成年大鼠海馬迴之新生成神經細胞在學習記憶中所扮演的角色 - 政大學術集成

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(1)國立政治大學神經科學研究所碩士論文. 治政成年大鼠海馬迴之新生成神經細胞在學習記憶中大立 ‧ 國. 學. 所扮演的角色. The role of adult born neurons of the hippocampus in. ‧. learning and memory. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. i n U. v. 研究生：林曉涵撰指導教授：賴桂珍博士. 中華民國 103 年 2 月 24 日.

(2) 中文摘要海馬迴為主要參與學習記憶和認知的腦區，許多認知功能異常與海馬迴有關，例如阿茲海默症、壓力皆會對認知功能造成影響。在成熟哺乳類動物的大腦中發現海馬迴的顆粒細胞下區(Subgranular zone, SGZ)持續有新神經細胞生成。在先前的實驗，我們在海馬迴之顆粒細胞大量死亡的大鼠中成功促進成體神經新生（adult neurogenesis）而且使海馬迴的學習記憶功能恢復，但對於這些新生成神經細胞是否參與學習記憶的進行並不清楚。海馬迴的顆粒細胞需要腎上腺所分泌的皮質酮才能生存，如果將雙側腎上腺移除會造成顆粒細胞大量死亡。因此. 政治大. 摘除雙側腎上腺（adrenalectomized,ADX）的老鼠可以當作一個研究海馬迴之顆. 立. 粒細胞死亡與新生的模型。當 ADX 三個月後給予 sonic hedgehog(shh)和豐富環. ‧ 國. 學. 境後，觀察到有大量的新顆粒細胞生成，而且原本有問題的海馬迴之學習記憶功能也恢復正常。所以接下來我們要探討這些新生成的神經細胞是否併入原本的神. ‧. 經網絡，而且參與學習記憶的過程，利用 Arc 的組織免疫染色來觀察，Arc 屬於. y. Nat. sit. 當突觸活化時會立即表達的基因（immediate early gene），在進行行為測試後. n. al. er. io. 1.5 小時可被觀察到。以觀察 Arc 和 BrdU（標定十週前所新生成的細胞）共同染. i n U. v. 到的狀況，推測新生成神經細胞參與在學習記憶上。從我們的實驗結果顯示給予. Ch. engchi. Shh 後待豐富環境的 ADX 老鼠比待一般鼠籠環境的 ADX 老鼠在齒狀迴有大量的 Arc 和 BrdU 共同被染到，而且在 Object-context association 行為測試上，待豐富環境的老鼠，表現與正常老鼠一樣，但是待一般鼠籠環境的則與沒給 Shh 處理的 ADX 老鼠表現相同，顯示 Shh 的治療效果必須搭配豐富環境才能顯現出來。從結果推測經過 Shh 和豐富環境刺激所生成且存活下來的神經細胞會參與在神經網絡的活動中。. Ⅰ.

(3) Abstract The hippocampus is a brain region critical to learning and memory and is a frequent target of many neurological diseases such as Alzheimer’s, other forms of dementia, and chronic stress that have dramatic cognitive consequences. The Subgranular zone (SGZ) of the hippocampus is one of the mammalian brain regions where new neurons are generated continuously throughout adult life. Previously, we have successfully promoted adult neurogenesis and demonstrated functional. 政治大 to address the question. recovery after hippocampal granule cell degeneration in a rat model.. 立. This study was undertaken. of whether the. ‧ 國. 學. adult-born neurons were integrated into a neural network and involved in the process of learning and memory. Corticosterone, secreted by adrenal. ‧. glands, is required for hippocampal granule cell survival and bilateral. sit. y. Nat. removal of adrenal glands lead to granule cell death. Therefore,. al. er. io. adrenalectomized (ADX) rats were used to ablate, and regenerate granule. v. n. cells in the hippocampus. Three months after treatment of ADX animals with. Ch. engchi. i n U. sonic hedgehog (shh) and environmental enrichment, significant amount of granule cell regeneration and restoration of brain function was observed. To determine whether the new born neurons were integrated into a neural network. and. participated. in. the. learning. and. memory. process,. immunohistochemistry for Arc, a synaptic activity dependent immediate early gene product was performed after behavior test. Colocalization of Arc and BrdU (a marker for neurons born 10 weeks ago) staining suggests that new neurons which were born during shh treatment were involved in the learning and memory. Colocalization of Arc and BrdU was more abundant. Ⅱ.

(4) in the dentate gyrus of the hippocampus in ADX animals treated with shh and housed in the enriched environment when compared with untreated ADX animals or ADX animals treated with shh but housed in cages. These results suggest that after treatment with shh and environmental enrichment, new born neurons survives for at least 3 months and participates in the activities of neural networks.. 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. Ⅱ. i n U. v.

(5) 目錄中文摘要 ................................................................................................................................. Ⅰ 英文摘要 ................................................................................................................................. Ⅱ 目錄 ......................................................................................................................................... Ⅲ 第一章、. 緒論 ..................................................................................................................... 1. 第一節、 1.. 海馬迴的構造.......................................................................................................... 1. 2.. 海馬迴的訊號傳遞 .................................................................................................. 1. 3.. 海馬迴與學習記憶 .................................................................................................. 2. 4.. 齒狀迴的功能.......................................................................................................... 4. 5.. 海馬迴相關的學習記憶行為實驗 .......................................................................... 4. 立. 政治大. ‧ 國. 學. 第二節、. 成體神經新生（Adult Neurogenesis）與調控 ......................................... 5. ‧. 成體神經新生.......................................................................................................... 5. 2.. 調控神經新生.......................................................................................................... 7. 3.. Sonic hedgehog 促進神經新生 ............................................................................. 8. 4.. 豐富環境（Environmental enrichment, EE）促使新生成神經細胞生存 ...... 9. n. al. er. io. sit. y. Nat. 1.. 第三節、. Ch. engchi. i n U. v. 腎上腺摘除手術(Adrenalectomy)引發海馬迴顆粒細胞死亡 ................. 10. 1.. 腎上腺(Adrenal gland) ...................................................................................... 10. 2.. 下視丘-腦垂腺-腎上腺軸(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal, Axis) ........ 10. 3.. 腎上腺摘除手術(Adrenalectomy) ...................................................................... 11. 第四節、. 運用立即表現基因(immediate-early gene, IEG)觀察活化神經細胞 . 12. 1.. 立即表現基因........................................................................................................ 12. 2.. Arc 基因影響學習記憶 ......................................................................................... 13. 第五節、第二章、 1.. 海馬迴（Hippocampus） ............................................................................... 1. 本論文實驗目的及策略 ............................................................................... 14 實驗材料方法 ................................................................................................... 15. 實驗動物 .................................................................................................................... 15 Ⅲ.

(6) 2.. 腎上腺摘除手術（Adrenalectomy） ...................................................................... 15. 3.. 在手術前一天準備埋管的材料 ................................................................................ 16. 4.. 立體定位手術（Stereotaxic surgery）與埋管 .................................................. 17. 5.. 埋管後飼養環境 ........................................................................................................ 18. 6.. 給予 Corticosterone（CORT） ............................................................................... 18. 7.. 行為測試-物品與情境聯合試驗（Object-context association） .................. 19. 8.. 腦組織的灌流製備與切片 ........................................................................................ 20. 9.. 腦組織染色(Immunohistochemistry,IHC) ............................................................ 21. 10.. 切片細胞計數分析軟體 ........................................................................................ 22. 11.. 行為結果分析........................................................................................................ 22. 12.. 統計分析................................................................................................................ 22. 13.. 實驗流程圖............................................................................................................ 23. 立. 政治大. ‧ 國. 學. 第三章、. 結果 ................................................................................................................... 24. ‧. 摘除腎上腺後體重變化 ............................................................................................ 24. 2.. 摘除腎上腺後 ADX 與 Sham 細胞數比較 .................................................................. 26. 3.. Shh 與豐富環境恢復 ADX 老鼠之學習記憶能力 ..................................................... 28. 4.. 新生成神經細胞參與學習記憶行為 ........................................................................ 30. er. io. sit. y. Nat. 1.. al. n. v i n Ch 新生成細胞比較 ........................................................................................... 30 engchi U. （1）（2）（3）. 新生成神經細胞參與行為 ........................................................................... 32 成熟之新生成神經細胞大量活化 ............................................................... 36. a.. 成熟之新生成神經細胞 ........................................................................................ 36. b.. 未成熟之新生成神經細胞 .................................................................................... 42. 第四章、. 討論 ................................................................................................................... 46. 第五章、. 結論. ................................................................................................................. 49. 參考文獻 ................................................................................................................................. 50. Ⅲ.

(7) 第一章緒論第一節、海馬迴（Hippocampus） 1.海馬迴的構造在一個生命個體中，最重要的靈魂器官非大腦（Brain）莫屬，掌控了思考、情緒、認知、運動、動機……等，而在大腦中佔廣大範圍的海馬迴（Hippocampus）更是主要產生學習與記憶的腦區。海馬迴屬於邊緣系統（Limbic system）的一部分，在左右半腦是以對稱的形態存在，而外型類似於海馬，以縱切面觀察形態. 治政大顳中隔軸（Septotemporal axis）。海馬迴本體若以細胞型態和訊號投射路徑的立. 像 C 字型，包含範圍從前腦中隔（Septal）延伸到顳葉區（Temporal lobe）稱. 不同亞區（Subregion）為海馬角 1（Cornu ammonis 1, CA1)-含有小的錐體細. ‧ 國. 學. 胞（Pyramidal cell）、海馬角 2（Cornu ammonis 2, CA2）-小的錐體細胞、海. ‧. 馬角 3（Cornu ammonis 3, CA3）-寬大型的錐體細胞、海馬角 4（Cornu ammonis. y. Nat. 4, CA4）-寬大型的錐體細胞，而其他部份為齒狀迴(Dentate gyrus,DG)-富有顆. er. io. sit. 粒細胞與新生成的神經細胞、海馬下腳（ Subiculum ）、海馬前部下腳（Presubiculum）、海馬旁下腳（Parasubiculum）、嗅內區（Entorhinal area）. n. al. Ch. (Sendrowski & Sobaniec, 2013)。. engchi. i n U. v. 2.海馬迴的訊號傳遞海馬迴內神經訊號傳遞形成完整的一個網絡，當一個神經衝動（Impulse）傳入在第二層嗅內皮質（Entorhinal cortex）時經穿通通路（Perforant pathway）將訊號傳到齒狀迴和海馬角 3；若是從第三層嗅內皮質傳遞，經穿通通路和槽通路(Alvear pathway）將訊號傳到海馬角 1 和海馬下腳。齒狀迴的顆粒細胞經苔狀纖維(Mossy fiber)將訊號投射到海馬角 3，海馬角 3 的錐體細胞把訊號經 Schaffer 側支（Schaffer collateral）投射到海馬角 1，海馬角 1 的錐體細胞 1.

