1-1 肌紅蛋白(myoglobin)的簡介
肌紅蛋白(Myoglobin)在生理上的功能為與一分子的氧氣結合，在 肌肉組織作為氧氣儲存的蛋白質，以緩衝組織呼吸時對氧氣濃度的 需求。它對氧氣的親和力介於血紅蛋白(Hemoglobin)與細胞色素 (Cytochromes)之間，因此肌紅蛋白在組織中接收從血紅蛋白釋出的 氧氣，並將氧氣供給細胞中粒線體的細胞色素，提供其氧化呼吸作 用所需的氧氣。在海洋哺乳類動物(例如: 海豹和鯨魚)的肌肉中，肌 紅蛋白特別豐富，因此可以延長這些動物在海底潛水的時間。
肌紅蛋白的三級結構為水溶性的橢圓球狀(44 x 44 x 25 Å)，以單 體(monomer)形式存在於自然界中，分子量約為 17 kDa。肌紅蛋白的 二級結構含有很高比例 (75%)的 α-螺旋結構(α-helices)，由 153 個 胺基酸摺疊成 8 段右手旋的 α-螺旋結構，並分別命名為 A-H 螺旋，
各螺旋的中間由一些非螺旋區連接。疏水性(hydrophobic)的胺基酸 殘基在經過正確摺疊後大部分會處於整個肌紅蛋白分子的內部，而 親水性(hydrophilic)的胺基酸殘基則位於分子的外部，因此使得整個 肌紅蛋白分子相對的具有水溶性。
圖1-1 肌紅蛋白的結構圖。
具有完整生物功能的肌紅蛋白除了蛋白質的部分，還需要有一個 輔 基 團 (prosthetic group) 稱 作 血 基 質 (heme ， 又 稱 為 iron protoporphyrin IX)。血基質包含一個有機分子部份及一個鐵原子，
有機分子部分稱為原紫質(protoporphyrin)是由四個吡咯環(pyrrole rings)組成。而這四個吡咯環是藉由次甲基橋(methane bridges)相連接 而 構 成 一 個 四 吡 咯 環(tetrapyrrole ring) ， 且 有 四 個 甲 基 (methyl groups)，二個乙烯基(vinyl groups)及二個丙酸側鏈(propionate side chains)與這個四吡咯環相連。血基質中的鐵原子與原紫質環中心的 四個氮共價結合，鐵原子還能另外形成二個鍵，分別位於血基質平 面的二側，這些結合部位稱為第五及第六配位。
早 在 1960 年代肌紅蛋白的結構已由英國劍橋大學的 John Kendrew 利用 X-ray 結晶學方法解出，此為第一個利用 X-ray 結晶學 解出結構的蛋白質[1]。可顯示出肌紅蛋白各原子間的相對位置。其 結構顯示肌紅蛋白由分別標示為 A-H 的 8 個螺旋片段構成，並在 E 和 F 螺旋片段之間留下一個疏水性的狹縫以供血基質的嵌入。血基 質的四吡咯環與狹縫內的疏水性胺基酸藉由疏水性的交互作用穩定 血基質與肌紅蛋白的連結。血基質中間的鐵原子直接與肌紅蛋白的 近端組胺酸(proximal histidine) (稱為殘基 F8；意即 F 螺旋的第 8 個 胺基酸殘基)即第 93 號組胺酸的 Nε(組胺酸側鏈上 ε 位置的氮原子) 形成共價鍵結。氧氣的結合部位在血基質平面的另一側，即鐵原子 的第六配位上。鐵原子可以處於亞鐵(+2)或高鐵(+3)二種不同的氧化 態 ， 分 別 稱 為 亞 鐵 肌 紅 蛋 白(ferromyoglobin) 及 高 鐵 肌 紅 蛋 白 (ferrimyoglobin) ， 高 鐵 肌 紅 蛋 白 亦 可 稱 為 正 鐵 肌 紅 蛋 白 (metmyoglobin)。僅有亞鐵肌紅蛋白(+2 氧化態)能夠與氧氣結合。第 64 號組胺酸殘基(殘基 E7)稱為遠端組胺酸(distal histidine)，靠近血 基質但不與它結合。含有血基質的肌紅蛋白稱為 holo-form 的肌紅蛋 白，若沒有血基質的結合，此形態的肌紅蛋白通常稱為脫輔基肌紅 蛋白(apomyoglobin)。
1-2 紫質(prophyrin)的簡介
紫質的結構是由四個吡咯環(pyrrole rings)藉由次甲基橋(methane bridges)相連接而構成一個四吡咯環(tetrapyrrole ring)。在自然界中及 人類體內均存在紫質的衍生物，與人類生活有著密不可分的關係。
例如，人體中負責氧氣運輸與儲存的血基質(heme)及自然界中進行 光合作用的葉綠素。近幾年來關於紫質的研究與應用已愈來愈多，
例如，光電元件(optoelectronic device)、分子邏輯元件(molecular logic device)、太陽能的吸收與儲存(artificial solar energy harvesting and storage scheme)以及太陽能電池(solar cell)[2-4]。
