[1] J.C. Kendrew, R.G. Parrish, J.R. Marrack, E.S. Orlans, The species specificity of myoglobin. Nature 174 (1954) 946-949.
[2] F. Remacle, S. Speiser, R.D. Levine, Intermolecular and Intramolecular Logic Gates. J. Phys. Chem. B 105 (2001) 5589-5591.
[3] P.G. Van Patten, A.P. Shreve, J.S. Lindsey, R.J. Donohoe, Energy-Transfer
Modeling for the Rational Design of Multiporphyrin Light-Harvesting Arrays. J. Phys.
Chem. B 102 (1998) 4209-4216.
[4] E.D. Sternberg, D. Dolphin, C. Bruckner, Porphyrin-based photosensitizers for use in photodynamic therapy. Tetrahedron 54 (1998) 4151-4202.
[5] R. Bonnett, Photosensitizers of the porphyrin and phthalocyanine series for photodynamic therapy. Chem. Soc. Rev. 24 (1995) 19-33.
[6] D. GUST, T.A. MOORE, Mimicking Photosynthesis. Science 244 (1989) 35 - 41.
[7] S. Ozaki, M.P. Roach, T. Matsui, Y. Watanabe, Investigations of the roles of the distal heme environment and the proximal heme iron ligand in peroxide activation by heme enzymes via molecular engineering of myoglobin. Accounts of chemical research 34 (2001) 818-825.
[8] T. Matsui, S.i. Ozaki, Y. Watanabe, Formation and Catalytic Roles of Compound I in the Hydrogen Peroxide-Dependent Oxidations by His64 Myoglobin Mutants.
Journal of the American Chemical Society 121 (1999) 9952-9957.
[9] M. Sundaramoorthy, J. Terner, T.L. Poulos, The crystal structure of chloroperoxidase: a heme peroxidase--cytochrome P450 functional hybrid. Structure 3 (1995) 1367-1377.
[10] H.J. Yang, T. Matsui, S. Ozaki, S. Kato, T. Ueno, G.N. Phillips, Jr., S. Fukuzumi, Y. Watanabe, Molecular engineering of myoglobin: influence of residue 68 on the rate and the enantioselectivity of oxidation reactions catalyzed by H64D/V68X myoglobin.
Biochemistry 42 (2003) 10174-10181.
[11] L. Wan, M.B. Twitchett, L.D. Eltis, A.G. Mauk, M. Smith, In vitro evolution of horse heart myoglobin to increase peroxidase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95 (1998) 12825-12831.
[12] M. Gratzel, Solar Energy Conversion by Dye-Sensitized Photovoltaic Cells.
Inorg. Chem. 44 (2005) 6841-6851.
[13] M.K. Nazeeruddin, P. Pechy, T. Renouard, S.M. Zakeeruddin, R.
Humphry-Baker, P. Comte, P. Liska, L. Cevey, E. Costa, V. Shklover, L. Spiccia, G.B.
Deacon, C.A. Bignozzi, M. Gratzel, Engineering of Efficient Panchromatic Sensitizers for Nanocrystalline TiO2-Based Solar Cells. Journal of the American Chemical Society 123 (2001) 1613-1624.
[14] N. Hirata, J.-J. Lagref, E.J. Palomares, J.R. Durrant, N.M. K., G. M., D. Di Censo, Supramolecular Control of Charge-Transfer Dynamics on Dye-sensitized Nanocrystalline TiO2 Films. Chemistry - A European Journal 10 (2004) 595-602.
[15] Y.Z. Hu, S. Tsukiji, S. Shinkai, S. Oishi, I. Hamachi, Construction of Artificial Photosynthetic Reaction Centers on a Protein Surface: Vectorial, Multistep, and Proton-Coupled Electron Transfer for Long-Lived Charge Separation. Journal of the
American Chemical Society 122 (2000) 241-253.
[16] E.A. Ribeiro, Jr., W.C. Regis, L. Tasic, C.H. Ramos, Fast purification of the Apo form and of a non-binding heme mutant of recombinant sperm whale myoglobin.
Protein expression and purification 28 (2003) 202-208.
[17] S. Papp, J.M. Vanderkooi, C.S. Owen, G.R. Holtom, C.M. Phillips, Reactions of excited triplet states of metal substituted myoglobin with dioxygen and quinone.
Biophysical journal 58 (1990) 177-186.
