2-1 實驗材料
2-1-1 化學藥品與材料
Acetic acid (Merck)
40% Acrylamide (GE Healthcare) Agarose (USB)
APS (GE Healthcare)
2,2,-azino-bis(3-ethybenthiazoline 6-sulfonic acid) (ABTS) (Sigma) BactoTM Agar (DIFCO)
Bromophenol blue (USB) Citric acid (Sigma)
Coomassie® Brilliant blue R 250 (Merck) Dimethyl sulfoxide (MP Biomedicals) DEAE sepherose (Bio-Rad)
Dodecyl sulfate sodium salt (Merck)
dNTP Set, 100 mM Solutions (GE Healthcare) Ethylenediamine-tetraacetic acid (Merck) Glycerol (Merck)
Glycine (Merck)
Guanidine hydrochloride (Gdm-HCl) (Sigma) Hydrogen chloride (Merck)
IPTG (GeneMark, Taiwan) Kanamycin sulfate (USB)
LB Broth, Miller (DIFCO) 2-mercaptoethanol (Merck) Methanol (Merck)
N,N’-methylene-bis-acrylamide (Bis-Acrylamide)(Sigma) Potassium chloride (Merck)
Potassium diphosphate (Merck) Potassium phosphate (Merck) Primers (Bio Basic Inc., Taiwan)
Restriction enzymes (New England Biolabs) Sodium azide (Merck)
Sodium chloride (AMRESCO) Sodium hydroxide (Merck) Sodium diphosphate (Merck) Sodium phosphate (Merck) SYBR® Green I (Roche) T4 DNA ligase (Promega) TEMED (GE Healthcare) Tris base (USB)
BCA Protein Assay Reagent and Albumin Standard (PIERCE) BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)
GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) LMW-SDS Marker Kit (GE Healthcare)
Plasmid Miniprep Purification Kit (GeneMark)
rTth DNA polymerase, XL & XL Buffer II Pack (Applied
Biosystems)
QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)
2-1-2 緩衝液及溶液配製
50X TAE Buffer：
242 g Tris base、57.1 mL acetic acid、0.5M EDTA 加水至體積為 1 L，調 pH 至 8.5，儲存於室溫。使用時稀釋成 1 X 並調 pH 至 7.5-7.8。
6X DNA loading dye
0.25% bromophenol blue, 30% glycerol，儲存於-20 ℃。
30% Acrylamide Mix：
取40% acrylamide 750 mL、10 g bis-acrylamide 加二次水至體積 為1 L，避光儲存於 4 ℃。
Separation Gel Buffer：
1M Tris pH 8.8，儲存於 4 ℃。
Stacking Buffer：
1M Tris pH 6.8，儲存於 4 ℃。
20% SDS：
20 g SDS，加水至體積為 100 mL，儲存於室溫。
10X Running Buffer：
144 g glycine、30 g Tris-base、10 g SDS，加水至體積為 1 L，儲 存於4 ℃，使用時稀釋成 1 X。
樣品緩衝液 (5X Sample Buffer)：
取1 mL 1M Tris-HCl (pH 6.8)，加入 0.8 mL 甘油、1.6 mL 10%
SDS、0.4 mL 2-mercaptoethanol、0.05% bromophenol blue，加水至體 積為8 mL。
膠片染色液(0.1% Coomassie blue R-250 Stain Solution)：