紫 質 的 中 間 若 嵌 合 一 個 金 屬 原 子 則 此 種 紫 質 稱 為 金 屬 紫 質 (Metalloporphyrin)，例如：血基質(heme)就是嵌合入一個鐵原子 [the iron(II) protoporphyrin-IX complex] 在生理上作為氧氣的儲存和運 輸。
含有鎂離子嵌入其中的紫質是光合作用中能將光能轉換成化學 能的關鍵因子。因此不同的金屬嵌入紫質中，使其擁有許多的應用 價值包括應用在光學治療[5]，新穎的光化學反應中心[6]，生物模擬
模型，催化和感測系統。圖 1-2 為紫質和血基質的化學結構。
圖1-2 紫質和血基質的化學結構。
1-3 血基質蛋白(heme protein)
含 有 血 基 質 的 蛋 白 質 可 被 稱 為 血 基 質 蛋 白(heme protein or hemoprotein)，生物中目前已知的血基質蛋白可歸納出四種生物功 能：電子傳遞(如：細胞色素 b5)、傳輸氧氣(如：血紅蛋白，肌紅蛋 白)、氧氣或一氧化碳的感測(如：FixL，CooA)及催化氧化還原反應 (如：horseradish peroxidase，cytochrome P450，catalase，NO synthase，
NO reductase)。這些蛋白質雖然功能各異，但是它們都有一個共同 的血基質(iron protoporphyrin IX)當作其輔基團(prosthetic group)。
在血基質蛋白中，血基質週邊的胺基酸殘基似乎是控制血基質蛋 白功能的關鍵。帶電的血基質蛋白通常在其鐵原子的軸位(axial)有二 個很強的配位體結合，以防止其它可能的受質進入。如肌紅蛋白的 第六配位處也就是遠端口袋的(distal pocket)位置，經常會被一個水 分子所佔據，以利於其它的配體，像是氧氣來交換。在近端的組胺 酸殘基被當做軸位的配體，而遠端的組胺酸則是藉由氫鍵來穩定氧 氣與血基質的結合。另外在作為感測氧氣的血基質蛋白 FixL 中，其 血基質周圍也顯露出一個可以供配位結合的位置，而有些血基質蛋 白的鐵原子亦可與過氧化氫配位結合並發生反應。同樣的血基質卻 可以造成功能各異的蛋白質[7]。因此研究血基質週邊胺基酸殘基的 改變，使不具酵素功能的肌紅蛋白變成具有過氧化酵素(peroxidase) 活性的研究，可以幫助我們更了解血基質蛋白。
1-4 過氧化酵素
山葵過氧化酵素(horseradish peroxidase；HRP)，是常見的過氧化 酵素之一，這類高鐵的過氧化酵素(ferric peroxidase)與過氧化氫(H2O2) 反應時會打斷其氧-氧鍵(HO-OH bond)，使血基質中的鐵和氧結合構
成特殊形式(oxo-ferryl(O=FeIV))，而紫質部分為帶有自由基的陽離子 (prophyrin radical cation)，這樣的血基質稱為Compound I (oxo-ferryl porphyrin radical cation)。在Compound I (圖 1-3)的形成過程中，過氧 化氫結合到血基質的鐵原子上，遠端的組胺酸先是當作general base 應(push effect)〞[7]。
圖1-3 推測的 Compound I 形成機制。
General base function histidine General acid function histidine
δ− δ+
另外一些血基質蛋白，如細胞色素 P450 單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases)，則是與氧氣而非與過氧化氫結合，並且需要 二個電子以形成 Compound I。圖 1-4 顯示自然界中過氧化酵素與單 加氧酶(monooxygenases)相同反應中間物(reactive intermediates)的部 分，以及單加氧酶與過氧化酵素的不同在於單加氧酶將 Compound I 的氧原子傳遞給受質。
圖1-4 兩種酵素 peroxidase 和 cytochrome P450 反應的比較[7]。
1-5 肌紅蛋白經突變後具有過氧化酶酵素活性
利用蛋白質酵素活性部位的結構可以影響其酵素活性的特性，目 前已有將生理上僅能儲存氧氣的肌紅蛋白變成具有過氧化酵素活性 的研究報導。比較兩種已被結晶出結構的代表性血基質蛋白，肌紅蛋 白及細胞色素 C 過氧化酶(cytochrome c peroxidase；Ccp)這兩種血基 質蛋白，它們具有結構完全相同的血基質，也一樣有近端的咪唑 (imidazole)配體以及其遠端的活性部位皆有組胺酸殘基。但是在已結 合氧氣分子的肌紅蛋白中，遠端的組胺酸可以非常靠近已配位結合鐵 原子的氧氣分子。而在已結合氧氣分子的細胞色素 C 過氧化酶中，
