3-1 目標基因質體之建構
可轉譯出完整的抹香鯨肌紅蛋白(sperm whale myoglobin)的 mb 基因，在利用6 條單股 DNA 引子以 PCR 方式黏合、延長並放大後，
可以得到一條全長 479 個鹼基對的雙股 DNA。經過 2% 洋菜凝膠 (Agarose gel) 電泳後可在約 500 bp 處看到 mb 的 DNA 質帶。
經過多次的截切與接合反應後，我們成功的將 mb 基因接入 pET28a(+)這個表現載體中，並經由限制酵素截切( Mapping )確認後 進行 DNA 定序的反應，可以確認我們成功的建構了 pET28-mb 這個 質體。
3-2 篩選目標
利用定點突變的技術來對蛋白質特定胺基酸殘基做改變以觀察 蛋白質的結構及活性變化，已是目前相當普遍的方法。本實驗室對這 項技術亦相當純熟。而先前所述肌紅蛋白中 His64 位置在突變成天門
冬胺酸(Asp)後可能會增加對過氧化氫的極性與親合性來改善突變型 肌紅蛋白的氧化活性，而第 68 號 Val 的位置對加速受質到達活性部 位有很大的重要性。因此我們先以含有野生型抹香鯨肌紅蛋白(sperm whale myoglobin) mb 基因的質體 pET28-mb 為模板(template)，利用定 點突變的技術得到改變2 個胺基酸殘基位置的 pET28-H64D/V68L mb 質體，即文獻中過氧化酶活性最好的雙重突變肌紅蛋白。並以此為模 板，挑選另一個可能會影響突變型肌紅蛋白過氧化酶活性的胺基酸殘 基。
經由野生型抹香鯨肌紅蛋白結晶結構來比對每個胺基酸殘基與 血基質鐵原子的最近距離後(表 3-1)。我們推測距離 6.76 Å 的第 107 號 Ile 位置的殘基對影響受質進出反應的活性部位也可能具有重要 的決定因素。因此我們嘗試飽和突變第 107 號 Ile 位置的胺基酸，將 它換成其它19 種的胺基酸，再來比較過氧化酶活性。
位置 殘基 最近原子 距離 位置 殘基 最近原子 距離 位置 殘基 最近原子 距離 1 Val CG1 -25.02 52 Glu OE2 20.47 103 Tyr OH -12.87 2 Leu CD1 -21.05 53 Ala CB 23.68 104 Leu CD2 -6.54 3 Ser OG -28.16 54 Glu OE1 21.17 105 Glu OE2 -17.46 4 Glu OE2 -27.26 55 Met CE 16.06 106 Phe CD2 12.84 5 Gly CA -28.67 56 Lys NZ 21.25 107 Ile CD1 6.76 6 Glu OE2 -26.5 57 Ala CB 21.56 108 Ser OG -11.7
7 Trp CH2 -18.96 58 Ser OG 15.55 109 Glu OE2 17.08
44 Asp OD2 13.14 95 Thr OG1 -12.5 146 Tyr OH -8.47 45 Arg NH1 10.88 96 Lys NZ -10.07 147 Lys NZ -23.24 46 Phe CE2 8.94 97 His NE2 -5.69 148 Glu OE1 -19.11 47 Lys NZ 13.86 98 Lys NZ -14.52 149 Leu CD1 -14.36 48 His ND1 16.68 99 Ile CD1 -6.47 150 Gly CA -18.92 49 Leu CD1 14.93 100 Pro CD -10.07 151 Tyr OH -15.42 50 Lys NZ 24.72 101 Ile CD1 -11.69 152 Gln OE1 -16.45 51 Thr OG1 22.52 102 Lys NZ -18.05 153 Gly CA -16.09 表 3-1 野生型抹香鯨肌紅蛋白中各胺基酸殘基與血基質鐵原子 最近的原子及相距的距離。(註 1：最近的原子第一個為原子種類，之 後代表為殘基中的第幾號原子；註2：距離單位為 Å，負號代表為位 於血基質平面的近端組胺酸那一側)。
3-2-1 細胞粗萃液的活性篩選
以含有雙重突變H64D/V68L mb 基因的質體 pET28-H64D/V68L mb 模板(template)，利用飽合突變的技術，我們得到將第 107 號 Ile 胺基酸殘基改變成其它 19 種胺基酸的三重突變株。經由 DNA 定序 確 認 後 ， 我 們 將 包 含 雙 重 突 變 在 內 的 20 種 胺 基 酸 pET28-H64D/V68L/I107X mb 轉形(transform)至可以表現出完整肌紅 蛋白的 E.coli BL21 (DE3)中表現。
