3-1 研究流程
本研究之研究流程如圖3-1 所示。首先，經過大範圍搜尋相關資訊 後建立研究動機，利用農業廢棄物－稻殼中之豐富纖維素成為生質酒 精之原料，達到稻殼回收再利用之目的；接著做細部文獻資料的回顧 整理，再來建立前處理方法架構和酵素水解系統。將稻殼以不同濃度 或無氫氟酸(HF)處理後之固體部分以清水洗淨後進行成分分析，而液 體部分則回收再利用，根據Kwon et al.(1999)、楊宏智等(2007)與本研 究室研究團隊研究，利用氫氟酸處理稻殼過後之液體富含大量矽氟酸，
經後續可做為吸附材或觸媒等矽基材料，此為其他酸前處理稻殼所沒 有之優點。接著再探討過氧化氫與氫氧化鈉添加比例及鹼性過氧化氫 (Alkaline peroxide)添加量處理稻殼，之後以清水洗淨過濾，其固體部分 進行成分分析，再以酵素水解方式將其分解為單醣，水解後之糖液以 HPLC 測量；最後則探討稻殼經不同參數之前處理後之木質素去除率與 葡萄糖產率，主要探討經由對稻殼做前處理，將稻殼內之灰分及木質 素成功去除，使之對纖維素束縛降至最低，讓纖維水解酵素得以完全 將纖維素水解為葡萄單醣。而原物料、氫氟酸及鹼性過氧化氫處理過 後物料之表面型態與結構則由SEM 做鑑定與比較。
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3-2 實驗儀器及藥品 3-2-1 實驗儀器
表3-1 為本研究所使用之實驗儀器名稱、型號及廠牌：
表 3-1 本研究所使用之實驗儀器設備
實驗儀器 型號 廠牌 製造地
高溫爐 A-550 VULCAN US
酸鹼度計 HTC-201U HOTEC Taiwan 程式溫度控制器
GX-66S YSC Taiwan 加熱攪拌器
HS7 IKA Germany 精密電子天秤
XS 225A Precisa Switzerland 高效能液相層析儀
YL9100 YOUNG LIN Korea 紫外/可見光光譜分析儀
U3012 HITACHI Japen 穿透式電子顯微鏡
JEM-2100 JEOL Japen 掃描式電子顯微鏡
S-4700 HITACHI Japen
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3-2-1-1 高效能液相層析儀（High Performance Liquid-chromatograph ， HPLC）
HPLC 分析是利用動相通過靜相時，混合物中的各成份在靜相和動 相之間的分布係數不相同即為親和力不同，使其在管柱中的滯留時間 不相同而分離的方法。若化合物與靜相親和力較強，則沖提較慢即為 滯留時間長，而化合物與動相的親和力較強，則沖提較快即為滯留時 間短，依此原理將樣品中的標的待測物與干擾物分離(Sawyer et al.
2002)。
本研究使用YL9100 HPLC 之儀器來進行醣液分析，而檢測器為折 射率檢測器（Refractive Index Detector，RI），由於待測物為醣類，其 折射率較大，因此使用此檢測器較適合，隨機設備包含：自動除泡裝 置（Vacuum Degasser）、管柱控溫裝置（Column Compartment）、送液 幫浦（Quaternary Pump）。
3-2-1-2 紫外/可見光光譜分析儀（UV-Vis spectrophotometer）
當物質中的分子吸收了入射光中之特定波長光能量時，分子中的價 電子或鍵結電子將會提升到較高能量軌域中；然而，各種物質皆有不 同之分子及原子和獨特分子空間結構，其吸收光能量之情況也皆不同，
因此，每種物質便有其特有的、固定的吸收光譜曲線，進而根據吸收 光譜上某些特徵波長處之吸光度高低判別或測定該物質之含量。其主 要定量分析基礎為Lambert-Beer law，即物質一定濃度的吸光度與其吸 收介質的厚度呈正比。
本 實 驗 所 使 用 之 分 光 光 譜 儀 型 號 為 HITACHI U3012 UV/VIS Spectrophotometer 來測得斐林試劑與還原醣作用後，在 590 nm 波長下
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讀取吸光值(Sawyer et al. 2002)。
3-2-1-3 掃描式電子顯微鏡（Scanning Electron Microscopy，SEM）
SEM 的原理為利用加熱燈絲發射電子經由柵極聚焦，形成約幾十 毫米大小的點光源，在陽極加速電壓經由 2 到 3 個電磁透鏡組成的電 子光學系統匯聚成一細小約幾奈米之電子射束至樣品表面，在末端透 鏡上裝有掃描線圈，使電子射束在樣品上進行掃描，透過高能電子射 束與電子交互作用產生各種電子訊號，訊號經由偵測器接收後經由放 大器放大，然後送到顯像管成像，可觀察樣品表面型態。
