4-1 稻殼成分分析
生質能源之原料選別在於其纖維素及半纖維素多寡，而稻殼是農業 廢棄物中容易取得的木質纖維素之一，又稻殼成分會因地方、氣候、
品種有些許變異，因此藉由原料成分分析了解稻殼之組成，以便判斷 此是否為具有發展力之木質纖維素以及成為後續葡萄糖產率之重要指 標。
本研究參考Van Soest et al. (1991)之稻殼成分分析方法，主要分析 項目有纖維素(Cellulose)、半纖維素(Hemicellulose)、木質素(Lignin)、
灰分(Ash)以及其他(Other)成分（水分及一些可萃取物），分析結果如表 4-1 所示。
分析結果顯示，稻殼中之半纖維素含量為21.45 %，纖維素含量為 36.37 %，木質素含量為 21.32 %，灰分含量為 11.22 %，而其他含量為 9.64 %。此實驗結果與 Qu et al. (2010)發表之稻殼成分相似，但本實驗 結果之灰分含量較低，應是產地不同所造成，而也將成為後續前處理 實驗考量因素之一。
表 4-1 稻殼成分分析結果
Constituent Content（wt%）
Hemicellulose 21.45%
Cellulose 36.37%
Lignin 21.32%
Ash 11.22%
Other 9.64%
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4-2 不同纖維水解酵素之水解稻殼測試
目前纖維水解酵素已有許多商業化的產品，然而不同來源之酵素對 於不同型式存在之纖維素會有不同的效用；實驗所得最終產物為單醣 分子，標準品由HPLC 在設定操作條件為：管柱使用 RozexTM 8 μm ROA-Oraganic Acid，將管柱溫度設為 60 ℃，以 10 mM 之硝酸為載流 液，流速為0.6 mL/min，其所得之曲線如圖 4-1 所示。實驗結果顯示，
葡萄糖(Glucose)曲線於約十分鐘前段左右（607 sec）出現，而木糖 (Xylose)曲線則約在十分鐘後段左右（648 sec）出現，其誤差值須小於 6 sec，由此可知在實驗設定條件下能明確分開兩種標準品之曲線，以 供辨識。
圖 4-1 單醣分子之 HPLC 位置圖
607 648
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4-2-1 單醣濃度標準曲線製作
本實驗利用HPLC 測定酵素水解後之單醣溶液，實際開始前須先製 作單醣濃度標準曲線，其目標物為葡萄糖及木糖。
圖4-2 為利用 HPLC 製作之單醣濃度標準曲線圖，由圖可知所測得 之標準曲線皆符合R2 ≧ 0.995，因此，後續酵素水解之單醣皆可依據 此標準曲線作濃度之推算。
圖 4-2 利用 HPLC 製作單醣濃度標準曲線圖
*為單醣顯示於 HPLC 曲線之積分面積
4-2-2 型號“Cellulase from Aspergillus sp.”之纖維水解酵素
本實驗探討型號為“Cellulase from Aspergillus sp.”之纖維水解酵 素對原始稻殼進行水解反應，實驗結果如圖4-3，實驗空白為酵素本身 成分，在與稻殼水解同一操作環境下自行增加之單醣量，其製作為設 定兩反應槽作水解反應，其一無添加稻殼另一則有；由單醣分子之
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HPLC 波峰（圖 4-1）得知葡萄糖及木糖在相同設定條件下出現之時間 位置應為（607 sec 和 648 sec），然而此實驗結果顯示在 587sec 時出現 一小未知波峰，但在607±6 sec 和 648±6 sec 時間並無出現預計之葡萄 糖及木糖波峰；推測因為此型號之酵素缺少了外切型水解酵素，對於 纖維素之結晶區作用效力低，因而無法順利水解成單醣分子，因此，
後續之實驗將不以此型號酵素作水解反應。
圖 4-3 利用型號“Cellulase from Aspergillus sp.”纖維水解酵素水解 原始稻殼之 HPLC 曲線圖
4-2-3 型號“ Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921”之纖維 水解酵素
本實驗探討型號為“Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921”