遠端的組胺酸與氧氣分子的距離則相對較肌紅蛋白中的遠。因此 Ozaki 等研究學者推測，由於肌紅蛋白中的遠端組胺酸離血基質的鐵 原子較近，因此使肌紅蛋白與過氧化氫反應形成Compound I 的能力 遠低於細胞色素 C 過氧化酶[7]。
基於遠端組胺酸的位置有決定血基質蛋白的功能的重要性，
Ozaki 等研究學者將抹香鯨肌紅蛋白(sperm whale myoglobin)及細胞 色素 C 過氧化酶的結晶結構做活性區域的比較，再改變遠端組胺酸 的位置，希望可以得到具有過氧化酵素活性的突變肌紅蛋白[7]。他
們先是單純的將遠端的組胺酸殘基與其它活性區域位置的胺基酸殘 基對調，因此建構 F43H/H64L 和 L29H/H64L 二組胺基酸殘對調的 雙重突變肌紅蛋白，由於是將活性區域的遠端組胺酸位置改變，因此 稱為〝distal histidine relocation mutant〞。而他們實驗的結果顯示 F43H/H64L 的雙重突變肌紅蛋白遠端組胺酸環境較相似於過氧化 酶，此雙重突變肌紅蛋白的過氧化酶(peroxidase activity)與過氧合酶 酵素活性(peroxygenase activity)都優於野生型肌紅蛋白，並且具有 general acid-base 的催化作用。
在野生型肌紅蛋白中Compound I 無法形成的另一個原因可能是 肌紅蛋白遠端組胺酸的迅速氧化作用，因此嘗試飽和突變實驗將遠端 組胺酸置換成各種不同胺基酸的實驗亦被 Ozaki 等研究學者發表 [8]。將肌紅蛋白的遠端組胺酸殘基改變後，Compound I 便可以很快 的 形 成 ， 尤 其 是 突 變 成 天 門 冬 胺 酸 (Asp) 後 功 能 便 類 似 chloroperoxidase(CPO)活性區域的麩胺酸(Glu)[9] (圖 1-5)。但是天門 冬胺酸的羧酸氧原子在突變的肌紅蛋白中與血基質鐵原子的距離似 乎太遠，因此推測在突變的肌紅蛋白中第64 號天門冬胺酸(Asp)殘基 的功能可能是增加對過氧化氫的極性與親合性，來改善突變肌紅蛋白 的氧化活性。
N
His 105 Glu183
Cys 29
His 105 Glu183
Cys 29
His 105 Glu183
Cys 29
IV +
.
HOH
圖1-5 在 chloroperoxidase 中 Glu-183 對形成 Compound I 的可能 功能。
H64D/V68L 突變在形成 Compound I 後，與受質傳遞一個電子的效率 最好，即有很好的過氧化酶活性。而 H64D/V68I 雖然形成 Compound I 的效率較差但卻有最好的過氧合酶活性，因此過氧合酶活性的速率 決定步驟可能是在Compound I 形成後與一當量的受質反應。另外也 發現，H64D/V68A 和 H64D/V68S 這二組雙重突變肌紅蛋白在過氧合 酶 酵 素 活 性 (peroxygenase activity) 上 具 有 鏡 像 選 擇 性
(enantioselectivity)，再搭配結晶結構的結果發現影響氧化速率和造成 鏡像選擇性的可能原因有二，可能是第 64 號天門冬胺酸(Asp 64)殘基 直接和受質的立體交互作用(steric interaction)或是使受質和遠端口袋 的水分子產生極化的交互作用(polar interaction)。
在 1998 年 Wan 等人也以 PCR 隨意突變(random mutagenesis)的 方法，企圖篩選比野生型肌紅蛋白的過氧化酶活性好的突變株。在經 過四次 PCR 反應後，他們篩選到一株氧化酶活性較野生型有明顯差 別的 T39I/K45D/F46L/I107F 突變株，由其酵素動力學的資料顯示這 個突變株可以穩定Compound I 的形成。此四重突變的肌紅蛋白與野
在 1998 年 Wan 等人也以 PCR 隨意突變(random mutagenesis)的 方法，企圖篩選比野生型肌紅蛋白的過氧化酶活性好的突變株。在經 過四次 PCR 反應後，他們篩選到一株氧化酶活性較野生型有明顯差 別的 T39I/K45D/F46L/I107F 突變株，由其酵素動力學的資料顯示這 個突變株可以穩定Compound I 的形成。此四重突變的肌紅蛋白與野