(8) 將訊號投射到海馬下腳，最後海馬角 1 和海馬下腳再把訊號傳回嗅內皮質。不同的神經訊號分別對海馬迴做刺激，海馬迴的這些亞區經由完整的神經網絡將不連續且分散的訊號做放大與整合再輸出(Mayadevi, 2012; Sendrowski & Sobaniec, 2013)。海馬迴含有許多複雜的神經迴路，可以接收外界各式各樣的感覺、知覺訊息再藉由神經投射路徑進入海馬迴，而這些訊息在海馬迴處理完之後會再傳到大腦皮層的不同區域，所以海馬迴可以整合外來的訊息並且將這些訊息和原本儲存在大腦的訊息做比對做出適當的生理反應。. 政治大在 1957 年神經外科醫生立 William Scoville 發現因嚴重癲癇（Epilepsy）. 3.海馬迴與學習記憶. ‧ 國. 學. 而切除顳葉內側的病人 H.M.，手術後開始有失憶的現象，無法記得新事物但能學習新技能。因切除的區域包含海馬迴，推斷海馬迴與學習記憶是有關係，而後. ‧. 的動物實驗中切除海馬迴也有發現這些動物無法形成新的記憶，由這些證據而奠. sit. y. Nat. 定海馬迴是參與學習記憶的重要腦區(McClelland, McNaughton, & O'Reilly,. al. er. io. 1995)。在背側（Dorsal）的海馬迴主導認知功能及學習記憶的部份，最主要管. v. n. 理空間記憶（Spatial memory）和情境式記憶（Contextual Memory）；相反地腹. Ch. engchi. i n U. 側（Ventral）的海馬迴與其他的邊緣系統和前額葉皮質（Prefrontal cortex）交互作用對情緒與壓力做反應(Tanti, Rainer, Minier, Surget, & Belzung, 2012)。空間記憶的形成是需要海馬迴中的一群特定細胞-位置細胞（Place cell），對空間位置會產生偏好反應，使海馬迴對空間的概念建構有助於記憶的形成 (Pfeiffer & Foster, 2013)。特別在齒狀迴發現對於空間學習記憶是主要的關鍵亞區，也參與在情境式學習記憶，如果將齒狀迴破壞會觀察到相關的學習記憶行為實驗異常，如水迷宮（Water maze）、物品與情境聯合試驗（Object-context association task）(Conrad & Roy, 1993; A. M. Morris, Curtis, Churchwell, Maasberg, & Kesner, 2013)( Lai, G.J., Lehmann, H. & Sutherland, R.J. (b), 2.

(9) manuscript)。海馬迴會整合在某一時間和空間所發生的事情，形成情節式記憶（Episodic memory）屬於陳述性記憶（Declarative memory），這樣的記憶複雜度很高，因為包含著空間感、時間感、情境事件、具有知覺感覺的記憶 (Bekinschtein, Renner, Gonzalez, & Weisstaub, 2013; Jenkins & Ranganath, 2010; Park, Leal, Spann, & Abellanoza, 2013)。海馬迴在陳述性訊息轉為長期記憶(Long-term memory)的過程扮演重要角色(Barbosa, Pontes, Ribeiro, Ribeiro, & Silva, 2012; Bekinschtein et al., 2013; Wilson et al., 2013)。海馬迴之神經細胞經過環境或經歷的刺激會長出突觸（Synapse），將這些外界訊. 治政大博士首度發現突觸可塑性（Synaptic plasticity）的存在，當時他們使用簡短立. 號儲存起來轉換成記憶訊號(Mayadevi, 2012)。在 1973 年 Bliss 博士和 Lomo. 且高頻率的電刺激作用於齒狀迴-顆粒細胞的前突觸（Presynaptic sit）處，而. ‧ 國. 學. 反應在後突觸（Postsynaptic sit）處的神經細胞，發現有持續性的去極化反應. ‧. （ Depolarization ），他們稱作長期增益效應 (Long-term potentiation,. y. Nat. LTP)(Bliss & Gardner-Medwin, 1973; Blundon & Zakharenko, 2008; Mayadevi, synapses），當. er. io. sit. 2012)。長期增益效應主要發生在谷氨酸突觸（Glutamatergic. 受刺激時谷氨酸（Glutamate）被釋放出來到突觸間隙（Synaptic cleft），谷氨. al. n. v i n 酸活化了突觸後神經細胞上的谷氨酸受體（Glutamate receptor），引起突觸後 Ch engchi U 神經細胞興奮性膜電位(Excitatory post synaptic potential, EPSP)持續增加 (Bliss & Gardner-Medwin, 1973; Mayadevi, 2012)。長期增益效應作用可以持. 續數小時甚至到數週之久，研究發現細胞內的結構蛋白、蛋白質激酶、細胞膜上受體的數目都會發生改變，由此可知這些的變化可能會改變突觸與突觸之間的交互作用、改變突觸數目和結構與影響神經傳遞物質（Neurotransmitter）的釋放與回收等。以突觸的變化一連串的反應到影響記憶的形成和強度，這種改變為突觸可塑性(Blundon & Zakharenko, 2008; Davies & Collingridge, 1989; Teyler & DiScenna, 1987)。. 3.

(10) 4.齒狀迴的功能海馬迴的不同亞區內，在學習記憶中齒狀迴操控重要的過程，背側的齒狀迴有訊號輸入輸出，可以將接收到的感覺知覺或空間辨識的訊號，再將訊號往海馬角 3 輸出。背側齒狀迴幫助海馬迴在空間的辨識、環境情境辨識，助於空間或情境式學習記憶的形成，連同複雜的情節式記憶;不同地在腹側齒狀迴則是負責氣味的辨識，所以齒狀迴對於海馬迴的功能有很大的貢獻，而且齒狀迴有新的神經細胞產生。一旦齒狀迴受損或是神經細胞死亡造成海馬迴許多功能不能正常執行 (Kesner, 2013)。. 立. 政治大. 5.海馬迴相關的學習記憶行為實驗. ‧ 國. 學. 當海馬迴受破壞後，發現在以下學習記憶行為實驗有異常表現。這些海馬迴. ‧. 受損的老鼠在水迷宮行為測試中難以找到平台(R. G. Morris, Anderson, Lynch,. y. Nat. & Baudry, 1986; R. G. Morris, Garrud, Rawlins, & O'Keefe, 1982; Pearce,. er. io. sit. Roberts, & Good, 1998)，而在放射狀八爪迷宮(radial arm maze)行為測試中不能快速找到目標軌道（arm）或待在目標軌道時間與其他軌道並無差異(Jarrard,. al. n. v i n 1983)，同樣在情境式制約學習（Contextual fear conditioning learning）對 Ch engchi U 於足部電擊（foot shock）的記憶很微弱產生恐懼反應比正常老鼠來的慢或者恐. 懼程度沒正常老鼠高(Cho, Friedman, & Silva, 1999; Frohardt, Guarraci, & Bouton, 2000; Kim & Fanselow, 1992; Phillips & LeDoux, 1992)。前面的行為測試對於海馬迴之單一空間或者情境式條件或認知功能有異常，而複雜的情節式記憶更是需要經由海馬迴整合時間、空間和情境的記憶，當海馬迴受損時情節式記憶的行為測驗也是異常(Mumby, Gaskin, Glenn, Schramek, & Lehmann, 2002; O'Brien, Lehmann, Lecluse, & Mumby, 2006)，例如物品與情境聯合試驗，實驗設計兩個不同環境（光線、行為箱顏色或形狀），每一個環境有固定放置兩個. 4.

(11) 一樣的物品，兩個環境所放置物品是不同的，當老鼠兩個環境都熟悉後，在即將要進入的環境中的一個物品置換成另一個環境的物品。正常老鼠會對不是對應（Mismatch）此環境的物品產生高度興趣，探索時間會高於原本對應（Match）此環境之物品，從對應跟非對應物品的探索時間去判斷老鼠是否能將環境與物品做記憶連結(Bekinschtein et al., 2013; Wilson et al., 2013)。若齒狀迴的顆粒細胞大量死亡，則老鼠在物品與情境聯合試驗會產生問題(Lai, G.J., Lehmann, H. & Sutherland, R.J. (b), manuscript)。. 政治大. 第二節、成體神經新生（Adult Neurogenesis）與調控. 立. 1.成體神經新生. ‧ 國. 學. 成體神經新生（Adult Neurogenesis）是在成熟的哺乳類動物中，發現在某些特定腦區有神經細胞新生成的現象。這些特定腦區含有神經幹細胞(Neural. ‧. stem cell, NSC)或神經前驅細胞(Neural progenitor cells, NPC)，因為這類. y. Nat. sit. 型細胞具有幹細胞的功能如自我複製增生和分化成有功能性的神經細胞，所以成. n. al. er. io. 熟的哺乳類動物會持續地有新神經細胞產生。最早於 1962 年 Altman 博士觀察到. i n U. v. 有成體神經新生現象，而後來的研究主要在此處神經前驅細胞可生成兩個區域發. Ch. engchi. 現：（1）海馬迴中的齒狀迴之顆粒細胞下區(Subgranular zone,SGZ)，齒狀顆粒細胞（Dentate granule cells）生成(Altman & Das, 1965a, 1965b; Zhang et al., 2013)。（2）側腦室下區(Subventricular zone, SVZ)，此處新生成的神經細胞會經由啄側遷移流（ Dostral migratory stream, RMS) 移動至嗅球（ Olfactory bulb ）形成中間神經元（ Interneurons ） (Alvarez-Buylla & Garcia-Verdugo, 2002; Feng et al., 2013; Lichtenwalner & Parent, 2006)。之後幾年陸陸續續發現其他腦區也有觀察到新生成神經細胞如下：新皮層（Neocortex）在 1999 年 Gould 博士首次在猴子的新皮層發現有新生成神經細胞，由側腦室下區新生成的神經細胞移動到新皮層(Dayer, Cleaver, Abouantoun, 5.