[18] T.K. Wu, C.Y. Huang, C.Y. Ko, C.H. Chang, Y.J. Chen, H.K. Liao, Purification, tandem mass characterization, and inhibition studies of oxidosqualene-lanosterol cyclase enzyme from bovine liver. Archives of biochemistry and biophysics 421 (2004) 42-53.
[19] S. Ozaki, P.R. Ortiz de Montellano, Molecular Engineering of Horseradish Peroxidase: Thioether Sulfoxidation and Styrene Epoxidation by Phe-41 Leucine and Threonine Mutants. Journal of the American Chemical Society 117 (1995) 7056-7064.
[20] J.H.-R.M.B.A.F.G.-C.M.A. Alexander N. P. Hiner, A comparative study of the purity, enzyme activity, and inactivation by hydrogen peroxide of commercially available horseradish peroxidase isoenzymes A and C. Biotechnology and Bioengineering 50 (1996) 655-662.
[21] H.B. Dunford, Peroxidases in Chemistry and Biology, Vol. II, in: J. Everse, Everse, K. E. & Grisham, M. B. (Ed.), CRC,Boca Raton, 1991, pp. 1-24.
附錄一
附錄 1-1 建構不同金屬紫質的MbH64D/V68L/I107M
三重突變肌紅蛋白
將不同金屬的紫質利用蛋白質與輔基的重組實驗步驟(2-2-9 節)
包入MbH64D/V68L/I107M三重突變肌紅蛋白中，並偵測其過氧化酶活性見
【 附 圖 1-1 】。 紫 質 中 間 的 金 屬 置 換 成 鎳 (Ni) ， 包 入 我 們 的
MbH64D/V68L/I107M三重突變肌紅蛋白中對ABTS與H2O2具有不錯的過氧
化酶的活性。利用circular dichroism (CD)光譜圖檢視，其中代表蛋白 質α螺旋結構的波長(208nm, 222nm)形狀均相似，所以其結構並無因
MnPP FePP CoPP NiPP CuPP ZnPP
Metalloprophyrin recnstituted into MbH64D/V68L/I107M
Abs. 405 nm
【附圖1-1】六種不同金屬的三重突變肌紅蛋白MbH64D/V68L/I107M約
2μg與 1 mM ABTS、1mM H2O2 反應後偵測 405 nm的吸光值。
【附圖1-2】circular dichroism (CD)光譜圖分析六種不同金屬的 三重突變肌紅蛋白MbH64D/V68L/I107M。
附錄二
附錄 2-1 單株抗體的製備
抗體是由 B 細胞所分泌的蛋白質，目前廣為應用的抗體分為兩 種 ， 多 株 抗 體 (polyclonal antibody) 和 單 株 抗 體 (monoclonal antibody)。多株抗體是將抗原打入動物體內，經過數次免疫，採集血 清，此血清為多株抗體，好處在於操作過程較為簡單，但其專一性低 對於類似的抗原結構都會反應，稱為交叉反應 (cross reaction)。自 1973 年 Milstein 等科學家的研究發表骨髓瘤細胞 (myeloma)之融合實 驗，製造出單株抗體，彌補了多株抗體的缺點。由於血清中的每一種 抗體是由單一種 B 細胞所產生的，所以將 B 細胞由脾臟取出，單獨 培養成細胞株，即可得到單一種抗體，只會對特定抗原反應，其專一 性較多株抗體高，此稱為單株抗體。由於 B 細胞不易在培養基中生 長，所以無法直接在體外進行培養，因此利用癌細胞不死的生長特 性，透過細胞融合的實驗，和 B 細胞作結合，則可得到在培養基中 永久生長之 B 細胞株，即為融合瘤細胞株 (hybridoma cell)，經由篩 選、大量培養及純化，就可得到大量的單株抗體。