之纖維水解酵素對原始稻殼進行水解反應，實驗結果如圖4-4，將實驗 結果與單醣分子之HPLC 位置曲線圖比對可知在 607 sec 有葡萄糖曲線
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出現，後續實驗便會使用此型號之纖維水解酵素作水解反應；若扣除 實驗空白則可得到酵素之淨醣產量，由實驗結果得知其醣產量極少，
證明原始稻殼在無前處理條件下直接水解之效率極低。
圖 4-4 利用型號“Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921”
纖維水解酵素水解原始稻殼之 HPLC 曲線圖
4-2-4 有無 Cellobiase 測試
本實驗主要參考Selig and Weiss (2008)在美國國家再生能源實驗室 (NREL)所公佈以及 Tao et al. (2011)之纖維素水解實驗方法，而其中有 添加Sigma-Aldrich Inc.生產分別由 Trichoderma reesei 與 Aspergillus
niger 菌種取出之纖維水解酵素及纖維雙醣酵素；實驗空白是不添加稻
殼，為酵素本身成分緣故，與稻殼水解實驗同一操作環境下自行增加 之單醣量；而實驗主要利用未經處理之原始稻殼作水解，實驗結果如 圖4-5。606
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由空白實驗結果發現纖維水解酵素與纖維雙醣酵素本身皆有葡萄 糖產量，尤其是纖維雙醣酵素，本身即產生些許木糖產量；在水解稻 殼之實驗中，有添加纖維雙醣酵素之實驗其醣產出總量明顯高於未添 加之對照組，其皆未扣除空白實驗，但若將分別之空白組醣產量減去，
則有無添加纖維雙醣酵素之實驗其醣產量相似。因此本研究後續之酵 素水解實驗皆不添加纖維雙醣酵素，以降低水解成本。
圖 4-5 有無添加纖維雙醣酵素及其空白對照組之醣產量比較圖
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4-3 酵素活性測試分析結果
每一批生產之酵素會因為一些物理、化學或是運送及保存過程中，
有些許之活性差異，為求實驗準確性，在做酵素水解之前，必須先測 定酵素活性，並需定期測定。酵素活性測定之實驗主要為參考美國國 家再生能源實驗室(NREL)所公佈之實驗標準方法，實驗所使用之酵素 型號為“Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921”，因此先測其 酵素活性。
在測定酵素活性之前，需先利用葡萄糖做還原醣標準曲線，測定方 法為斐林試劑法，且設定還原醣之吸光值為590 nm，如圖 4-6 所示；
接著，以不同酵素濃度對已知量之纖維素作反應，並用分光光度計測 定其吸光值後與葡萄糖標準曲線進行比對，換算出相當值之還原醣量，
最後將不同酵素濃度與對應之還原醣量作出一標準曲線，如圖 4-7 所 示。
由實驗結果計算釋放出2 mg 還原醣之酵素濃度，將其代入(3-3)公 式中，便可得到實驗所需之酵素活性約為125 FPU/mL。
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圖 4-6 葡萄糖含量對吸光度標準曲線
圖 4-7 酵素濃度對葡萄糖產出量之標準曲線
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4-4 氫氟酸浸泡前處理
鑒於木質纖維素中之穩固結構，纖維水解酵素時會遇到立體空間障 礙以及木質素包覆之問題，因而造成在未經處理之木質纖維素原料在 水解時，葡萄醣產率會非常地差。因此，本實驗先採用氫氟酸(HF)前 處理步驟，希望初步鬆散木質纖維素原料原始緊密的結構，使酵素更 易滲入稻殼並與纖維素作用，進而提升酵素水解之效率；另外，又可 將反應之含矽溶液回收再利用，做為矽基材料如吸附劑／觸媒之前趨 液。
4-4-1 HF 浸泡濃度對稻殼成分之影響
本實驗利用不同濃度HF 處理稻殼之條件下，對稻殼成分中之半纖 維素(Hemicellulase)、纖維素(Cellulse)、木質素(Lignin)、灰分(Ash)、