(12) & Cameron, 2005; Fowler, Liu, Ouimet, & Wang, 2002; Gould, Reeves, Graziano, & Gross, 1999)。Bernier 博士於 2002 年在猴子梨狀皮質(Piriform cortex) 觀察到新生成神經細胞，這些新生成神經細胞由側腦室下區生成 (Bernier, Bedard, Vinet, Levesque, & Parent, 2002; Chawana et al., 2013) (Pekcec, Loscher, & Potschka, 2006; Shapiro et al., 2007)。其他腦區與以上舉例一樣如：杏仁核(Amygdala)(Bernier et al., 2002; Shapiro et al., 2007)、紋狀體(Striatum)(Dayer et al., 2005; Shapiro et al., 2007)、黑質(Substantia nigra)(Kokoeva, Yin, & Flier, 2007; Worlitzer, Viel, Jacobs,. 治政大移至特定腦區。但最新發現下視丘(Hypothalamus)與顆粒細胞下區和側腦室下區立. & Schwamborn, 2013; Zhao et al., 2003)，都是從側腦室下區生成神經細胞再. 一樣會產生新的神經細胞。在囓齒類和羊的腦中觀察到下視丘有細胞增生（Cell. ‧ 國. 學. proliferation）的現象，使用胸腺嘧啶(Thymidine)的類似物-溴化去氧尿苷. ‧. (Bromodeoxyuridine, BrdU)標的新生成細胞，再與不同生長時期的神經細胞所. y. Nat. 表現的蛋白一起觀察，發現有 20~30%的 BrdU 與神經細胞表現特有的蛋白同時被. er. io. sit. 標記到，代表著下視丘生成新的神經細胞(Kokoeva et al., 2007; Migaud et al., 2010; Worlitzer et al., 2013; Xu et al., 2005)。從神經前驅細胞到成熟神. al. n. v i n 經細胞，在這成長過程有不同的蛋白表現，而這些蛋白也就代表著觀察到的神經 Ch engchi U. 細胞屬於哪一階段的神經細胞，在神經前驅細胞時期有 Nestin、Sox2（sex determining region Y-box 2）和 GFAP（Glial fibrillary acidic protein），未成熟時期有 DCX （ Doublecortin ）、 Tuj1 （ Neuron-specific class III beta-tubulin）、PSA-NCAM (polysialylated neuronal cell adhesion molecule)，而成熟時期有 NeuN（Neuronal nuclear antigen) (Kokoeva et al., 2007; Migaud et al., 2010; Worlitzer et al., 2013; Xu et al., 2005)。. 6.

(13) 2.調控神經新生成體的神經新生過程中發現某些分子參與在其中，以轉錄因子（ Transcription factors ）為例有 Pax6 （ Paired box gene 6 ）、 Neurog2 （ Neurogenin 2 ）、 Tbr2 （ T-box brain gene 2) 、 Neurod1 （ Neuronal differentiation 1）、Tbr1（T-box brain gene 1)(Kempermann, 2011) (Brill et al., 2009; Hodge et al., 2008; Ninkovic et al., 2013)。而訊號（Signaling）分子-Wnt、Shh(Sonic hedgehog)、Bmp(Bone morphogenetic protein)、Notch，以上除了 Bmp 減少神經新生外其他訊號分子會促進細胞增生(Faigle & Song,. 政治大也會促進神經新生如給予去氧羥四環素（Doxycycline）連續四週後在海馬迴的立. 2013; Kempermann, 2011; Varela-Nallar & Inestrosa, 2013)。有些其他因子. ‧ 國. 學. 顆粒細胞下區觀察到細胞增生時會表現的蛋白 Ki-67，也發現 BrdU 與神經細胞成熟時表現的蛋白-NeuN(Sultan, Gebara, & Toni, 2013)。同時被標的到；若. ‧. 是給予 D-絲氨酸（D-serine）一週也是觀察有神經細胞新生成(Sultan, Gebara,. sit. y. Nat. Moullec, & Toni, 2013) 。有研究發現將老鼠的 FGF-2(Fibroblast growth. al. er. io. factor-2)做基因剔除（Gene knockout）後，發現神經新生的細胞數量減少，但. v. n. 在正常有 FGF-2 老鼠依據顆粒細胞下區所標的到的 BrdU 和 NeuN 可觀察到大量神. Ch. engchi. i n U. 經新生(Rotschafer et al., 2013; Woodbury & Ikezu, 2013; Yoshimura et al., 2001)。另外有發現神經傳遞物質-血清素（Serotonin）會誘導顆粒細胞下區長出新的神經細胞 (Beckman & Santos, 2013) ，而市面上使用的抗憂鬱藥物（Antidepressant drugs）也可以刺激神經新生(R. G. Morris et al., 1986)。除了以上內生性物質或者外加的物質以外，外在行為也是會影響神經新生如運動（Exercise）是個非常強勁的神經可塑性因子，可促進大腦做修復和神經新生，過去研究發現讓高齡的老鼠自發性跑滾輪連續 45 天，觀察到有新生成神經細胞並且在水迷宮試驗中比一般高齡老鼠更快速找到平台(Clark, Bhattacharya,. 7.

(14) Miller, & Rhodes, 2011; Maynard & Leasure, 2013; Rodgers, Trevino, Zawaski, Gaber, & Leasure, 2013; van Praag, Shubert, Zhao, & Gage, 2005)。. 3.Sonic hedgehog 促進神經新生在脊椎動物的 Hedgehog (Hh) 訊號傳遞家族（Signaling Pathway family）包含三個成員：Desert hedgehog (Dhh)、Indian hedgehog (Ihh)、Sonic hedgehog (Shh)，其中 Shh 在脊椎動物中最被廣泛的研究而且參與胚胎時期的發育 (Goodrich & Scott, 1998)。Shh 是一種內生性蛋白的型態因子（Morphogen）. 政治大 Shh 表現在脊索（Notochord）和神經管（Neural tube） 2007)，在發育時期觀察到立. 會依照濃度的不同去調控細胞的命運(Traiffort et al., 1999; Ulloa & Briscoe,. ‧ 國. 學. 的底板(Floorplate）誘導此處細胞後形成脊髓運動神經元（Spinal motor neuron）、中腦多巴胺神經元（Midbrain dopaminergic neuron）、前腦基底神經. ‧. 元 (Basal forebrain neuron) 、血清素神經元（ Serotoninergic neuron ）. sit. y. Nat. (Goodrich & Scott, 1998; Traiffort et al., 1999; Wechsler-Reya & Scott,. al. er. io. 1999; Ye, Shimamura, Rubenstein, Hynes, & Rosenthal, 1998)，而 Shh 也會. v. n. 在腸道（Gut）、肢體（Limb）表現(Traiffort et al., 1999)。在胚胎發育後期. Ch. engchi. i n U. Shh 會在以下腦區被觀察到：小腦（Cerebellum）、杏仁核、海馬迴-齒狀迴、嗅球、新皮層(Traiffort et al., 1999)。Shh 基因會自我催化和修飾成為一個活化的訊號蛋白再分泌到細胞外，在要作用時會結合兩個穿膜蛋白（Transmembrane proteins）：Patched (Ptc)和 Smoothened (Smo)，前者為 Shh 結合位置後者將訊號傳入細胞內，當訊號傳入後會活化 Cubitus interruptus (Gli)這個轉錄因子進入到細胞核內開啟 Gli 基因轉錄作用，影響細胞的命運、型態和增生 (Dahmane et al., 2001; Manoranjan et al., 2012) (Traiffort et al., 1999)。在研究中發現 Shh 與 Epidermal growth factor (EGF)和 Fibroblast growth factor (FGF)調控胚胎發育時期或者成年後的神經幹細胞使其具有自我更新 8.

(15) （Self-renewal）的能力，促進細胞增生(Martinez et al., 2013)。當過度表達（Overexpression）Shh 發現顆粒細胞下區和側腦室下區都有觀察到神經前驅細胞大量增生(Faigle & Song, 2013)。在成年後 Shh 持續在基底前脑斜角带垂直臂核(Vertical limb of the diagonal band,VDB)表現(Traiffort et al., 1999)。. 4.豐富環境（Environmental enrichment, EE）促使新生成神經細胞生存. 治政大在 1947 年 Hebb 觀察到豐富環境所帶來的變化，與住在一般飼養環境立. （Standard laboratory）的動物相比，發現在豐富環境中的動物腦部型態與行. ‧ 國. 學. 為表現有所不同(Thompson & Heron, 1954)。豐富環境與一般飼養環境的不同在. ‧. 於提供多元化感官和認知的刺激、廣大的活動空間、更複雜的社交生活，進而改. y. Nat. 變動物的學習與記憶。對這些變化再深入的探討，發現豐富環境的刺激增加樹突. er. io. sit. 的分支（Dendritic branching）和突觸新生（Synaptogenesis）(Harati et al., 2011) ，使神經滋養因子（ Neurotrophin ） - 神經生長因子 (Nerve growth. al. n. v i n factor,NGF) 、神經膠衍生子 (Glial C神 h e經n滋g養c 因 hi U. cell line-derived. neurotrophic factor,GDNF)、腦源神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的量增加(Birch & Kelly, 2013)，改變神經傳遞物質的系統-多巴胺、血清素、乙醯膽鹼(Acetylcholine)、谷氨酸、γ-Aminobutyric acid（GABA） (Solinas, Thiriet, Chauvet, & Jaber, 2010)，更能促進在海馬迴新生成神經細胞的生存（Survival）(Harati et al., 2011)。在帕金森氏症（Parkinson's disease）、阿茲海默症（Alzheimer's disease）等神經退化性疾病的老鼠，發現給予豐富環境後，在學習與記憶上都有恢復的現象(Laviola, Hannan, Macri, Solinas, & Jaber, 2008; Nithianantharajah & Hannan, 2006)，如新奇事物. 9.