附錄 2-2 免疫動物
將純化得到的肌紅蛋白作為抗原。使用 4-8 週之 BALB/C 小白 鼠，抗原 (100 μg / mouse)加等體積之佐劑 (Freund’s incomplete adjuvant) (Sigma)混合成乳劑，分別於間隔兩週打入小鼠腹腔及背部
皮下慢慢釋出，約施打3 次以上，誘使 B 細胞成熟增殖並生產抗體，
此抗體為多株抗體。
附錄 2-3 骨髓癌細胞 (myeloma cell)
所用之骨髓癌細胞株必需極易增生，與淋巴細胞融合後仍可迅速 發育且分泌高濃度免疫球蛋白。且具有容易與融合細胞分離之特性。
目 前 最 常 使 用 為HGPRT (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase)缺損性骨髓癌細胞，如P3、P3 / 653、NS1、SP2 及FO等細 胞，當細胞培養於HAT (hypoxanthine aminopterin thymidine)培養液 中，其中aminopterin可阻止骨髓癌細胞DNA之正規合成路徑 (de novo synthesis)之進行，使細胞僅能以HGPRT酵素依旁支輔助路徑 (salvage synthesis) 【附圖 2-1】取用hypoxanthine及thymidine合成DNA，若骨 髓癌細胞缺乏HGPRT酵素，無法合成thymidine kinase (TK)及 HGPRT 兩種酵素，此骨髓瘤細胞無法生長；如正常細胞（B淋巴球細胞）則 可經由另一條途徑繼續生長。藉由和脾臟細胞（B細胞）的融合，提 供TK及HGPRT兩種酵素，得以存活增殖。本實驗室採用FO細胞，來 自食品工業研究所，使用DMEM培養液，添加 1.5 g碳酸氫鈉、10 %
BCS及 1 % penicillin / streptomycin (P/S)，培養條件為 37℃，5 % CO2。 融合前一天將細胞分為兩盤作繼代培養以保持細胞正在分裂生長之 狀態。
de novo synthesis
dUMP dTMP DNA
Tetrahydrofolate Dihydrofolate
Aminopterin Reducrase Hypoxanthine HGPRT TK Thy
GMP dTMP
midine
【附圖2-1】 骨髓癌細胞正規合成路徑及旁支輔助路徑。
附錄 2-4 細胞融合
小白鼠在融合前 4 天再次補強免疫，以乙醚昏迷後，從背部以 70 %酒精消毒後，無菌操作解剖取出脾臟，放於含 10 mL DMEM培 養液 (細胞融合過程中皆使用未含BCS之DMEM)之培養皿。將脾臟 壓磨至碎裂，以滴管來回抽吸使細胞分散，經由無菌紗布過濾，再以 10 mL DMEM培養液沖洗。此外，將已事先從T-75 培養皿打下來的FO
細胞，分別離心1200 rpm 5 分鐘，反覆以DMEM培養液沖洗動作二 次，最後懸浮於10 mL DMEM培養液中。取部分細胞做細胞計數，
用trypan blue液計算活細胞率，以脾臟細胞：FO細胞= 4：1 之比例將 細胞混合，離心1200 rpm 5 分鐘，之後去除上清液。然後輕擊桌面打 散細胞，於1 分鐘內，搖晃細胞，同時逐漸滴入 1 mL已加溫到 37℃
之PEG / DMSO混和液，混合後迅速至 37℃水浴緩慢搖晃 1 分鐘，之 後逐漸滴入10 mL已加溫到 37 ℃之DMEM培養液，離心 1000 rpm 5 分鐘，反覆以DMEM培養液沖洗細胞 2 次。計算FO細胞至 5x104 cells / 100 μL HAT培養液之比例，將HY培養液 (已添加 1.5 g 碳酸氫鈉、
20 % FBS及 1 % P / S)及HAT培養液以 50：1 之比例混合，加入適當 體積之HY-HAT培養液與細胞混合，取 100 μL培養液分別加入 96 孔 細胞培養盤之每一孔洞，並在37℃，5 % CO2之條件進行細胞培養。
附錄 2-5 細胞增殖及取樣篩檢
融合後培養之細胞定期觀察其生長條件，融合後第 7 天，每孔加 入50 μL 之 HY-HAT 培養液。七天後，待細胞長滿後，添加 100 μL HY 培養液繼續培養，若有clone 則顏色變黃再添加 100 μL HY 培養液，
