01，C-ADX 與 C-Sham 相比 p= 0.02，one-way ANOVA）。在都有加 Shh 情況下，E-ADX-Shh 組相較於 C-ADX-Shh 組所觀察到 BrdU 和 Arc 共同染到的數量明顯高出 47.8%( E-ADX-Shh
＝26052.22±1462.19、C-ADX-Shh＝9194.71±529.76，p＜0.001，one-way ANOVA)，
代表當沒有豐富環境刺激讓這些新生成細胞存活，即使有給予 Shh 也無法讓新生 成細胞存活下來，而參與行為的新神經細胞相對少很多。
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30min 1hr 1.5hr
No. of Arc(+) cells
0 1.5hr after test
No. of Arc(+) cells
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圖八、Arc 與 BrdU 同時被計數的數目表示新生成細胞有活化數量比較圖。曲線 圖以 mean ± SEM 表示。 ，p＜0.05，one-way ANOVA。
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000
C-SHAM C-ADX C-ADX-SHH E-SHAM E-ADX E-ADX-SHH
No. of BrdU(+) Arc(+) cells
*
* *
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（3）成熟之新生成神經細胞大量活化
當我們發現大部分的新生成神經細胞參與在學習記憶中，接下來要探討這些 細 胞 是 否 在 成 熟 階 段 被 活 化 。 我 們 利 用 NeuN （ Neuronal Nuclei ） 和 DCX
（Doublecortin ）分別代表著成熟和未成熟神經細胞，觀察同時與 BrdU（新生 成細胞）和 Arc（有活化的細胞）染到的狀況。
a.成熟之新生成神經細胞
從圖九觀察各組的染色趨勢都與先前染色情形類似，E-ADX-Shh（n=10）組 與 E-Sham(n=8)組都比 E-ADX(n=8)組共同染到 NeuN、Arc、BrdU 三個染劑細胞數 量多（E-ADX-Shh=22245.92±1261.81、E-Sham＝22499.18±2268.64、E-ADX＝
9550.64±1270.26，E-ADX 與 E-ADX-Shh 相比 p＜0.001，E-ADX 與 E-Sham p＜0.001，
one-way ANOVA），而 E-ADX-Shh 和 E-Sham 之間是沒有差異（p=0.90，one-way ANOVA），代表著經過經過 Shh 和豐富環境刺激後的 ADX 大鼠所生成的神經細胞。
一般鼠籠環境下 C-ADX-Shh(n=6)組與 C-ADX(n=7)組觀察到共同染到 NeuN、Arc、
BrdU 細胞數量比 C-Sham(n=4)組還低（C-ADX-Shh＝7161.60±642.95、C-ADX＝
8859.52±1830.52、C-Sham＝14722.54±2023.05，C-ADX-Shh 與 C-Sham 相比 p=0.01，
C-ADX 與 C-Sham 相比 p= 0.03，one-way ANOVA）。在一般鼠籠組，新生成成熟 神經細胞參與活動的個數，在 ADX 組並未因 Shh 處理而增加，但是給了 Shh 並加 上生活在豐富環境中，則經過 ADX 手術的老鼠，其個數回到與 Sham 相同的水平。
從圖十中觀察每一組在染到 BrdU 的細胞中共同染到 NeuN 與 Arc 的數量佔的比例 有六成三（E-ADX-Shh 組：67.7%,E-Sham 組:64.6%,E-ADX 組:63.7%,C-ADX-Shh 組:57.0%,C-ADX 組:60.1%,C-Sham 組：66.3%），代表此區域新生成的細胞約有六 成三的比例，在成熟階段下參與在海馬迴學習記憶功能。從圖十一觀察沒活化之 成熟新生成神經細胞，可以發現每一組細胞數量相較於圖九少很多，所以大部分 成熟新生成神經細胞是有參與活動。而在圖十二有被活化的新生成神經細胞中為
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成熟階段的細胞佔有八成四比例（E-ADX-Shh 組：85.6%,E-Sham 組:83.7%,E-ADX 組:83.3%,C-ADX-Shh 組:77.7%,C-ADX 組:86.8%,C-Sham 組：86.1%），代表新生 成的成熟神經細胞參與在海馬迴學習記憶功能有高達八成四比例。圖十三到十五 為實際各組染色狀況。
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No. of BrdU(+) Arc(+) NeuN(+) cells
0
C-SHAM C-ADX C-ADX-SHH E-SHAM E-ADX E-ADX-SHH
percentage of BrdU(+) Arc(+) NeuN(+)/BrdU(+)
* * *
*
*
*
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C-SHAM C-ADX C-ADX-SHH E-SHAM E-ADX E-ADX-SHH