(16) 認知測試（Novel object recognition task）中使用突變澱粉樣蛋白質前驅蛋白（b-amyloid precursor protein,APP）的阿茲海默症模型老鼠，待過四個月的豐富環境後對於沒看過的物品興趣度較高，與一般老鼠行為表現沒有差異，代表記憶力有提昇(Valero et al., 2011)；而一樣的動物模型使用水迷宮（water maze）測試，也觀察到老鼠快速到有平台的象限中，代表老鼠恢復空間學習的能力。. 第三節、腎上腺摘除手術(Adrenalectomy)引發海馬迴顆粒細胞死亡 1.腎上腺(Adrenal gland). 立. 政治大. 腎上腺為一個內分泌腺體，位於雙側腎臟的上方，主要作用為壓力來臨時腎. ‧ 國. 學. 上腺會分泌壓力荷爾蒙（Stress hormones）而影響代謝和離子的調控，產生的生理變化使得在應對壓力時做出適當的行為反應。這些壓力荷爾蒙包含（1）皮. ‧. 質類固醇類（Corticosteroid）: 第一種為葡萄糖皮質素（Glucocorticoids），. y. Nat. sit. 如在人體的腎上腺皮質醇（Cortisol）或在囓齒類的皮質酮（Corticosterone）。. n. al. er. io. 第二種為礦物質皮質素（Mineralocorticoids），如醛固酮（Aldosterone）。(2). i n U. v. 兒茶酚胺類（ Catecholamine ） : 腎上腺素（ Epinephrine ）和正腎上腺素（Norepinephrine）。. Ch. engchi. 2.下視丘-腦垂腺-腎上腺軸(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal, Axis) 下視丘-腦垂腺-腎上腺軸是一條對壓力做回饋調控的管理軸，由三個分泌激素的線體組成。受到壓力的誘導下啟動下視丘分泌釋皮質促素（Corticotropin-releasing hormone, CRH)，而釋皮質促素作用於腦下垂體前葉（Anterior pituitary），受刺激的腦下垂體前葉分泌促腎上腺皮質激素 10.

(17) （Adrenocorticotropic hormone, ACTH），最後促腎上腺皮質激素刺激腎上腺皮質（Adrenal cortex）分泌葡萄糖皮質素。當下視丘-腦垂腺-腎上腺軸反應過盛時，會有另一條由葡萄糖皮質素主導的負回饋反應，葡萄糖皮質素會往上游的腦下垂體前葉和下視丘做抑制分泌激素的動作，還會再向上結合到在海馬迴的葡萄糖皮質素受器（ Glucocorticoid receptors,GR ）或礦物性皮質受器 (Mineralocorticoid receptors,MR)影響海馬迴，使海馬迴下指令抑制下視丘的反應，導致最下游的葡萄糖皮質素下降，以保持整個生理反應在正常平衡狀態 (Gay et al., 2013; Jankord & Herman, 2008; Sousa & Almeida, 2002)。在. 治政大壓力中扮演重要的角色。但是過多的葡萄糖皮質素所造成的異常代謝和產生的神立過去實驗中證實，破壞海馬迴後會使葡萄糖皮質素的量上升，所以海馬迴在調控. 經細胞毒性對海馬迴造成減少神經新生(Sapolsky, 1985)，所以下視丘-腦垂腺-. ‧ 國. 學. 腎上腺軸和海馬迴是密不可分的關係。. ‧ sit. y. Nat. 3.腎上腺摘除手術(Adrenalectomy). al. er. io. 1989 年 Sloviter 發現去除成年大鼠的雙邊腎上腺引起體內葡萄糖皮質素減. v. n. 少，這樣的變化導致選擇性地使海馬迴-顆粒細胞層（Granule cell layer）的. Ch. engchi. i n U. 神經細胞衰退，這樣的神經細胞衰退是一種不可逆的細胞凋亡（Apoptosis）現象(Hu, Yuri, Ozawa, Lu, & Kawata, 1997; Roozendaal, Sapolsky, & McGaugh, 1998; Sloviter, Dean, & Neubort, 1993; Sloviter et al., 1989)。在手術後三個月後再觀察海馬迴的顆粒細胞層，發現顆粒細胞大部分死亡並且齒狀迴變得非常稀薄。後來的研究中在摘除腎上腺手術後立即給予皮質酮，可以防止正常的顆粒細胞走向細胞凋亡，但因為是不可逆的凋亡現象所以如果是已經衰退的顆粒細胞已無法受到皮質酮保護(Hu et al., 1997)。對於摘除腎上腺引發顆粒細胞凋亡的機制目前不清楚，但對於顆粒細胞腎上腺所分泌的皮質酮似乎扮演保護顆粒細胞使其可以生存的角色(Hu et al., 1997)。在海馬迴富有葡萄糖皮質素 11.

(18) 受器和礦物性皮質受器，而對於皮質酮的親和性在礦物性皮質受器比葡萄糖皮質素受器更高，有研究指出或許在這顆粒細胞衰退的過程中礦物性皮質受更具影響力(Hornsby, Grootendorst, & de Kloet, 1996)。受到摘除腎上腺的影響，原本齒狀迴所負責的空間學習記憶（Spatial memory）也產生問題(Spanswick, Epp, Keith, & Sutherland, 2007)，如水迷宮行為測試，摘除腎上腺三個月後的老鼠對學習能力比一般老鼠需花更多時間去尋找平台(Conrad & Roy, 1993)。. 第四節、運用立即表現基因(immediate-early gene, IEG)觀察活化神經細胞. 立. 1.立即表現基因. 政治大. ‧ 國. 學. 立即表現基因為在受到外界刺激後一定會被活化的基因. ‧. （Activity-dependent genes），所以經常被使用來觀察細胞是否是刺激而活化. y. Nat. 的工具，如同立即表現基因的名字，這類型的基因是可以在受刺激後馬上表現. er. io. sit. （Expression）出來。立即表現基因包含轉錄因子（Transcription factor）、細胞骨架蛋白（Cytoskeletal protein）、生長因子（Growth factor）、代謝酵. al. n. v i n 素（Metabolic enzyme）、訊號傳導的蛋白(Lanahan & Worley, 1998)。有研究 Ch engchi U. 指出立即表現基因可以直接修飾突觸的功能改變神經可塑性（ Neural plasticity），在高頻率的電刺激下不僅讓立即表現基因強烈的表現出來並且同時也會快速引起 LTP，對於長期的神經可塑性是需要這些立即表現的 mRNA 快速合成(Lanahan & Worley, 1998)。在神經系統常見的立即表現基因有 c-fos 基因、 zif268 及 Arc，在 1987 Morgan 博士和 Curran 博士發現給予神經細胞電刺激後馬上觀察到 c-fos 表現，而 c-fos 基因是一種原致癌基因（protooncogene）同時也是轉錄因子，任何細胞活化時都會觀察到 c-fos 表現，是最廣泛被用來當細胞活化的工具，但 c-fos 表現得很快速而消失的也很快速(Ewing, Porr, & Pratt,. 12.

(19) 2013)。Zif268（Zinc finger transcription Factor）基因：為一種轉錄因子，在海馬迴神經細胞上的突觸做電刺激，立即發現 zif268 表現，同時也觀察到 LTP 的狀況，許多研究發現 zif268 與記憶的形成是有關係的，當 zif268 表現後會有持續性地對刺激做反應(Davis, Bozon, & Laroche, 2003; Ewing et al., 2013)； Arc(Activity-regulated. cytoskeletal. associated. protein)基因：屬於細. 胞骨架蛋白的一種，有能力修飾結構蛋白（ Structural proteins）或激酶（Kinases），當給予強烈的電刺激後表現的 Arc mRMA 可以維持八小時，可以常效而在二十四小時後回到原本體內表現量，Arc 特別表現在活化的突觸(Lyford. 政治大. et al., 1995)。這些立即表現基因代表著活化的神經細胞之指標(Clark et al., 2011)。. 學. ‧ 國. 立. 2.Arc 基因影響學習記憶. ‧. 在 1995 年 Lyford 博士初步研究中發現樹突小刺（Dendritic spines）中有. sit. y. Nat. 許多 Arc 表現(Lyford et al., 1995)，而突觸小刺為樹突延伸出來的突起物，. al. er. io. 突觸小刺會影響著突觸的強度和神經訊號傳遞，所以立即表現基因可能會直接對. v. n. 突觸可塑性做影響。在海馬迴給予 15 分鐘電刺激後可以觀察到 Arc mRNA 被誘導. Ch. engchi. i n U. 出來，而 30 分鐘後 Arc mRNA 佈滿在顆粒細胞的樹突上；在一小時後可以在樹突上觀察到 Arc 蛋白表現出來(Lanahan & Worley, 1998)。由於 Arc mRNA 和蛋白在刺激後快速表現，推估 Arc 是在突觸做轉譯（translational）的動作合成蛋白(Lanahan & Worley, 1998; Lyford et al., 1995)，在 Weiler 博士和 Greenough 博士發現有些轉譯動作是由谷氨酸受體所活化(Weiler & Greenough, 1993)，因此 Arc 有可能在有活化的突觸合成出來，以上的論點在 1998 年 Steward 博士已證實 Arc 會在活化的突觸合成(Steward, Wallace, Lyford, & Worley, 1998) 而在 2006 年 Chowdhury 和 Shepherd。許多實驗證實 Arc 參與在海馬迴相關的學習記憶行為上(Lanahan & Worley, 1998; Plath et al., 2006)，包含著空間記 13.

(20) 憶（Spatial learning）、物體辨認（Object recognition）、情境式制約學習（Contextual fear conditioning）等(Plath et al., 2006; Tan, Moratalla, Lyford, Worley, & Graybiel, 2000)，Arc 代表著突觸可塑性和神經細胞活化且參與行為指標。. 第五節、本論文實驗目的及策略有研究發現新生成神經細胞在出生後一個月至一個半月會增強 LTP，使其突觸具有可塑性(Ge, Yang, Hsu, Ming, & Song, 2007)。這些新生成的神經細胞. 政治大 Teixeira, Wang, & Frankland, 特定功能的神經細胞有助於海馬迴的功能(Kee, 立隨著成熟化過程往特定目的地移動，或許與原本存在的神經網絡結合，產生具有. ‧ 國. 學. 2007)。在實驗室先前的實驗對摘除腎上腺的老鼠利用 Sonic hedgehog 和豐富環境促進神經新生並且使細胞存活，有在海馬迴之物品與情境聯合試驗中觀察到其. ‧. 學習記憶能力恢復(Lai, G.J., Lin, H.H., & Sutherland, R.J. (a), manuscript; Lai, G.J.,. sit. y. Nat. Lehmann, H. & Sutherland, R.J. (b), manuscript)。因此，我們想探討當海馬迴在執. al. er. io. 行學習記憶行為之功能時，在海馬迴新生成的神經細胞是否參與其中，研究策略：. v. n. 使用摘除雙邊腎上腺十週後的大鼠，確認顆粒細胞大部分死亡後再給予 Sonic. Ch. engchi. i n U. hedgehog 增加神經新生，搭配給予適量的皮質酮保護新長出來的神經細胞避免走向凋亡。同時將大鼠放置豐富環境讓新生成的神經細胞可以生存下來，放置時間為十週使新生成神經細胞成熟化並與神經網絡結合(Livneh & Mizrahi, 2012)。十週後執行情節式記憶的行為測試-物品與情境聯合試驗，行為測試後利用免疫螢光染色來判斷 Arc 是否在新生成的海馬迴細胞表達，觀察新生成神經細胞是否在海馬迴執行的學習記憶行為測試上被活化，以此現象探討新生成神經細胞是否參與執行行為功能。. 14.