取1 g 的 Coomassie brilliant blue R-250，溶於 400 mL 的甲醇中，
再加入100 mL 的醋酸，加二次水至體積為 1 L。
脫色溶液 I (Destain Solution I)：
將甲醇400 mL 與醋酸 100 mL 混合後，加二次水至體積為 1 L。
脫色溶液 II (Destain Solution II)：
將甲醇50 mL 與醋酸 70 mL 混合後，加二次水至體積為 1 L。
溶菌緩衝液(Lysis buffer)：
Tris-HCl 100mM, KCl 100mM and EDTA 1mM, pH 8.0。
Solubilization buffer
Tris-HCl 100mM, pH 8.0,Gdm-Cl 8M。
Disruption buffer
Tris-HCl 100mM, pH 8.0
平衡緩衝液(Equilibration buffer)：
Sodium phosphate 50mM, pH 7.2
LB 培養液
每升加入10 g Bacto-Tryptone、5 g yeast extract 以及 5 g NaCl
IPTG
將IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside) 溶於二次去離子水，再用 0.22 μm 濾膜過濾，儲存於-20 ℃。
Tetracycline
每毫升取Tetracycline 20 mg 以 Ethanol 溶解，避光存於–20°C
LB-Tet 培養基
每升LB 培養液加入 15 g Agar 經過高溫滅菌後等冷卻至 70 °C 以下再加入1 mL Tetracycline 避光存放於 4°C
Ampicillin (100 mg/mL)
將Ampicillin 溶於二次去離子水，再用 0.22 μm 濾膜過濾，儲存 於-20 ℃。
Kanamycin (25 mg/mL)
將250 mg kanamycin sulfate 溶於 10 ml 二次去離子水，再用 0.22 μm 濾膜過濾，儲存於-20 ℃。
LB-Kan 培養基
每升LB 培養液加入 15 g Agar 經過高溫滅菌後等冷卻至 70 °C 以下再加入1 mL Kanamycin 存放於 4°C
2-1-3 實驗儀器
數 位 照 相 系 統 (Kodak, DC120 Kodak Electrophoresis Documentation and Analysis System 120)
DNA定序儀 (Applied Biosystems, ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer)
震 盪 培 養 箱 (Firstek Scientific, orbital shaking incubator Model-S302R)
桌上型高速離心機 (Beckman, AllegraTM 21R Centrifuge) 高速離心機 (Beckman, Avanti® J-E Centrifuge)
微量離心機 (eppendorf, Centrifuges 5415R)
微量旋轉式真空濃縮機 (SAVANT, Spin Vaccum SPD-111V) 紫外光/可見光光譜儀 (Beckman, DU-7500 spectrophotometer) 超過濾裝置 (Ultrafiltration System, Amicon)
微盤光譜分析儀 (Fusion Universal Microplate Analyzer, Packard) PCR (Applied Biosystems, GeneAmp® PCR System 9700)
電泳槽 (Amersham Pharmacia)
2-1-4 菌株與載體
菌株 XL1-Blue
大腸桿菌之一株，購自於Stratagene 公司。
BL21(DE3)
大腸桿菌之一株，購自於 Novagen 公司。
載體
pET-28a(+)
購自於Novagen 公司。
2-2 實驗方法
實驗流程設計
Nco I
BamH I
Use PCR to get the hole sperm whale myoglobin gene BamH I
Nco I
Nco I / BamH I digest
Mb gene ligated into pET-28a(+) vector
Transform into E. Coli.
E. Coli strain BL21(DE3)
pET28-Mb
pET-28a(+) expression vector
2-2-1 目標基因的建構
從NCBI 中搜尋 sperm whale myoglobin 基因的 DNA 序列，再將 此序列平均分成六段來設計六條長約 90 bp 的單股 DNA 引子 (HMLpET28-whaleMb-1~6 見表 2-1)，鄰近的引子之間有 12~18 bp 的 互補重複區以供鄰近的引子黏合。引子的 N 端起始序列上游設計有 NcoI 的限制酶切位，C 端終止序列下游則設計有 BamHI 的限制酶切