本研究利用交通大學貴儀中心之Hitachi S-4700 高解析度場發射掃 描電子顯微鏡(HR-SEM)觀察樣品表面型態
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3-2-2 實驗藥品
表3-2 為本研究所使用之實驗藥品名稱、化學式及廠牌：
表 3-2 本研究所使用之實驗藥品
名稱 化學式 廠牌 等級
Sodium lauryl sulfate NaC12H25SO4 SIGMA 試藥級 EDTA C10H16N2O8 SIGMA 試藥級 Sodium tetraborate decahydrate Na2B4O7.10(H2O) SIGMA 試藥級 Sodium phosphate dibasic Na2HPO4 SIGMA 試藥級 Triethylene glycol H(OCH2CH2)3OH Alfa Aesar 試藥級
CTAB C19H42BrN Alfa Aesar 試藥級
Sulfuric acid H2SO4 SIGMA 試藥級
Acetone C3H6O J.T.Baker 試藥級
Hydrofluoric acid 47~51%HF SIGMA 試藥級 Hydrogen peroxide 34.5~36.5%(w/w) H2O2 SIGMA 試藥級
Sodium hydroxide NaOH J.T.Baker 試藥級
Citric acid C6H8O7‧H2O J.T.Baker 試藥級 Sodium acetate CH3COONa‧3H2O SIGMA 試藥級
D(+)Xylose C5H10O5 SIGMA 試藥級
D(+)Glucose C6H12O6 SIGMA 試藥級
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 - SIGMA 試藥級 Cellulase from Aspergillus sp. - SIGMA 試藥級 Cellobiase from Aspergillus niger - SIGMA 試藥級 Fehling's solution Ⅰ&Ⅱ - Fluka 試藥級
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3-3 實驗方法
本研究之實驗包含成分分析、表面與結構分析、氫氟酸與鹼性過氧 化氫之前處理、酵素選用、酵素活性測試以及酵素水解。
3-3-1 標準曲線之建立
本研究利用 HPLC 來標定糖液標準品之檢量線以供研究分析各種 糖液（如葡萄糖和木糖）之濃度。
HPLC 操作參數條件如下：
儀器內之管柱為RozexTM 8 μm ROA-Oraganic Acid，將管柱溫 度設為60 ℃，以 10 mM 之硝酸為載流液，流速為 0.6 mL/min，
以0.22 μm 過濾頭過濾樣品溶液，再由注射針取 20 μL 過濾 液於HPLC。
本研究還利用斐林試劑做還原醣標準曲線(Megawati et al. 2007)以 供酵素活性測試，主要配製葡萄糖標準品。
斐林試劑量測還原醣之方法如下：
取一固定量之斐林試劑Ⅰ與Ⅱ液與葡萄糖標準品混合，於沸水 浴中加熱 15min，取出後以自來水冷卻。取上澄液，用分光光 度計在590nm 波長下比色，以蒸餾水作對照，讀取不同濃度糖 吸光度為横坐標，對應的糖含量為縱坐標，繪製標準曲線。
3-3-2 稻殼成分分析
原料、前處理物與殘留物等固體之測定項目包括：纖維素(Cellulose)、
半纖維素(Hemicellulose)、木質素(Lignin)、灰分(Ash)與其他(Other)等 之含量。
將稻殼中之纖維素（六聚醣）與半纖維素（五聚醣）換算成葡萄糖
（六碳醣）及木糖（五碳醣）之公式主要參考Megawati et al. (2007)推
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導之公式以及其重量換算比如下：
nC5H8O4 + H2O → nC5H10O5 （3-1）
1 g ： 1.136 g
nC6H10O5 + H2O → nC6H12O6 （3-2）
1 g ： 1.111 g
測量方法主要參考Van Soest et al. (1991)所研發出之纖維素、半纖 維素、木質素與灰分含量測定步驟，測定所需之中洗液與酸洗液配方 如表3-3 及 3-4 所示；其中中洗液主要能溶出木質纖維素中其他的部分，
例如蛋白質、脂肪、樹脂及細胞物質等，經過中洗液處理過之木質纖 維素稱為中洗纖維，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質素及灰分；
而酸洗液主要能去除木質纖維素中半纖維素及其他的部分，使其成為 酸洗纖維，成分為纖維素、木質素與灰分；若將酸洗纖維以 72 %之 H2SO4處理，則此木質纖維素稱為酸洗木質素，其成分為木質素與灰分，