(21) 第二章實驗材料方法 1.實驗動物本實驗使用 long evans 品系的大鼠（訂購於國家動物中心），年紀為兩個月大的公鼠，體重約 275–300g。飼養於 12:12 小時晝夜循環（上午七點開始到晚上七點為白晝），溫度維持於 23℃，濕度維持於 60％，給予充足的飼料和水。實驗人員對動物福祉的規範均遵守行政院農委會（1998）動物保護法相關規定。. 2.腎上腺摘除手術（Adrenalectomy）. 治政大等待老鼠三個月大後進行腎上腺摘除手術，手術前先測量體重，手術後每一立. 個禮拜測量體重直到第十週，以最後一次測量體重扣除術前體重之增加重量作為. ‧ 國. 學. 初步判斷 ADX 是否成功。. ‧. 手術前 30 分鐘打開高溫玻璃珠滅菌器預熱，到手術開始時將手術器具放入. y. Nat. 高溫玻璃珠內 10 秒後取出達到滅菌效果。準備吸入性全身麻醉藥-愛沙氟倫. er. io. sit. （Isoflurane,Halocarbon products corporation,USA）置於氣麻機，開啟氧氣控制閥將氧氣與氣麻藥一同送到壓克力盒（此時給予較高濃度麻藥），當壓克力. al. n. v i n 盒充滿麻藥時將老鼠放入盒中進行麻醉。待老鼠進入深沈麻醉狀態時，把老鼠從 Ch engchi U 壓克力盒中取出放置在乾淨的擦手紙上;首先老鼠平躺背部向上開始剃毛（腎上腺位於脊椎與肋骨的交接處附近，左右各一顆），剃毛完成後清理手術檯面鋪上保溫滅菌的布將老鼠平躺背部向上，接著轉調節氣體流向的三向閥門，把氣體送至訂製的動物面罩，面罩戴上老鼠口鼻，此時打開氣體回收桶避免實驗者吸入。以打耳洞方式作為標記區分不同隻老鼠，從左方腎上腺開始摘除，將老鼠朝左側躺手術處朝上，為避免在手術過程中受感染，我們會換上手術專用滅菌手套。當手術處已乾淨後使用大剪開皮，再將肌肉打開，當腎上腺成功移除後，使用可吸收縫線（UNIK Surgical Sutures MFG.CO,Taiwan）縫合。右邊摘取如同左邊步. 15.

(22) 驟。手術後，將老鼠移至乾淨無墊料的籠子恢復，替老鼠蓋上乾淨紗布避免失溫。當老鼠甦醒後，為了讓 ADX 的老鼠保持離子濃度的平衡我們會給予 0.9%的 Sodium hydrochloride(Sigma,USA)作為飲用水。手術後隔天將老鼠放回有墊料的籠子以及給予充足的飼料和 Saline。 ADX 的對照組-Sham 組手術步驟除了未將腎上腺摘除外，其餘與 ADX 組一樣，而術後給予充足的飼料和水。. 3.在手術前一天準備埋管的材料. 政治大 Brain Infusion Kit2 (Alzet,CA)使用。可放入 200 µl 液體，Alzet,CA)，搭配立本實驗使用 2001 型 mini-osmotic pump(連續打入七天，流速 1.0 µl/hr，. ‧ 國. 學. 因為直接打入腦內，所以物質都溶在自行配製的人工腦脊髓液（Artificial cerebrospinal fluid-aCSF 配方：NaCl-8.66g、KCl-0.224g、CaCl2-2HOH-0.206g、. ‧. MgCl2-6HOH-0.163g、Na2HPO4、NaH2PO4-0.0235g），會事先使用细胞做 aCSF 滲. sit. y. Nat. 透壓測試，每一次取 aCSF 時會過濾，確保此 aCSF 為無菌。. al. er. io. 整個 priming 的動作都在無菌操作檯（Laminar flow）操作，操作前開啟紫. v. n. 外燈照射 30 分鐘滅菌並開啟抽氣裝置，之後以 70% 酒精擦拭無菌操作檯面，換. Ch. engchi. i n U. 上滅菌手套確保整個 priming 過程不受到污染。首先把 Brain Infusion Kit. 2. 的透明管和含不鏽鋼管的帽子結合，使用 pump 專用針頭吸取液體，將液體緩緩打入 pump 與透明管中，最後取 pump 與透明管連接的帽子將兩物結合，完成液體置入 pump 的動作。將 pump 泡在 aCSF 中放置 4℃冰箱，priming 的動作即完成，埋管前半小時取出回溫。本實驗打入的液體內容物分兩種：（1） SHH+Brdu+aCSF+0.1%BSA：將 Brdu 溶在 aCSF 中用來標的新生成的細胞， SHH 溶在 aCSF 中用來刺激神經細胞增生，其中 0.1%BSA 是要穩定 SHH protein。 16.

(23) （2） Brdu+aCSF+0.1%BSA：將 BrdU 溶在 aCSF 中用來標的新生成的細胞，其中 0.1%BSA 是要與第一組一樣，都加 BSA 避免有不必要的差異。. 4.立體定位手術（Stereotaxic surgery）與埋管為了讓老鼠先適應埋管後所待的環境，當老鼠做完 ADX 手術後八週會將老鼠移至埋管後將待的環境，待 ADX 手術後十週開始進行埋管手術。手術前 30 分鐘打開高溫玻璃珠滅菌器預熱，到手術開始時將手術器具放入高溫玻璃珠內 10 秒後取出達到滅菌效果。準備吸入性全身麻醉藥-愛沙氟倫. 政治大控制閥將氧氣與氣麻藥一同送到壓克力盒，當壓克力盒充滿麻藥時將老鼠放入盒立. （Isoflurane,Halocarbon products corporation,USA）置於氣麻機，開啟氧氣. ‧ 國. 學. 中進行麻醉。待老鼠進入深沈麻醉狀態時，把老鼠從壓克力盒中取出放置在乾淨，剃毛完成的擦手紙上;用手抬起老鼠頭部開始剃頭部毛（剃眼中到耳中的區域）. ‧. 後清理手術檯面。. sit. y. Nat. 前置動作完成後，接著轉調節氣體流向的三向閥門，此時氣體從門牙固定桿. al. er. io. （Tooth bar）上的面罩送出，此時打開氣體回收桶避免實驗者吸入。當氣體轉. v. n. 換到面罩後，將老鼠門牙固定於門牙固定桿（標高為-2.4mm），頭部固定於立體. Ch. engchi. i n U. 定位儀(Stereotaxic instrument)上，此時要確認老鼠頭部前後左右是否有平衡。為避免在手術過程中受感染，我們會換上手術專用滅菌手套，接著將手術處做清潔。當手術處已乾淨後以手術刀劃開頭皮，以止血鉗將肌膜與頭皮固定於四方位讓頭骨露出；將頭骨清理乾淨後明顯觀察到前囪（Bregam）位置，即可進行座標定位。依據大鼠腦部定位圖譜，以前囪位置為原點，定出後方 0.9mm、左側 1.8mm、深度 4mm 為左側腦室的位置，利用電鑽鑽孔。接下來將準備好的 pump 取出，將管子埋入固定。為了加強埋管的穩固，在頭骨上會鎖上一根螺絲，再以牙科粉將帽子與螺絲連接固定於頭骨上。當 pump 成功埋入後，使用可吸收縫線（UNIK Surgical Sutures MFG.CO,Taiwan）將頭皮縫合。手術後，將老鼠移至乾淨無墊 17.

(24) 料的籠子恢復，替老鼠蓋上乾淨紗布避免失溫。手術後隔天將老鼠放入豐富環境的老鼠公寓或者有墊料的籠子以及給予充足的飼料和 saline 或水;老鼠直到犧牲後才將整個 pump 裝置拆除。. 5.埋管後飼養環境（1）豐富環境（Environmental enrichment）： a. 平行式鼠公寓：自己裁 60 公分 x 90 公分 x160 公分木板組合成的老鼠公寓，內面使用 PP 板黏貼避免老鼠啃咬，上方使用網子覆蓋。. 政治大每日更新老鼠公寓內的物品（紙箱、木板、紙袋、木棒、鐵盒、鐵棒、管立. b. 直立式鼠公寓：訂做 60 公分 x 90 公分 x180 公分不鏽鋼的老鼠公寓。. ‧. ‧ 國. 學. 子……等），每隔三天兩公寓的老鼠會互換環境，增加環境上的刺激。. （2）一般鼠籠環境（Cage）：. er. io. sit. y. Nat. 平時飼養老鼠的透明壓克力籠子。. n. al 6.給予 Corticosterone（CORT） Ch. engchi. i n U. v. 當腎上腺摘除後的老鼠不會產生 CORT，會影響海馬迴的神經細胞，使其細胞大量死亡。本實驗我們觀察海馬迴腦區所新生成的神經細胞，所以必須恢復海馬迴腦區原本有 CORT 的環境，我們採用口服方式每天下午四點給予 CORT。而 Sham 組則給予 300ul DMSO 加到 25ml 純大豆油，每天每一隻 Sham 老鼠給予的量為 0.25ml 加至四分之一大的餅乾（半徑約 2.5 公分圓餅）。在埋管前一週開始訓練老鼠吃餅乾，並且給予 CORT 或 DMSO，先讓海馬迴恢復有 CORT 的環境（避免埋管液體打入開始作用而無 CORT 環境下影響實驗）。. 18.