位，使基因全長約為479 bp。將這 6 條引子利用具有修補功能的 rTth polymerase 聚合酶以 PCR 方式(表 2-2,2-3)讓這 6 條引子利用鄰近引子 的互補重複區黏合並延長，得到完整的sperm whale myoglobin 雙股 DNA 基因序列。最後在 PCR 產物加入 2 µL 的 6 倍 Loading Buffer 及 2 µL 的 SYBR Green I，利用 2 % 洋菜凝膠(Agarose gel)以電壓 120 伏特進行電泳分析，確認產物。
引子名稱 引子 DNA 序列
HMLpET28-whaleMb-1(F1) 5’ TAT ACC ATg gTT CTg TCT gAA ggT gAA Tgg CAg CTg gTT CTg CAT gTT Tgg gCT AAA gTT gAA gCT gAC gTC gCT ggT CAT ggT CAg gAC 3’
HMLpET28-whaleMb-2(R2) 5’AgC TTC AgT TTT CAg ATg TTT gAA ACg ATC gAA TTT TTC CAg AgT TTC Cgg ATg AgA TTT gAA CAg TCg AAT CAA gAT gTC CTg ACC Atg 3’
HMLpET28-whaleMb-3(F3) 5’ AAA ACT gAA gCT gAA ATg AAA gCT TCT gAA gAT CTg AAA AAA CAT ggT gTT ACC gTg TTA ACT gCC CTA ggT gCT ATC CTT AAg AAA AAA 3’
HMLpET28-whaleMb-4(R4) 5’ gAT gAA TTC CAg gTA TTT gAT Cgg gAT CTT ATg TTT AgT AgC ATg CgA TTg CgC AAg Cgg TTT gAg CTC AgC TTC ATg ATg CCC TTT TTT CTT Aag 3’
HMLpET28-whaleMb-5(F5) 5’ AAA TAC CTg gAA TTC ATC TCT gAA gCg ATC ATC CAT gTT CTg CAT TCT AgA CAT CCA ggT AAC TTC ggT gCT gAC gCT CAg ggT gCT ATg 3’
HMLpET28-whaleMb-6(R6) 5’ Cgg gAT CCT TAA CCC Tgg TAA CCC AgT TCT TTg TAC TTA gCA gCg ATA TCT TTA Cgg AAC AgC TCg AgA gCT TTg TTC ATA gCA CCC Tg 3’
HMLpET28-whaleMb-N1 5’ TAT ACC ATg gTT CTg TCT 3’
HMLpET28-whaleMb-C1 5’ Cgg gAT CCT TAA CCC Tg 3’
表2-1 設計的 6 條長單股 DNA 引子及兩端的 2 條短引子。
反應物 體積(單位 µL)
Each Primer (100 μM/μl) 1
dNTP (10mM) 4
Mg(OAc)2(1.5 mM ) 3 3x3 XL rTth buffer 15
DDW 21
rTth polymerase 1
Total reaction volume 50
表2-2 rTth polymerase kit 的 PCR 反應之組成。
部分 循環次數 溫度 時間
1 1 94℃ 1 分
94℃ 1 分
55℃ 2 分
2 25
72℃ 2 分
3 1 72℃ 5 分
4 1 4℃ ∞
表2-3 PCR program。
2-2-2 重組質體的建構
利用在N端及C端設計NcoI及BamHI限制酶切位的mb基因將基因
嵌入pET-28a(+)表現載體 (expression vector)中。將載體與欲殖入之 DNA分別利用限制酶作用 3-4 小時，於反應中加入 2 µL的 6 倍 Loading Buffer 及 2 µL的SYBR Green I，利用 1.2 % 洋菜凝膠 (Agarose gel)以電壓 120 伏特進行電泳分析，把經過限制酶作用後之 正確大小的載體與欲接入之DNA質帶切下，以Gel Band Purification Kit(GE Healthcare) 純化凝膠中之DNA，以一定比例(insert：vector=5：
1)混合，將樣品以微量旋轉式真空濃縮機抽乾後，利用接合酵素(T4
DNA ligase)於 16 ℃下作用 16 小時。
2-2-2-1 質體之轉化作用