為了達到可以快速的篩選飽和突變實驗中哪一株三重突變株具 有較好的過氧化酶活性，因此我們採用小量的培養包含雙重突變株在 內的20 種胺基酸的突變株於 3 mL LB 培養液中，並在 15 mL 試管中 於37℃ 震盪培養 12~16 小時。收集 1.5 mL 菌液，以 13200 rpm 離 心 1 分鐘，到掉上清液，加入 300μL 的溶菌緩衝液以回溶沉澱物。
利用溫和的破菌方法來打破細胞，隨即將樣品丟入液態氮中急速冷凍 約 1 分鐘，再迅速丟入 42℃水浴中約 2 分鐘，如此重複 3 次。最後 以 12,000 rpm 離心 1 分鐘，取上清液即為用來做活性比較的細胞粗 萃液。
經過蛋白質定量後，取含相同蛋白質量的細胞粗萃液與 90 μL 含1 mM ABTS、5 mM H2O2的50 mM 磷酸鈉緩衝液pH 7.0 在 96-well 的微量分析盤(microwell plate)中反應，並偵測ABTS氧化產物 405 nm 的吸光值以比較彼此間的過氧化酶活性大小，結果如圖3-1 所示。
結果顯示將第 107 號 Ile 胺基酸突變成 Met、Leu、Phe、Val、
Ala 這 5 種胺基酸的三重突變株的過氧化酶活性較優於文獻中的 H64D/V68L 的雙重突變株。因此我們將個別純化這幾種胺基酸的肌 紅蛋白再與H64D/V68L 的雙重突變進行過氧化酶活性的比較。
0 0.5 1 1.5 2
A V L M P F W G S T Y C Q D E H K R N I H64D/V68L/I107X Mb
Abs. 405 nm
圖 3-1 含相同蛋白質量的三重突變肌紅蛋白H64D/V68L/I107X Mb細胞粗萃液 10 μL與 90 μL 的 1 mM ABTS、5 mM H2O2 反應後偵 測405 nm的吸光值。
3-3 脫輔基(apo-form)蛋白質表現及純化
由於實驗的需求，未來我們希望的是將突變後的脫輔基肌紅蛋白 與不同金屬的紫質及經過各種官能基修飾過後的紫質做輔基重組，再 研究其各種物理及化學特性。因此，我們參考文獻[16]將實驗採用的 肌紅蛋白表現成包涵體(inclusion body)的方式，再藉由包涵體的變性 與再摺疊獲得脫輔基形式的肌紅蛋白。如此可以擺脫以往利用 MEK 方法將紫質從肌紅蛋白中分離的繁複步驟，從包涵體純化脫輔基肌紅
蛋白也可以去除許多雜蛋白，省去利用第二根管柱層析純化肌紅蛋白 的時間。
處理包涵體時由於蛋白質的過度堆疊，因此密度相當的大，所以 在破菌後只需利用低轉速就可將包涵體離心下來。接下來以 lysis buffer 不斷的回溶去除非包涵體的雜蛋白，經過幾次處理即可得到大 部分都是脫輔基肌紅蛋白的包涵體。
本 實 驗 利 用 Gdm-HCl 使 包 涵 體 變 性 ， 再 利 用 透 析 去 除 Gdm-HCl 使脫輔基肌紅蛋白慢慢摺疊。透析時為了避免已變性的蛋 白又聚集在一起，因此會利用梯度透析的方法來避免此情況。最後只 需要利用DEAE 離子交換管柱層析收集沖提液，再將每管利用 BCA 蛋白質濃度測量分析後，收集代表含有蛋白質的吸收峰部分。
經 過 純 化 的 脫 輔 基 肌 紅 蛋 白(apo-Mb) 可 以 由 以 下 的 20%
SDS-PAGE(圖 3-2 )偵測得知蛋白質的純度，並且利用 UV-Vis 光譜儀 掃描全波長並無發現紫質的410 nm 處的吸收峰，因此可以確認純化 的肌紅蛋白為脫輔基的形式。
M 1 2 3
(kDa) 14.4
30
20.1 97 65
45
圖 3-2 20% 的 SDS-PAGE 分析 Lane M：低分子量的蛋白質 marker。Lane 1：未加入 IPTG 誘導前。Lane 2：IPTG 誘導後經超音 波震盪離心之沉澱回溶。Lane 3：經純化後得到約 17kDa 的肌紅蛋白。
3-4 蛋白質輔基重組
在極性的環境(極酸或鹼)下肌紅蛋白會變性而去摺疊，紫質亦會 由 原 本 在 中 性 pH 值 時 的 高 度 聚 集 (aggregate) 現 象 而 形 成 單 體 (monomer)或雙體(dimer)的形式。利用此特性我們先將脫輔基肌紅蛋 白溶液與紫質溶液的 pH 值均調成 12，混合攪拌後再調回中性的 pH 值，以幫助脫輔基肌紅蛋與紫質進行蛋白質與輔基的重組(cofactor
reconstitution)。
一些有機溶劑也會加入以幫助溶解紫質及穩定蛋白質，吡啶 (pyridine) 與 緩 衝 溶 液 等 比 例 的 混 合 可 幫 助 紫 質 更 不 容 易 聚 集 (aggregate)。另外一種有機溶劑二甲基亞石砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)也被加在蛋白質溶液中以穩定蛋白質，防止用來溶解紫質的 吡啶(pyridine)加入後會造成蛋白質不穩定。