再經過高溫鍛燒後使木質素揮發，便成為木質纖維素灰分之部分。
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表 3-3 中洗溶液之成分
名稱 每1000 mL 之含量
Sodium lauryl sulfate 30 g
EDTA 18.61 g
Sodium tetraborate decahydrate 6.81 g Sodium phosphate dibasic 4.56 g Triethylene glycol 10 mL
表 3-4 酸洗溶液之成分
名稱 每1000 mL 之含量
CTAB 20 g
H2SO4 28 ml
含量測定步驟如下：
1. 中洗纖維(Neutral Detergent Fiber，NDF)之含量：取 1 g 之樣本加 入 100 mL 之中洗溶液，加熱沸騰 5~10 分鐘，然後降低火強度，
並保持沸騰狀態 60 分鐘，接著使用預先稱重之濾紙進行真空抽氣 過濾，再以90 ºC 之熱水清洗、過濾，然後以丙酮(Acetone)清洗、
過濾，最後於低溫烤箱（100 ℃）中烘乾 24 小時，放入乾燥器中 冷卻後，秤重並計算中洗纖維之含量。
2. 酸洗纖維(Acid Detergent Fiber, ADF)之含量：取 1 g 之樣本加入 100 mL 之酸洗溶液，加熱沸騰 5~10 分鐘，然後降低火強度，並保持 沸騰狀態 60 分鐘，接著使用預先稱重之濾紙進行真空抽氣過濾，
再以90 ℃之熱水清洗、過濾，然後以丙酮(Acetone)清洗、過濾，
最後於低溫烤箱（100 ℃）中烘乾 24 小時，放入乾燥器中冷卻後，
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秤重並計算酸洗纖維之含量。
3. 酸洗木質素(Acid Detergent Lignin，ADL)之含量：延續酸洗纖維之 實驗，將酸洗纖維加入25 mL、72 %之 H2SO4 並攪拌，之後每小 時加入2 mL、72 %之 H2SO4，連續3 小時，接著使用預先稱重之 濾紙進行真空抽氣過濾，然後以90 ℃之熱水清洗並過濾，再於低 溫烤箱（100 ℃）中烘乾 24 小時，放入乾燥器中冷卻後，秤重並 計算酸洗木質素含量。
4. 灰分(Ash)含量：延續酸洗木質素之實驗，將所得之酸洗木質素放 入高溫烤箱（600 ℃）灰化 4 小時後取出，放入乾燥中冷卻並秤得 灰分之重量。
5. 計算半纖維素含量：樣品中中洗纖維與酸洗纖維之差值，即為半纖 維素之含量。
6. 計算纖維素含量：樣品中酸洗纖維與酸洗木質素之差值即為纖維素 之含量。
7. 計算木質素含量：樣品中酸洗木質素與灰分之差值即為木質素之含 量。
8. 計算其他含量：樣品中原始重量與中洗纖維之差質即為萃取物與水 之含量。
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3-3-3 稻殼前處理
稻穀取自於宜蘭員山鄉，以粉碎機磨碎，收集100 mesh 以上之碎 屑，接著測試其基本性質。
3-3-3-1 氫氟酸前處理
氫氟酸前處理流程如圖3-2，取 5 g 之稻殼碎屑置入鐵氟龍燒杯裡，
分別加入30 mL 之去離子水，均勻攪拌十五分鐘後便加入不同容量之 氫氟酸，使其容量與稻殼內之含矽莫耳比分別為4、6、8、10、12、14、
16、18，而表示方法為 nHF/nSi。待反應時間結束後取出以5000 rpm 離 心10 分鐘，分離液體與固體，將液體回收保存；固體部分則利用約一 公升之蒸餾水以抽氣過濾法重複清洗。洗淨後放入80 ℃烘箱乾燥，以 備酵素水解以及下一階段之鹼性過氧化氫處理法所用。
圖 3-2 氫氟酸前處理流程圖
3-3-3-2 鹼性過氧化氫前處理
鹼性過氧化氫由不同過氧化氫與氫氧化鈉之添加比例配製（1、2 、 3、4、5、6、8、10），本實驗固定 H2O2使用濃度為 1%，以 RNaOH/RH2O2
Centrifuge
Aspirator Oven
Solid
Solution
Silica recycle Teflon Beaker
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表示；待得出最佳添加比例後再測試鹼性過氧化氫之最佳添加量(1、2、
3、4)，劑量 1 為使用 1% H2O2 4% NaOH，2 為使用 2% H2O2 8% NaOH，
3 為使用 3% H2O2 12% NaOH，4 為使用 4% H2O2 16% NaOH，以 Alkaline H2O2 Dosage 表示；如圖 3-3，取適量經過不同量氫氟酸處理之稻殼碎 屑置入燒瓶內，分別加入不同添加比例及添加量之過鹼性過氧化氫，
使其固液比為10%（w/v），於 80 ℃恆溫油浴槽中反應四十五分鐘。待
使其固液比為10%（w/v），於 80 ℃恆溫油浴槽中反應四十五分鐘。待