將XL1-Blue 的 competent cell 拿出至於冰上，將經接合酵素反應 之樣品與之混合，冰浴20 分鐘，於 42 ℃水浴中反應 1 分鐘，隨即置 入冰中1 分鐘之後，將樣品全部置入 1 mL LB 培養液中，於 37℃振 盪培養(200 rpm)1 小時，取 200 μL 塗於含有 kanamycin (25 μg/ml)的 LB 培養皿上，在 37 ℃培養 12-16 小時。挑單一菌落至 3 mL LB/kna 培養液中，37 ℃振盪培養(200 rpm) 16 小時，利用 Plasmid Prep Kit (GeneMark)，將建構好之質體抽出，並用原先作接合之限制酶 NcoI
與 BamHI，確認插入之 DNA 片段是否有接入載體之中。最後得到肌 紅蛋白重組質體pET28-Mb。確認無誤的重組質體則再同上述步驟轉 形至 E.coli BL21 (DE3)中表現，挑單一菌落至 3 ml LB/kna 培養液 中，37 ℃振盪培養(200 rpm) 16 小時後，取樣品 500 μl 與 500 μl 的 50 % (v/v) glycerol 混合後冰存於-80℃冰箱作為 stock。
2-2-3 定點突變與飽和定點突變實驗
定點突變實驗策略(Site-Directed mutagenesis strategies)
引子設計 ( primer design )
QuickChange PCR
膠體電泳確認 PCR 產物
DpnI 去除母股 DNA
轉入大腸桿菌 XL1-Blue
挑單一菌落，抽取重組質體DNA
DNA 膠體電泳
利用設計的限制酵素截切( Mapping )做確認
DNA 定序確認突變序列
設計3 種含有靜默突變(Silent Mutation)及欲突變的 3 個胺基酸殘 基His 64, Val 68, Ile107 位置的定點突變互補引子(Primer) (表 2-4)。利 用 Stratagene (Merck 代理)的 QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit 依序進行突變實驗。以 pET28-Mb 為模板，加入 Pfu polymerase 聚合酶以PCR 方式(表 2-5, 2-6)放大而得到 DNA 產物，利用 DpnI 限 制酶截切甲基化DNA 之特性，去除母股，留下含有定點突變之突變 質體。將產物利用 2-2-2-1 節質體之轉化作用所敘述之方法直接轉形 至 E.coli XL1-Blue 中，利用 Plasmid Prep Kit (GeneMark)，將定點突 變之質體抽出後，利用在 primer 上設計的靜默突變，以特定限制酵 素截切確認為突變株後再以 DNA 定序確認 DNA 的序列。以此方式 依 序 建 構 pET28-H64D Mb ， pET28-H64D/V68L Mb 及 pET28-H64D/V68L/I107X Mb 突變株。
將突變處設計在 primer 上，利用 PCR 放大可直接得到突變點。
突變處在 primer 上前後約各需 3~5 個胺基酸距離，以利黏合反應
(Annealing)。由於飽和突變實驗是將欲突變處突變成其它 19 種胺基 酸，所以primer 的突變處設計為 NNN，N 代表 A、T、C、G 四種鹼 基，因此 primer 包含了 64 種可能性，即可轉譯(translate)出 20 種不 同的胺基酸。在 primer 上設計靜默突變，可利用設計的特定限制酵 素截切以確認是否為突變株。定序確認後的質體
引子名稱 引子 DNA 序列
HMLwhaleMb-H64D-1 E M K A S E D L K K D G 5’ gAA ATg AAg gCT TCT gAA gAT CTg AAA AAA gAT ggT g 3’
HMLwhaleMb-H64D-2 5’ C ACC ATC TTT TTT CAg ATC TTC AgA AgC CTT CAT TTC 3’
HMLwhaleMb-V68X-1 V T L T A L G A I 5’ gTT ACC (g/T/A)(C/T)(A/T) TTA ACT gCC CTA ggg gCT ATC 3’
Bgl I
HMLwhaleMb-V68X-2 5’ gAT AgC CCC TAg ggC AgT TAA (T/A)(G/A)(C/A/T) ggT AAC 3’
HMLwhaleMb-I107X-1 K Y L E F S E A 5’ C AAA TAC CTg gAg TTC NNN TCT gAA gCg 3’
HMLwhaleMb-I107X-2 5’ CgC TTC AgA NNN GAA CTC CAg gTA TTT g 3’
表2-4 設計合成 3 種定點突變的互補引子(Primer)。
反應物 體積(單位 µL)
Template 1 Primer 1 (10 μM/μl) 1
Total reaction volume 50
表2-5 Quick Change Site-Directed Mutagenesis 聚合酶連鎖反應組 成。
表2-6 Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit 使用之聚合酶 連鎖反應放大程式。
2-2-4 脫輔基(apo-from)蛋白質的表現