取100 μL 之培養液做 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)。首 先，將100 μL 的 0.25mg/mL 純化的肌紅蛋白加入 96 孔 ELISA plate 中，於 4 ℃下隔夜。將放置隔夜之蛋白質溶液倒掉，以 PBS 緩衝液 沖洗之後，將 ELISA plate 倒置拍打將 well 中的水分去除，重複三 次後，加入 350 μL 的 blocking buffer 含有 5%脫脂奶粉溶於 PBS 緩衝 液中，室溫放置 1.5 小時後，以 PBS 緩衝液沖洗拍打去除水分並重複 三次後，以細胞單株抗體作為一抗加入100 μL 之細胞培養液，室溫 反應1.5 小時，倒掉細胞培養液，以 PBS 緩衝液沖洗拍打去除水分並 重複五次後，加入以 PBS 緩衝液 1 : 5000 倍稀釋含有 HRP 酵素的 anti-mouse 抗體，置於室溫下反應 1.5 小時，同樣以 PBS 緩衝液沖洗 拍打去除水分重複五次後，最後以ABTS 呈色試劑呈色。
附錄 2-6 融合細胞之單株化
單株化之方法有多種，但以極限稀釋法 (limiting dilution)最常被 使用。其操作步驟如下：將陽性細胞經以HY培養液洗後，以trypan blue 液計算活細胞率，系列稀釋至30 cells / 10 mL HY培養液為止，混合 均勻，以100 μL / well分裝至 96 孔細胞培養盤，於 37℃，5 % CO2培
養。經 7 天後顯微鏡觀察，若細胞群落在一個以上或形態不對稱者均 棄之。其他單株抗體細胞 (monoclone)則繼續增殖並篩檢其培養液，
陽性細胞群落收集且擴大增殖。
附錄 2-7 單株抗體之產生
使用小白鼠接種法，將6-11 周之BALB/C小白鼠腹腔注射 0.5 mL Pristane (Sigma)，經 7 天後，取融合瘤細胞，PBS緩衝液洗滌 2 次，
混合於 0.5 mL之PBS中，每隻小白鼠腹腔注射 106個細胞。2 周後，
小白鼠腹腔膨脹，用注射針抽取其腹水 (ascites)，經離心去除細胞及 脂肪，加入甘油及NaN3保存在-20℃冰箱中備用
附錄 2-8 利用西方墨點法 (Western blotting)確
認單株抗體之專一性
取40 μL 0.25mg/mL 純化的肌紅蛋白，跑 20 ％的 SDS-PAGE (方 法如同前面描述)。之後將膠片以二次水清洗二次 (搖盪 30 秒)，再浸
在轉印緩衝液 (transfer buffer)中 10 分鐘；同時，將 PVDF 轉印膜用 甲醇浸泡 10 秒，再用二次水清洗數次，並同樣以轉印緩衝液平衡轉 印膜；或者直接將NC 轉印膜直接用轉印緩衝液平衡。轉印槽 (Hoefer) 的電極利用轉印緩衝液潤濕，且準備 4 片已事先浸濕的厚濾紙。先將 一塑膠片 (mask)放在電極上，再將 2 張厚濾紙放在轉印槽上，取一 些轉印緩衝液保持濾紙濕潤，再鋪上已濕潤的轉印膜，再疊上已平衡 好的膠片，最後鋪上2 張厚濾紙即完成三明治疊法【附圖 2-2】。在過 程中每一層都要特別注意不要有氣泡，以免影響轉印的效果。組裝完 成蓋上電極的正極，並在正極上面加上 1 公斤的物品，通入 30 伏特 電壓轉印 30 分鐘。取出轉印膜，將轉印膜右上角截角以為標幟，並 以二次水清洗二次後，加入 5 ％脫脂奶粉 PBS 緩衝液室溫下搖晃 1.5 小時，以覆蓋其他沒有蛋白的部分，倒掉緩衝液後用0.1 ％PBST 緩 衝液 (含 0.1 ％ Tween-20 的 PBS 緩衝液)清洗轉印模 3 次每次 5 分 鐘。以腹水anti-Mb 單株抗體(monoclonal antibody)作為一抗來源，以 PBS 緩衝液 1 : 1000 倍稀釋單株抗體，置於室溫下反應 1.5 小時，倒 掉稀釋液，以PBST 緩衝液清洗 3 次，加入含有 HRP 酵素的 anti-mouse 抗體以PBS 緩衝蓋液 1 : 5000 倍稀釋，置於室溫下反應 1.5 小時，同 樣以PBST 緩衝液沖洗 5 次，最後以 DAB 呈色。結果如【附圖 2-3】
所示，anti-Mb 單株抗體可準確的辨認肌紅蛋白。
Mask 濾紙 轉印膜 膠片 濾紙
【附圖2-2】 西方墨點法三明治疊法。
19 24 31 46 79
K Da M
1
【附圖2-3】 西方墨點法分析純化的 Mb. Lane M：Prestained 蛋 白質marker。Lane 1：anti-Mb 單株抗體辨認肌紅蛋白。