其他(Other)及總重量(Total weight)之成分改變作探討，結果如表 4-2 與 表4-3 所示。由實驗結果得知，以原始稻殼為基準，比較各成分經 HF 處理後之重量變化百分比，隨著HF 添加比例增加，其總重量損失便隨 之提升；其中，損失程度最明顯之成分為灰分，在HF 與二氧化矽莫耳 比為12 時，其灰分就明顯損失 85%以上（表 4-2），其由原先的 11.22%
含量降為1%（表 4-3），至莫耳比為 14 及 16 時，灰分則損失至 90%以 上（表4-2）。半纖維素與其他成分在接觸 HF 處理後皆有些微損失，但 其損失幅度不隨HF 添加比例增加而增加，因此對纖維素之影響仍存在；
然而稻殼中之纖維素受HF 影響小，經處理後其成分並無明顯損失，因 此HF 並不會使葡萄糖產量造成損失；而又比較不同濃度 HF 處理之各 別稻殼成分百分比，得知其單位重量之稻殼半纖維素及纖維素含量上 升，提高後續實驗之醣產量；稻殼中之木質素經過HF 前處理，只有些 許減少並無明顯改變，故後續實驗應將稻殼再經過去除木質素之前處
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醣產率皆有提升，但與其他稀酸處理比較（約60%）(Roberto et al. 2003；
Karimia et al. 2006)，其幅度略小，推論為主要束縛酵素作用之木質素 仍堅固地存在稻殼中，因此，後續便將莫耳比14 處理過的稻殼再以鹼 性過氧化氫處理，以達去除木質素使處理後與原始葡萄醣產率提升之 目的。
圖 4-8 不同濃度之 HF 處理稻殼經酵素水解後之醣產量 nHF/nSi為稻殼內二氧化矽與 HF 使用之莫耳比，本實 驗固定二氧化矽之使用莫耳數
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圖 4-9 不同濃度之 HF 處理稻殼經酵素水解後之處理後與原始葡萄醣 產率。nHF/nSi為稻殼內二氧化矽與HF 使用之莫耳比，本實驗 固定二氧化矽使用之莫耳數
4-5 HF 搭配鹼性過氧化氫前處理
稻殼經過HF 處理過後雖可幾乎完全去除灰分，但卻無法完全破壞 木質素，因此本實驗利用前一節以最佳HF 濃度浸泡處理所得之稻殼；
之後以鹼性過氧化氫(Alkaline peroxide)再次前處理，使稻殼中木質素被 去除以利酵素水解產醣，提升葡萄糖產率；而反應時間與溫度則參考 Yang et al. (2001)測試之結果。
4-5-1 H2O2與 NaOH 各別作用對稻殼成分及酵素水解之影響
Alkaline peroxide 主要使用 NaOH 來調製，亦即 Alkaline peroxide 包含 H2O2 及 NaOH 兩種化學藥劑，比較文獻處理效率得知 Alkaline peroxide 之處理效率較單獨使用 H2O2 或 NaOH 來得好(Gould, J. M.
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1984)，因此本實驗將探討分別使用 Alkaline peroxide、H2O2及 NaOH 處理過後之稻殼成分及其酵素水解後醣產量和葡萄糖產率的比較。
由表4-4 得知稻殼在不同參數處理過後之成分變化，與只有 HF 處 理過之稻殼比較，經Alkaline peroxide 處理，除了纖維素之外的成分皆 明顯減少，因而使處理過後之稻殼以纖維素為主，其成分百分比高達 80%；而分別使用 NaOH 或 H2O2 處理則其成分改變情形並不如使用 Alkaline peroxide 處理的稻殼明顯；又由圖 4-10 得知，使用 Alkaline peroxide 處理的稻殼其酵素水解醣產量明顯高於單獨使用 NaOH 或 H2O2，而單獨使用 H2O2處理稻殼的酵素醣產量甚至與 HF 處理過之稻 殼的酵素醣產量相比則無明顯增加； Gould, J. M. (1984)指出，H2O2
在鹼性情況下其氧化作用較為劇烈，推論能溶解較多的木質素與半纖 維素，使纖維素百分比與酵素水解醣產量提升，證明Alkaline peroxide 處理效用較單獨使用NaOH 或 H2O2明顯較好。
在鹼性情況下其氧化作用較為劇烈，推論能溶解較多的木質素與半纖 維素，使纖維素百分比與酵素水解醣產量提升，證明Alkaline peroxide 處理效用較單獨使用NaOH 或 H2O2明顯較好。