(25) 7.行為測試-物品與情境聯合試驗（Object-context association）當埋管後將老鼠放入老鼠公寓或一般飼養籠子，經過十週飼養後進行行為實驗（其中在第八週先 Handle 老鼠直到做行為實驗，讓老鼠適應被抓取感覺）。實驗分成兩個房間進行：A 房間為亮白燈，使用 60 公分 x 60 公分 x 60 公分的正方型白色行為箱;B 房間為 12 瓦（W）黃燈，使用高 60 公分的半徑 30 公分黑色圓柱箱行為箱。箱子底部放老鼠墊料，每一次老鼠進入行為箱後產生的氣味以 20% 酒精去除（清理行為箱與測試物品），若有排泄物產生也立即清除，以免影響行為實驗準確度。. 政治大訓練階段（training session）立，記憶階段（retention session）。行為實驗於. 物品與情境聯合試驗行為測試分三階段：適應階段（habituation session），. ‧ 國. 學. 早上十一點開始，總共分成四天進行：（1）第一天與第二天為適應階段，將老鼠放進有乾淨墊料的籠子，運送至行為房，第一天進入其中一個行為箱 10 分鐘，. ‧. 第二天換至另一個行為箱適應 10 分鐘，確定老鼠都有探索過不同環境與行為箱。. sit. y. Nat. （2）第三天也是適應階段（讓老鼠習慣第四天的行為流程），以 A-B 或 B-A 的. al. er. io. 交替方式讓老鼠在一天內進入兩個行為箱，每次進入時間為 5 分鐘，中間間隔也. v. n. 要清理行為箱，此時老鼠放回籠子在行為房外等待。當結束第二個行為箱的探索. Ch. engchi. i n U. 後，將老鼠放回籠子在行為房外等待七分鐘再放回原本的生活環境。（3）第四天分為訓練階段和記憶階段，老鼠會進入行為箱三次（A-B-A, B-A-B, A-B-B, B-A-A），前兩次為訓練階段。在訓練階段時，A 箱會擺上兩個一樣的 x 物品，B 箱則為兩個一樣的 y 物品，讓老鼠記憶 A 箱與 B 箱的環境對應 xx 和 yy 物品，探索時間為五分鐘。第三次為記憶階段，老鼠最後要進去的行為箱將其中一個物品換成另一個不是對應此行為箱的物品（行為箱內物品：xy），所以有一個是原本環境對應的物品（matched object）和一個非對應的物品（mismatched object），探索三分鐘。老鼠生性好奇，對於原來不是放在那個箱子的物品會比較有興趣，而探索時間相對於原本的物品高。當結束行為測試後，將老鼠放回籠子在動物房 19.

(26) 等候，一個半小時後犧牲。. Day1. or. Day2. or. Day3 :match object. 政治大. Day4. 學. ‧ 國. 立. :mismatch object. 8.腦組織的灌流製備與切片. ‧. 行為實驗後一個半小時進行犧牲灌流，首先對老鼠以腹腔注射過量 chloral. sit. y. Nat. hydrate (300-450mg/kg, Sigma,USA)。在老鼠心跳停止前（但失去知覺），將老. al. er. io. 鼠移至抽氣櫃流裡臺，以大剪剪開胸腔及橫隔膜，心臟露出後採血（取 3c.c，. v. n. 馬上以 10000rpm 離心十五分鐘，將血清取出冰至-80℃冰箱，之後以 ELISA 測血. Ch. engchi. i n U. 清中 CORT 濃度）。以止血鉗夾住下循環的動脈（只灌頸部以上區域），取 18 號針頭插入左心室，以止血鉗夾將針頭與心臟夾緊，使用泵浦機（Major science, USA）進行灌流。取 1X phosphate buffer saline (PBS) 灌入左心室將血液清除（在右心房開小洞讓液體流出）約 300C.C，待確定流出的液體為透明後再灌入固定液（4% Paraformaldehyde,PFA,Sigma,USA）約 200C.C，待確定頸部以上已僵硬，即可將腦取出浸泡在固定液中 24 小時，再浸泡於 30% sucrose（J.T.Baker,USA）中脫水，其中 sucrose 配於 PBS 中，內含 0.02% sodium azide（Amresco,USA），直到腦沉在容器底部即可進行冷凍切片。當要進行冷凍切片時，將腦取出吸乾表面的 sucrose，將腦切成左右半腦後 20.

(27) 使用 o.c.t. compound（Sakura Finetek USA Inc.,USA）以嗅球朝上直立的黏在切片機（model Leica, Germany）上的平檯。取乾冰放於平檯四周，外加 70% 酒精加速降溫，待鼠腦完全冷凍後以 40μm 厚度切下腦切片，收集方式為 12 個 1.5ml eppendorf 輪流連續收取，腦切片浸泡在 1X PBS、0.1% sodium azide 中。. 9.腦組織染色(Immunohistochemistry,IHC) 染色前以 1X PBS 清洗腦切片三次各十分鐘，然後浸泡在 2N Hydrochloric acid （HCl）三十分鐘將 DNA 雙股螺旋解開，再以 0.1M Sodium borate 浸泡十. 政治大細胞打洞，溶液中加入 5% 立horseserum（HS）做 Blocking 共 1.5 小時，之後再. 五分鐘中和酸鹼，以 1X PBS 清洗三次各十分鐘。取 0.3% Triton X-100/PBS 做. ‧ 國. 學. 將腦切片浸泡於初級抗體反應 24 小時。初級抗體： mouse anti-NeuN antibody(1:800, Millipore)，rabbit anti-Arc antibody(1:100, Santa cruz)，. ‧. rat anti-BrdU antibody(1:300,Abcam)，goat anti-DCX antibody(1:200, Santa. sit. y. Nat. cruz)。24 小時後，以 1X PBS 清洗三次各十分鐘，之後再將腦切片浸泡於含 2%. al. donkey. n. (1:500,Invitrogen) ， Alexa-555. Ch. er. io. HS 的二級抗體反應 24 小時。二級抗體：Alexa-488 rabbit anti-mouse antibody. v ni. anti-. engchi U. rabbit. antibody. (1:500,Invitrogen) ， Alexa-647 donkey anti- rat antibody (1:500, Invitrogen)，Alexa-647 donkey anti-goat antibody (1:500,Invitrogen)。 24 小時後，以 1X PBS 清洗三次各十分鐘，完成染色後將腦切片貼於載玻片（玻片在使用前先覆蓋一層 1% gelatin，方便腦切片貼粘上去。操作流程:先將玻片以 95%Ethanol-495ml 加 Acetic acid-5ml 的清潔液做清洗 5 分鐘，等待液體乾之後再將玻片浸至 gelatin solution: 5g gelatin 溶在 500ml 二次水，五分鐘後把玻片移至烘箱兩到三小時後 gelatin 已經完全乾了便可使用）上，待腦切片微乾時使用自製 1/4 Strength Fluorescence Mounting Media 封片，約兩天後 Mounting Media（配法：將 4.8g PVA 加至 12g glycerol 混合均勻後再加 12ml 二 21.

(28) 次水放置 rotator 混合 24 小時，之後再加入 4.8ml 1M Tris-HCl，放置烘箱 50 ℃三十分鐘，每十分鐘取出烘箱混合均勻，完成後再加入 0.313g DABCO 混合均勻，最後以 5000g 轉速離心 15 分鐘，將雜質去除即完成）全乾後便可進行染色觀察。. 10.切片細胞計數分析軟體將完成染色的大腦切片玻片置於螢光顯微鏡下，利用 Stereo Investigator software(MicroBrightField lnc.,USA)進行細胞計數。計數 BrdU 的計數框大小. 政治大 X-300,Y-300。單一計數 Arc 立的計數框大小（Counting frame size）：X-25,Y-25。. （Counting frame size）：X-165,Y-130。格線（The grid size enter manually）：. ‧ 國. 學. 格線（The grid size enter manually）：X-680,Y-430。以上必須在計數框內可計數到至少五顆細胞為標準，使用 40X 物鏡和 10X 目鏡放大比例計數。CE 值需. ‧. 在 0.2 以內才是錯誤率接受範圍。. sit. y. Nat. n. al. er. io. 11.行為結果分析. i n U. v. 分別計數老鼠在一分鐘內觀察 matched 或 mismatched 物品的時間，標準：. Ch. engchi. 頭有碰到物品或者對物品探索(鼻子朝向物品且鼻子與物品距離不超過老鼠眼睛到鼻子距離的一半)列入計數，身體接觸物品但無觀察物品不計數。. 12.統計分析若比較組別只有兩組，使用 Student’s test 分析。若是三個組別以上時以 SPSS 統計軟體進行單因子變異分析（one-way ANOVA）。P<0.05 表示達顯著差異。. 22.

(29) 13.實驗流程圖. 豐富環境或一般鼠籠環境十週. 購入老鼠. 6. 5. 4. 7. 8. 5.5. 老鼠年紀（月）. 摘除腎上腺手術. 立. 政治行為一個半小時後犧牲大灌流取腦. ‧ 國. 學. 埋管給藥 (Shh、BrdU) 一週. 切片染色. io. n. al. y. ‧. Nat. 行為測試：物品與情境聯合試驗. sit. 3. er. 2. Ch. engchi. 23. i n U. v. 細胞計數分析.

(30) 第三章結果 1.摘除腎上腺後體重變化當大鼠滿三個月為成年時，我們執行雙側腎上腺摘除手術，以此為引發海馬迴顆粒細胞死亡的動物模型，因為摘除腎上腺後葡萄糖皮質素大量減少影響動物攝食，所以依據體重判斷可知道手術是否成功，成功的 ADX 老鼠在手術十週後增加體重不超過 50g。首先大鼠分 Sham 組（n=18）和 ADX 組(n=40)，Sham 組部份觀察到體重隨著手術後週數增加而快速增加；相對的 ADX 組體重保持在一定範圍，並無太大起伏。統計上從手術後第一週開始 Sham 和 ADX 體重明顯差異（手術前:. 政治大. Sham 為 581.47±22.28 克、ADX 為 581.84±11.05 克，p=0.987;手術後第一週: Sham. 立. ＝568.38±21.92 克、ADX＝512.47±8.73 克，p=0.005;手術後第二週: Sham＝. ‧ 國. 學. 598.84±21.48 克、ADX＝510.95±8.22 克，p＜0.001;手術後第三週: Sham＝630.95 ±22.10 克、ADX＝509.48±7.93 克，p＜0.001;手術後第四週: Sham＝657.70±23.05. ‧. 克、ADX＝507.80±8.22 克，p＜0.001;手術後第五週: Sham＝680.13±23.76 克、. y. Nat. sit. ADX＝512.07±8.05 克，p＜0.001;手術後第六週: Sham＝700.11±24.61 克、ADX. n. al. er. io. ＝519.97±8.43 克，p＜0.001;手術後第七週: Sham＝720.11±25.04 克、ADX＝. i n U. v. 522.12±8.50 克，p＜0.001;手術後第八週: Sham＝737.52±25.87 克、ADX＝527.24. Ch. engchi. ±8.59 克，p＜0.001;手術後第九週: Sham＝761.15±26.15 克、ADX＝537.29±8.65 克，p＜0.001;手術後第十週: Sham＝779.80±27.64 克、ADX＝546.32±9.02 克， p＜0.001，Student’s test;圖一），由此結果得知 ADX 手術是成功的。. 24.