實驗中會加入約高於蛋白質莫耳濃度 2 倍量的紫質以確保每分 子的蛋白質均可與紫質結合，經過調整pH 值及透析去除有機溶劑後 多餘未被嵌入肌紅蛋白的紫質會高度聚集，利用孔徑極小的0.22 μm 濾膜(filter)及去鹽管柱(desalting column)可以將這些多餘未被嵌入肌 紅蛋白的紫質去除。
鐵(Fe3+)和鋅(Zn2+)兩種市面上可買到的不同金屬紫質在經過蛋 白質與輔基的重組實驗後已被成功的嵌入野生型及H64D/V68L雙重 突變型的肌紅蛋白中。經由UV-Vis光譜儀掃描全波長後，由下圖(圖 3-3)可以比較彼此間的不同。
圖3-3 UV/Vis 全光譜掃描圖 含鋅的紫質(Zinc Protoporohyrin IX, ZnPP)及含鐵的紫質(Iron(II) Protoporphyrin IX)即血基質(Heme)分別 與野生型及 H64D/V68L 雙重突變型的脫輔基肌紅蛋白中進行蛋白質 與輔基的重組後與對照的ZnPP 溶於 pH6.8 的 100 mM 磷酸鉀緩衝液 中。
含鐵的紫質即為自然界中常見肌紅蛋白中含的血基質(Heme)，文 獻中指出MbH64D/V68L雙重突變肌紅蛋白會有過氧化酶(peroxidase)的活 性[10]，因此為了測試蛋白質與輔基的重組實驗是否可行，我們將經 過蛋白質與輔基的重組實驗後血基質(Heme)已成功的被嵌入野生型 及突變型的肌紅蛋白與1 mM ABTS及 2 mM H2O2反應。結果雙重突 變肌紅蛋白MbH64D/V68L如文獻所指具有很高的反應活性，與野生型肌
紅蛋白相比可在730 nm處見到很明顯的吸收光譜(圖 3-4)。
圖 3-4 相同量蛋白質的野生型(Mbwt)及MbH64D/V68L與Heme進行 蛋白質與輔基的重組後與1 mM ABTS及 2 mM H2O2反應依時間偵測 ABTS氧化產物 730 nm 吸光值，作為對照的是脫輔基的肌紅蛋白 (Apo-Mb)。
含鋅的紫質(Zinc Protoporohyrin IX, ZnPP)經過蛋白質與輔基的 重組實驗後經由UV-Vis光譜儀掃描全波長後可以確認成功的嵌入野 生型及突變型的肌紅蛋白中。由於鋅的電子軌域(orbital)均被填滿，
所以鋅的氧化數不像鐵一樣複雜，也沒有多餘的d層軌域可與氧原子
結合，因而在ZnPP嵌入的雙重突變肌紅蛋白MbH64D/V68L並不具有過氧 化酶(peroxidase)的活性。但是仍然可以從光譜圖(圖 3-3)中發現ZnPP 在嵌入肌紅蛋白後主要吸收帶(Soret band 或 B band)由溶液中的 407 nm紅位移(red shirft)至 430 nm，且吸收峰的帶寬由於較無ZnPP聚集 (aggregate)而變窄，此結果與文獻所得之吸收光譜比較則是得到一致 的結果[17]。
3-5 過氧化酵素活性最適反應條件
3-5-1 最適反應之 pH 值
不同pH值對酵素活性的影響可以由圖 3-5 顯示出來。檸檬酸 (Citric acid)溶液的緩衝範圍為 4.0~6.0，磷酸鈉(Sodium Phosphate)溶 液的緩衝範圍為5.8~8.0，Tris溶液的緩衝範圍為 7.0~9.1[18]。將整個 反應在不同的pH值下進行，可以看出pH 7 的中性環境對雙重突變肌 紅蛋白MbH64D/V68L進行過氧化酵素活性反應具有最高的反應活性。在 pH 6 的微酸性的環境下相對活性為 70%，較pH 8 微鹼性環境的 45%
相對活性高，但pH值低於 5 或大於 9 則相對活性均不到 10%。
同樣是pH 6 但不同鹽類的緩衝液，磷酸鈉(Sodium Phosphate)溶 液的相對活性高於檸檬酸(Citric acid)溶液約 10%，代表整個反應的緩 衝液系統宜採用磷酸鈉(Sodium Phosphate)溶液。相較於其它過氧化酵 素(例如：Horseradish Peroxidase, HRP)的最適反應環境通常在 pH 5 的酸性環境下[19]，突變後具有過氧化酵素活性的肌紅蛋白仍然在生
Residual Activity (%)
Citrate
3-5-2 溫度與活性之關係
將酵素溶液加溫 30 分鐘後，不同溫度對酵素活性的影響可以由 圖3-6 顯示出來，以置於 4℃恆溫的酵素溶液在室溫下進行催化反應 的酵素活性為最高活性，其餘在經過加熱處理後活性均有下降的趨
將酵素溶液加溫 30 分鐘後，不同溫度對酵素活性的影響可以由 圖3-6 顯示出來，以置於 4℃恆溫的酵素溶液在室溫下進行催化反應 的酵素活性為最高活性，其餘在經過加熱處理後活性均有下降的趨