percentage of BrdU(+) Arc(+) NeuN(+) / Arc(+) BrdU(+)
*
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圖十三、E-ADX組染色圖（A）BrdU:紅色（B）Arc：綠色（C）NeuN:藍色（D）BrdU、
Arc、NeuN染色結合圖。白色箭頭所指三種抗體皆有染到。
圖十四、E-ADX-Shh 組染色圖（A）BrdU:紅色（B）Arc：綠色（C）NeuN:藍色（D）
BrdU、Arc、NeuN 染色結合圖。白色箭頭所指三種抗體皆有染到，黃色箭頭所指 BrdU、Arc 共同染到。
(A) (B)
(C) (D)
(A) (B)
(C) (D)
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圖十五、E-Sham 組染色圖（A）BrdU:紅色（B）Arc：綠色（C）NeuN:藍色（D）
BrdU、Arc、NeuN 染色結合圖。白色箭頭所指三種抗體皆有染到，黃色箭頭所指 BrdU、Arc 共同染到，紅箭頭所指只有 BrdU。
(A) (B)
(C) (D)
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b.未成熟之新生成神經細胞
從圖十六觀察未成熟之新生成神經細胞活化的情形，E-ADX-Shh（n=3）組與 E-Sham(n=3)組都比 E-ADX(n=3)組共同染到 DCX、Arc、BrdU 三個標的蛋白的細 胞數量多（E-ADX-Shh＝2032.7±289.44、E-Sham＝2363.19±310.41、E-ADX＝
1199.24±305.87，E-ADX 與 E-ADX-Shh 相比 p=0.06，E-ADX 與 E-Sham 相比 p=0.013，one-way ANOVA），而 E-ADX-Shh 和 E-Sham 之間是沒有差異（p= 0.43，
one-way ANOVA）；一般鼠籠環境下 C-ADX-Shh(n=3)組與 C-ADX(n=3)組觀察到共 同染到 DCX、Arc、BrdU 數量細胞數量與 C-Sham(n=3)組沒有差異（C-ADX-Shh＝
1395.59 ± 222.39 、 C-ADX ＝ 1294.56 ± 448.82 、 C-Sham ＝ 1165.34 ± f446.68 ， C-ADX-Shh 與 C-Sham 相比 p=0.57，C-ADX 與 C-Sham 相比 p=0.75，one-way ANOVA）。從圖十七中觀察每一組在染到 BrdU 的細胞中共同染到 DCX 與 Arc 的數 量 佔 的 比 例 不 到 一 成 （ E-ADX-Shh 組 ： 6.0 %,E-Sham 組 :6.4%,E-ADX 組:9.8%,C-ADX-Shh 組:11.7%,C-ADX 組:10.2%,C-Sham 組：6.4%），代表在齒狀 迴區域中未成熟神經細胞參與在海馬迴學習記憶功能只佔新生成細胞的 10%。從 圖十八觀察沒活化之未成熟新生成神經細胞，可以發現每一組細胞數量相較於圖 十六相對更少，所以大部分未成熟新生成神經細胞是有參與活動。而在圖十九有 被活化的新生成神經細胞中為未成熟階段的細胞佔一成比例（E-ADX-Shh 組：
7.2%,E-Sham 組 :8.6%,E-ADX 組 :12.6%,C-ADX-Shh 組 :14.6%,C-ADX 組:14.6%,C-Sham 組：7.5%），代表參與在海馬迴學習記憶功能的新生成神經細 胞中只有一成比例為未成熟神經細胞。圖二十到二十一為實際各組染色狀況。雖 然成熟與未成熟神經細胞都參與在行為實驗，但成熟的新生成神經細胞佔的比例 高於未成熟，代表著新生成神經細胞在執行海馬迴之學習記憶行為主要為已成熟 的神經細胞。
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C-SHAM C-ADX C-ADX-SHH E-SHAM E-ADX E-ADX-SHH
No. of BrdU(+) Arc(+) DCX(+) cells
0
C-SHAM C-ADX C-ADX-SHH E-SHAM E-ADX E-ADX-SHH
percentage of BrdU(+) Arc(+) DCX(+)/BrdU(+)
*
*
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No. of BrdU(+) Arc(-) DCX(+) cells
0
C-SHAM C-ADX C-ADX-SHH E-SHAM E-ADX E-ADX-SHH
percentage of BrdU(+) Arc(+) DCX(+)/BrdU(+) Arc(+)
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圖二十、E-ADX組染色圖（A）BrdU:綠色（B）Arc：藍色（C）DCX:紅色（D）BrdU、
Arc、DCX染色結合圖。白色箭頭所指三種抗體皆有染到，紅箭頭所指只有BrdU，
黃色箭頭所指Arc、DCX同時染到。
圖二十一、E-ADX-Shh 組染色圖（A）BrdU:綠色（B）Arc：藍色（C）DCX:紅色
（D）BrdU、Arc、DCX 染色結合圖。白色箭頭所指三種抗體皆有染到。
(A) (B)
(C) (D)
(A) (B)
(C) (D)
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