(31) 900 850 800. Weight (g). 750 700 650. *. #. 600. *. *. *. *. *. *. *. *. ADX Sham. 550 500 450 1. 2. 立3. 4 5 6 Week(s) after surgery. 7. 8. 9. 10. 學. ‧ 國. 0. 政治大. 圖一、摘除雙邊腎上腺手術後體重變化比較圖，Sham 比 ADX 明顯的增加體重。曲線圖以 mean ± SEM 表示。 # ，p＜0.05;. ‧. *，p＜0.001，Student’s. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 25. i n U. v. test。.

(32) 2.摘除腎上腺後 ADX 與 Sham 細胞數比較因為 ADX 會導致齒狀迴顆粒細胞大量死亡，而在術後三到四個月齒狀迴減少 80%的體積(Sloviter et al., 1989)。除了以腎上腺摘除後十週體重作手術成功依據外，我們比較手術後五個月 ADX 與 Sham 大腦切片以成熟神經細胞表現蛋白 NeuN 做為神經細胞數目指標。圖二為齒狀迴的部份染 NeuN 的比較，可以觀察到圖（B）ADX 染到 NeuN 的量和範圍明顯比圖（A）Sham 少約三分之二的量。從體積測量上，以染到 NeuN 的細胞在齒狀迴做體積測量，由圖三表示 Sham(n=4)組比 ADX（n=6）組的體積有顯著差異（Sham＝1.48±0.04 mm3、ADX＝0.62±0.03 mm3，. 政治大. p＜0.001，Student’s test），由此證明 ADX 手術是成功的。. 立. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 26. i n U. v.

(33) (A)Sham. (B)ADX. 圖二（A、B）分別為 Sham、ADX 大腦切片圖，位置為海馬迴，NeuN 免疫組織染色結果，白色箭頭所指為齒狀迴中顆粒細胞染到 NeuN 的地方，比例尺為 100μm。. 立. ‧ 國 io. 0.8. y. sit. 1. * v i. n. al. er. 1.2. Nat. Volum (mm3). 1.4. ‧. 1.6. 學. 1.8. 政治大. 0.6 0.4. Ch. n U engchi. 0.2 0 SHAM. ADX. 圖三、Sham 與 ADX 齒狀迴體積比較圖，以染到 NeuN 的細胞做體積測量，經 ADX 後的組別齒狀迴的體積明顯的減少。曲線圖以 mean ± SEM 表示。 * ，p＜0.001， Student’s test。. 27.

(34) 3.Shh 與豐富環境恢復 ADX 老鼠之學習記憶能力前面實驗已經確定 ADX 手術成功，接下來進行 pump 埋管手術，依據手術後大鼠居住環境先分成兩類：一般鼠籠環境(C)或豐富環境(E)，而每一類中再分三組：Sham、ADX、ADX-Shh，所以整個實驗共有六組，其中兩組額外添加 Shh 刺激神經新生。不管術後放置於哪一個環境，需十週的時間讓新生成的神經細胞成熟，並且移動到其目的地與原本的神經網絡做結合。當埋管後滿十週進行物品與情境聯合試驗，針對在行為第四天的第三次物品辨識分析，比較六組大鼠對於環境與物品聯合的記憶。圖四我們觀察到 E-ADX-Shh（n=13）組行為表現與 E-Sham(n=10). 政治大 E-ADX(n=9) ANOVA），E-ADX-Shh 組明顯在學習記憶上有恢復的效果。相較之下立組並沒有差別（E-ADX-Shh＝76.39±8.12、E-Sham＝72.59±9.49，p=1，one-way. ‧ 國. 學. 組觀察 mismatch 物品的時間明顯比 E-ADX-Shh 組和 E-Sham 組低（E-ADX＝40.74 ±16.70，與 E-ADX-Shh 相比 p=0.01，與 E-Sham 相比 p= 0.03，one-way ANOVA），. ‧. 由以上可推測經過 Shh 和豐富環境刺激後新生成的神經細胞恢復了海馬迴的功. sit. y. Nat. 能。一般鼠籠環境下的組別發現 C-ADX-Shh(n=10)組與 C-ADX(n=11)組行為表現. al. er. io. 都比 C-Sham(n=10)組觀察 mismatch 物品的時間還低（C-ADX-Shh＝52.14±7.67、. v. n. C-ADX＝54.93±6.81、C-Sham＝75.80±8.21，C-ADX-Shh 與 C-Sham 相比 p= 0.12，. Ch. engchi. i n U. C-ADX 與 C-Sham 相比 p= 0.07，one-way ANOVA）。而在 E-ADX-Shh 組和 C-ADX-Shh 組比較，E-ADX-Shh 組明顯在學習記憶行為上有恢復的效果（E-ADX-Shh＝76.39 ±8.12 、E-ADX-Shh＝52.14±7.67，p=0.04，one-way ANOVA），代表豐富環境對於新生成神經細胞加入神經網絡是重要的過程。從我們實驗結果證明原本在海馬迴之學習記憶有異常的 ADX 老鼠，經過 Shh 和豐富環境刺激後恢復原本海馬迴的學習記憶能力，從過去文獻中探討 Shh 會刺激神經新生，而豐富環境使新生成神經細胞存活，推估是因為這些新生成神經細胞參與海馬迴之學習記憶行為使 ADX 老鼠的學習記憶能力恢復。. 28.

(35) *. percentage of time investigating mismatch object. 100. *. 90. *. 80 70 60 50 40 30 20. 政治大. 10. 立. 0 C-SHAM. C-ADX. C-ADX-SHH. E-SHAM. E-ADX. E-ADX-SHH. ‧ 國. 學. 圖四、學習記憶行為測試-分析一分鐘內對探索 mismatch 物品的時間佔所有探索. ‧. 物品時間的百分比之比較圖。曲線圖以 mean ± SEM 表示。*，p＜0.05。. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 29. i n U. v.

(36) 4.新生成神經細胞參與學習記憶行為（1）新生成細胞比較接下來我們先比較新生成細胞數量上在六組老鼠中是否有差異，當埋管時每一隻大鼠都給予 BrdU，連續標的新生成細胞七天，經過一般鼠籠環境/豐富環境十週後犧牲，以大腦切片觀察在給予 Shh 的第一週所新生成的細胞數有多少在十週後存活下來。圖五為齒狀迴所計數到 BrdU 的數量，我們觀察到 E-ADX-Shh（n=10）組染到 BrdU 的數量與 E-Sham(n=8)組並沒有差別（E-ADX-Shh＝32854.96± 1673.66、E-Sham＝34653.69±2163.21，p= 0.50，one-way ANOVA），相反地. 政治大. E-ADX(n=8)組 BrdU 的數量明顯低於 E-ADX-Shh 組和 E-Sham（E-ADX=14798.91±. 立. 1475.21，與 E-ADX+Shh 相比 p＜0.001，與 E-Sham 相比 p＜0.001，one-way. ‧ 國. 學. ANOVA），代表經過 Shh 和豐富環境刺激後的 ADX 大鼠會有大量的細胞增生而且生存下來。一般鼠籠環境下的組別發現 C-ADX-Shh(n=6)組與 C-ADX(n=7)組觀察到. ‧. BrdU 的數量都比 C-Sham(n=4) 組還低（ C-ADX-Shh=12671.88 ± 855.96 、. y. Nat. sit. C-ADX=13715.56±1469.83、C-Sham＝22030.08±1890.89，C-ADX-Shh 與 C-Sham. n. al. er. io. 相比 p=0.01，C-ADX 與 C-Sham 相比 p= 0.02，one-way ANOVA），而 C-Sham 組. i n U. v. 所觀察到 BrdU 的數量比 E-Sham 組明顯少 22.27%(C-Sham＝22030.08±1890.89、. Ch. engchi. E-Sham＝34653.69±2163.21，p= 0.009，one-way ANOVA)；在都有加 Shh 情況下， E-ADX-Shh 組相較於 C-ADX-Shh 組所觀察到 BrdU 的數量明顯高出 44.3%( E-ADX-Shh＝32854.96±1673.66、C-ADX-Shh＝12671.88±855.96，p＜ 0.001，one-way ANOVA)，代表豐富環境刺激是讓這些新生成細胞存活的關鍵，即使有給予 Shh 而沒有豐富環境還是無法讓新生成細胞存活下來。. 30.

(37) 40000. **. *. *. 35000. No. of BrdU(+) cells. 30000. *. *. 25000 20000 15000 10000 5000 0 C-SHAM. C-ADX. C-ADX-SHH E-SHAM. E-ADX. E-ADX-SHH. 政治大. 圖五、BrdU 計數數目表示新生成細胞數量比較圖。曲線圖以 mean ± SEM 表示。*，. 立. p＜0.05。. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 31. i n U. v.

(38) （2）新生成神經細胞參與行為為了驗證前面的推論，接下來我們要觀察是否新生成的神經細胞是否參與在海馬迴之學習記憶上。我們觀察這些新生成神經細胞是否被海馬迴之學習記憶行為實驗活化，以立即表現基因 Arc 作為指標，判斷這些新生成神經細胞是否參與在其中。在過去研究中發現 Arc 在刺激後會快速表現，在不同刺激上 Arc 表現的時間點會有所不同，但這些文獻中約刺激後一小時以後可以看到 Arc 蛋白質表現比在沒刺激下表現量達顯著差異(Alberi et al., 2011; Messaoudi et al., 2007; Plath et al., 2006)，所以我們觀察行為測試後三十分鐘（n=4）、一個小時（n=4）、. 政治大和一個小時表現量是一樣的，而一個半小時後 Arc 表現量可以看得出比前面兩個立. 一個半小時（n=4）Arc 蛋白表現量。從圖六結果上可以觀察到 Arc 在三十分鐘. ‧ 國. 學. 時間點高（30min=2631159.06±53298.72、1hr=2665766.31±82792.92、1.5hr＝ 3807566.06±74209.63，30min 與 1hr 相比 p=0.70，30min 與 1.5hr 相比 p＜0.001，. ‧. 1hr 與 1.5hr 相比 p＜0.001，one-way ANOVA），最後我們採用一個半小時後的. sit. y. Nat. 時間點作為觀察。我們也比較在行為前一天、第四天行為測試前、第四天行為測. al. er. io. 試後一個半小時後犧牲以上三個不同的時間點觀察 Arc 表現差異。從圖七結果顯. v. n. 示，在正式行為測試前無論是否已經做過行為測試 Arc 表現量並無差異，而在第. Ch. engchi. i n U. 四天行為測試一個半小時後 Arc 才有顯著表現（行為前一天=1715780.58± 78244.52、第四天行為測試前＝1734018.79±47590.24、第四天行為測試後一個半小時後＝3593645.17±62546.31，行為前一天與第四天行為測試前相比 p= 0.81，行為前一天與第四天行為測試後一個半小時後相比 p＜0.001，第四天行為測試前與第四天行為測試後一個半小時後相比 p＜0.001，one-way ANOVA），代表大部分 Arc 是經過學習記憶的行為測試後受刺激才表現出來。圖八為齒狀迴所計數到 BrdU 和 Arc 同時表現之數量，代表在三個月前新生成並參與學習記憶活動之神經細胞，結果如同 BrdU 染色一樣 E-ADX-Shh（n=10）組與 E-Sham(n=8)組都比 E-ADX(n=8)組共同染到 BrdU 和 Arc 數量多（E-ADX-Shh=26052.22±1462.19、 32.