取stock 菌養於 25 mL LB/kna 培養液中，於 37 ℃振盪培養(200 rpm)16 小時。以 1:40 稀釋轉養至 1 L 的新鮮 LB 培養液中，於 37 ℃
振盪培養(200 rpm) 3~4 小時，直到 OD600 = 0.5~1。加入 IPTG (final concentration 0.4mM)，繼續在 37 ℃振盪培養(200 rpm)5 小時。於 4 ℃ 下，轉速 8000 rpm，離心 30 分鐘，倒掉上清液，取菌液沉澱物。最 後加入20 mL 溶菌緩衝液(Lysis buffer)回溶菌體。
2-2-5 包涵體(inclusion body)粗萃液之製備
用溶菌緩衝液(Lysis buffer)把菌液沉澱物回溶(每升的菌液用 20 mL 緩衝液回溶)，置於冰上 1 小時之後，進行打破細胞的步驟 (Sonication)。將溶液置於冰上，設定超音波震碎儀能量至 30 %，以 震盪 2 秒，休息 1 秒方式，共震盪 30 秒，重複 6 個循環。將溶液於 4 ℃下，轉速 12,000 rpm，離心 30 分鐘，。倒去上清液，將沉澱物加 入20 mL 溶菌緩衝液(Lysis buffer)回溶後，置於冰上 30 分鐘，繼續於 4 ℃下，轉速 8,000 rpm 離心 20 分鐘，回溶再離心的動作重複 4 次。
2-2-6 包涵體(inclusion body)的變性與再摺疊
最後一次離心的沉澱物以20 mL 的 disruption buffer 回溶，置於
冰上 1 小時。之後進行打破包涵體的步驟 (Sonication)，將溶液置於 冰上，設定超音波震碎儀能量至 30 %，以震盪 2 秒，休息 1 秒的方 式，共震盪 30 秒，重複 3 個循環。於樣品中緩慢加入 20 mL 的 solubilization buffer 稀釋 Gdm-HCl 的濃度。對 solubilization buffer 1L 透析5-6 小時，再對 equilibration buffer 2L 透析 3-4 小時 2 次。將溶 液於4℃下離心 30 分鐘，轉速 12000 rpm。取上清液。
2-2-7 脫輔基(apo-form)蛋白質的純化
利用離子交換管柱層析(DEAE)純化此蛋白，樣品以 BCA assay Kit 估計其蛋白質的總量，決定所要填充離子交換樹脂之體積。以 5 倍體積的 equilibration buffer 平衡管柱中的樹脂，慢慢注入樣品，收 集流出物(Flow-Through)，利用試管每 5 mL 收集一管。
2-2-8 蛋白質分子量及純度分析
SDS-PAGE 是一種最常使用來分析蛋白質純度與定量的方法，
尤 其 是 在 進 行 蛋 白 質 純 化 時 ， 於 膠 體(Polyacrylamide gel)中加入
sodium dodecyl sulfate (SDS)用來使蛋白質變性(denature)，SDS 會與 蛋白質結合使摺疊構形蛋白質拉成直鏈狀之一級結構，此複合體均帶 負電，所以在膠體中移動速率僅與蛋白質之分子量有關。以 20%
separating gel 及 4% stacking gel 的 SDS-PAGE(表 2-4)分析純化後之蛋 白質樣品。 10% ammonium
persulfate 200 μl 10% ammonium
persulfate 50 μl TEMED 10 μl
表2-7 20% separating gel 與 4% stacking gel 的 SDS-PAGE 膠片
組成份。
將經由離子交換管柱層析所得之每管樣品，取適量樣品與樣品緩 衝液(5X Sample Buffer)以 1：4 比例混合，於 95℃水浴加熱 10 分鐘 後，置入樣品槽內，以 90 伏特電壓進行電泳分析，當染劑(dye)跑至 下層膠片時，將電壓調至 120 伏特，直至染劑跑到膠片底下或還未完 全跑掉時即可關掉，取下膠片置於膠片染色液(Stain Buffer)中，染色 (含 Coomassie brilliant Blue R-250)1 小時後，用脫色溶液 I (Destain Buffer I)退染 30 分鐘，再用脫色溶液 II (Destain Buffer II)退染至隔天。
2-2-9 蛋白質輔基重組實驗
將經由離子交換管柱層析所得之蛋白質以BCA assay Kit 偵測蛋 白質濃度，以0.5 M 氫氧化鈉溶液將蛋白質溶液的 pH 值調至 12。取 莫耳濃度為蛋白質濃度2 倍的紫質溶於 250 μL 的 pyridine，加入 250 μL 的 equilibration buffer 並以超音波震盪 10 分鐘，將紫質溶液與 pH 12 的蛋白質溶液混合，於 4 ℃下，磁石攪拌(stir)10 分鐘，再以 0.5 M 鹽酸調整pH 值至 6.8，於 4 ℃下，磁石攪拌 6 小時。對 1 L 100 mM
磷酸鉀緩衝液pH 6.8 透析 2-3 小時，共 3 次。樣品以 0.22 μm 的濾膜
磷酸鉀緩衝液pH 6.8 透析 2-3 小時，共 3 次。樣品以 0.22 μm 的濾膜