(39) E-Sham＝26618.30±2016.36、E-ADX＝10987.73±1441.78，E-ADX 與 E-ADX-Shh 相比 p＜0.001，E-ADX 與 E-Sham p＜0.001，one-way ANOVA），而 E-ADX-Shh 與 E-Sham 之間沒差異(p=0.80，one-way ANOVA)代表著經過 Shh 和豐富環境刺激後的 ADX 大鼠所生成的神經細胞在學習記憶行為測試後活化，代表著這些新神經細胞大量參與在學習記憶上，推估因為這些新神經細胞大量參與在學習記憶上，所以恢復了海馬迴之學習記憶功能。一般鼠籠環境下的組別也是如同 BrdU 染色一樣，C-ADX-Shh(n=6)組與 C-ADX(n=7)組觀察到共同染到 BrdU 和 Arc 數量都比 C-Sham(n=4)組還低（C-ADX-Shh＝9194.71±529.76、C-ADX＝11863.72±2217.45、. 治政大組相較於相比 p= 0.02，one-way ANOVA）。在都有加 Shh 情況下，E-ADX-Shh 立 C-Sham＝16980.89±1881.16，C-ADX-Shh 與 C-Sham 相比 p=0.01，C-ADX 與 C-Sham. C-ADX-Shh 組所觀察到 BrdU 和 Arc 共同染到的數量明顯高出 47.8%( E-ADX-Shh. ‧ 國. 學. ＝26052.22±1462.19、C-ADX-Shh＝9194.71±529.76，p＜0.001，one-way ANOVA)，. n. al. er. io. sit. y. Nat. 成細胞存活下來，而參與行為的新神經細胞相對少很多。. ‧. 代表當沒有豐富環境刺激讓這些新生成細胞存活，即使有給予 Shh 也無法讓新生. Ch. engchi. 33. i n U. v.

(40) *. 4500000 4000000. *. No. of Arc(+) cells. 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 30min. 1hr. 1.5hr. 政治大. 圖六、行為測試後不同時間點之 Arc 蛋白表現。在行為測試後 30 分鐘、1 小時、. 立. 1 個半小時做犧牲，觀察不同時間點 Arc 表現量的差異。曲線圖以 mean ± SEM 表. ‧ 國. 學. 示。*，p＜0.001。. No. of Arc(+) cells. sit. *. er. al. y. ‧. 2500000. *. n. 3000000. io. 3500000. Nat. 4000000. Ch. 2000000. engchi. i n U. v. 1500000 1000000 500000 0 Day1 before behavior. Day4 before behavior. Day4 1.5hr after test. 圖七、在行為測試不同時間點做 Arc 蛋白表現觀察。在行為前一天、第四天行為測試前、第四天行為測試後一個半小時後犧牲，觀察 Arc 表現量的差異。曲線圖以 mean ± SEM 表示。*，p＜0.001。 34.

(41) No. of BrdU(+) Arc(+) cells. 40000. *. * *. 35000. *. 30000. *. 25000. *. 20000 15000 10000 5000 0 C-SHAM. C-ADX. C-ADX-SHH E-SHAM. E-ADX. E-ADX-SHH. 政治大. 圖八、Arc 與 BrdU 同時被計數的數目表示新生成細胞有活化數量比較圖。曲線. 立. 圖以 mean ± SEM 表示。 * ，p＜0.05，one-way ANOVA。. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 35. i n U. v.

(42) （3）成熟之新生成神經細胞大量活化當我們發現大部分的新生成神經細胞參與在學習記憶中，接下來要探討這些細胞是否在成熟階段被活化。我們利用 NeuN （ Neuronal Nuclei ）和 DCX （Doublecortin ）分別代表著成熟和未成熟神經細胞，觀察同時與 BrdU（新生成細胞）和 Arc（有活化的細胞）染到的狀況。. a.成熟之新生成神經細胞從圖九觀察各組的染色趨勢都與先前染色情形類似，E-ADX-Shh（n=10）組. 政治大. 與 E-Sham(n=8)組都比 E-ADX(n=8)組共同染到 NeuN、Arc、BrdU 三個染劑細胞數. 立. 量多（E-ADX-Shh=22245.92±1261.81、E-Sham＝22499.18±2268.64、E-ADX＝. ‧ 國. 學. 9550.64±1270.26，E-ADX 與 E-ADX-Shh 相比 p＜0.001，E-ADX 與 E-Sham p＜0.001， one-way ANOVA），而 E-ADX-Shh 和 E-Sham 之間是沒有差異（p=0.90，one-way. ‧. ANOVA），代表著經過經過 Shh 和豐富環境刺激後的 ADX 大鼠所生成的神經細胞。. y. Nat. sit. 一般鼠籠環境下 C-ADX-Shh(n=6)組與 C-ADX(n=7)組觀察到共同染到 NeuN、Arc、. n. al. er. io. BrdU 細胞數量比 C-Sham(n=4)組還低（C-ADX-Shh＝7161.60±642.95、C-ADX＝. i n U. v. 8859.52±1830.52、C-Sham＝14722.54±2023.05，C-ADX-Shh 與 C-Sham 相比 p=0.01，. Ch. engchi. C-ADX 與 C-Sham 相比 p= 0.03，one-way ANOVA）。在一般鼠籠組，新生成成熟神經細胞參與活動的個數，在 ADX 組並未因 Shh 處理而增加，但是給了 Shh 並加上生活在豐富環境中，則經過 ADX 手術的老鼠，其個數回到與 Sham 相同的水平。從圖十中觀察每一組在染到 BrdU 的細胞中共同染到 NeuN 與 Arc 的數量佔的比例有六成三（E-ADX-Shh 組：67.7%,E-Sham 組:64.6%,E-ADX 組:63.7%,C-ADX-Shh 組:57.0%,C-ADX 組:60.1%,C-Sham 組：66.3%），代表此區域新生成的細胞約有六成三的比例，在成熟階段下參與在海馬迴學習記憶功能。從圖十一觀察沒活化之成熟新生成神經細胞，可以發現每一組細胞數量相較於圖九少很多，所以大部分成熟新生成神經細胞是有參與活動。而在圖十二有被活化的新生成神經細胞中為 36.

(43) 成熟階段的細胞佔有八成四比例（E-ADX-Shh 組：85.6%,E-Sham 組:83.7%,E-ADX 組:83.3%,C-ADX-Shh 組:77.7%,C-ADX 組:86.8%,C-Sham 組：86.1%），代表新生成的成熟神經細胞參與在海馬迴學習記憶功能有高達八成四比例。圖十三到十五為實際各組染色狀況。. 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 37. i n U. v.

(44) No. of BrdU(+) Arc(+) NeuN(+) cells. 40000. *. * *. 35000. *. 30000 25000 20000. *. *. 15000 10000 5000 0. 政治大. 圖九、NeuN、Arc、BrdU 同時被計數的數目表示成熟階段的新生成神經細胞有活. 立. 化數量比較圖。曲線圖以 mean ± SEM 表示。 * ，p＜0.05，one-way ANOVA。. y. sit er. percentage of BrdU(+) Arc(+) NeuN(+)/BrdU(+). ‧. ‧ 國. 學. al. n. 80. io. 90. Nat. 100. 70 60. Ch. engchi. i n U. v. 50 40 30 20 10 0 C-SHAM. C-ADX. C-ADX-SHH E-SHAM. E-ADX. E-ADX-SHH. 圖十、以在計數到 BrdU 的細胞中同時染到 NeuN 與 Arc 的比例表示新生成細胞中因海馬迴之學習記憶試驗有活化的新生成神經細胞比例圖。曲線圖以 mean ± SEM 表示。 38.

(45) No. of BrdU(+) Arc(-) NeuN(+) cells. 40000 35000 30000 25000 20000 15000. *. 10000 5000 0. 政治大. 圖十一、BrdU 和 NeuN 同時被計數的數目表示成熟階段的新生成神經細胞沒有活. 立. 化數量比較圖。曲線圖以 mean ± SEM 表示。 *，p＜0.05，one-way ANOVA。. y. sit. al. er. 80. n. percentage of BrdU(+) Arc(+) NeuN(+) / Arc(+) BrdU(+). ‧. ‧ 國. 學. io. 90. Nat. 100. 70 60. Ch. engchi. i n U. v. 50 40 30 20 10 0 C-SHAM. C-ADX. C-ADX-SHH E-SHAM. E-ADX. E-ADX-SHH. 圖十二、以在計數到 BrdU 和 Arc 的細胞中同時染到 NeuN 的比例表示在海馬迴之學習記憶試驗有活化的新生成神經細胞為成熟階段的比例圖。曲線圖以 mean ± SEM 表示。 39.

(46) (B). (A). 立. (C). 政治大 (D). ‧ 國. 學. 圖十三、E-ADX組染色圖（A）BrdU:紅色（B）Arc：綠色（C）NeuN:藍色（D）BrdU、 Arc、NeuN染色結合圖。白色箭頭所指三種抗體皆有染到。. ‧. n. er. io. sit. y. Nat. al. (A). Ch. e n g(B) chi. (C). i n U. v. (D). 圖十四、E-ADX-Shh 組染色圖（A）BrdU:紅色（B）Arc：綠色（C）NeuN:藍色（D） BrdU、Arc、NeuN 染色結合圖。白色箭頭所指三種抗體皆有染到，黃色箭頭所指 BrdU、Arc 共同染到。 40.

(47) (B). (A). 立. (C). 政治大 (D). ‧ 國. 學. 圖十五、E-Sham 組染色圖（A）BrdU:紅色（B）Arc：綠色（C）NeuN:藍色（D） BrdU、Arc、NeuN 染色結合圖。白色箭頭所指三種抗體皆有染到，黃色箭頭所指. ‧. BrdU、Arc 共同染到，紅箭頭所指只有 BrdU。. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. 41. i n U. v.