第四章、 材料與方法
第三節 實驗步驟與方法
一、動物誘導及分組
適應兩週後之雄性 Wistar 大鼠，隨機分配為七組，每組六隻；控制組餵予 正常飼料，其餘六組餵予高果糖飼料 ( 含 66%果糖 ) ，誘導其成為糖尿病大鼠。
餵食 12 週後，將動物分組如下：
(1) 控制組：未誘導糖尿病，灌食去離子水。
(2) 負控制組：誘導糖尿病，灌食去離子水。
(3) 正控制組：誘導糖尿病，灌食 TZD 類藥物─ Pioglitazone ( 30 mg/ kg B.W. ) (4) ~ (7)實驗組：誘導糖尿病，灌食不同劑量之 Vescalagin 與 Gallic acid
( 30 mg/ kg B.W.與 10 mg/ kg B.W. ) 實驗動物管餵樣品四週後進行犧牲。
二、詴驗方法
1. 口服葡萄糖耐受性詴驗 ( Oral glucose tolerance test，OGTT )
口服葡萄糖耐受性詴驗乃依據 Clarke 等人 ( 1986 ) 的方法，將大鼠禁食 12 小時後分別秤重，先採集空腹之血糖，再迅速管餵葡萄糖溶液 ( 濃度 1 g/ml dd H20；灌食量 1.5 g/kgBW)，接著再於 30、60、90、120 分鐘四個時間點時 各採一次血。採血方式皆以斷尾採血法進行。採得之血液在 4℃下離心 ( 12000 g， 8 分鐘 ) ，分析血漿中葡萄糖之濃度。
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2. 血液處理
將取得之全血置於 1.5 ml 之 Eppendorf 中，置於離心機中離心 ( 4 ℃，
12000g，8 分鐘 ) 。上層液，即為血漿，待藏於 -20℃備用。
3. 臟器收集
大鼠犧牲時，利用解剖刀自胸腔取出肝臟，並利用紙巾擦拭多餘血液，再予 以秤重。
4. 血漿葡萄糖測定
利用斷尾採血，收集之血液盛裝於 1.5 ml 之 Eppendorf 中，於 4℃，12000 rpm 離心 8 分鐘，取出上層之血漿。利用 glucose kit ( Randox ) 測定血漿中 葡萄糖之含量。
5. 血漿胰島素測定
利用斷尾採血，收集之血液盛裝於 1.5 ml 之 Eppendorf 中，於 4℃，12000 rpm 離心 8 分鐘。利用 insulin kit ( Mercodia AB ) 測定血漿中胰島素之含量。
此 ELISA 微量盤上已 coating 有大鼠單株抗胰島素抗體 ( rat Monoclonal anti-insulin antibody ) ，每 well 先加入 25 μl 血漿樣本或已知濃度之大鼠胰 島素標準品 ( rat insulin standard 0.15~5.5 μg/L ) ，再加入 50μl 接有過氧 化 氫 酶之大鼠 單 株抗胰 島 素抗體 ( peroxidase conjugated rat monoclonal anti-insulin antibody )，置於 25℃以 40rpm 震盪反應 2 小時，進行抗原抗體 反應。之後以清洗溶液 ( washing solution ) 清洗六次，再加入 200 μl 過氧 化氫酶反應基質 ( peroxidase substrate：3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine ) ，避光 反應 15 分鐘後，加入 50 μl 反應終止劑 ( stop solution：1M H2SO4 ) 以 終止呈色反應。最後再以酵素免疫分析儀讀取 450nm 下之吸光值，由標準 曲線換算，便可得到血漿中胰島素之濃度。
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6. 肝臟調控血糖相關蛋白質含量之測定 (1) 肝臟組織蛋白質之萃取方式
參考蘇 ( 2001 ) 之方法，取 0.5 克之肝臟，加入 2 毫升之緩衝溶液 ( 含 0.2% Triton X-100，5 mM EDTA，1 mM PMSF ) 於均質管中，冰浴下以組 織均質器於固定轉速下均質 2 分鐘後，再於 4℃， 16000× g 之條件，離 心 60 分鐘，上層液即為肝臟細胞蛋白質液。
(2) 蛋白質濃度之定量
以胎牛血清蛋白 ( bovine serum albumin；BSA ) 配置成濃度 0、100、200、
300、400 與 500 μg/ml 之蛋白質標準品，使其與蛋白質染劑 ( Bio-rad protein assay dye reagent ) ( 1：4 之比例 ) 反應後於光譜分析儀下測量 595 nm 吸光值，得到蛋白質標準曲線。將樣品稀釋於標準曲線範圍內之濃度 ( 約稀釋 150 倍 ) ，與蛋白質染劑作用後，相對於蛋白質標準曲線，利用 內插法計算出本樣品蛋白質濃度。
(3) 西方轉印分析 ( Western Blot ) 聚丙烯醯胺電泳
先製備 10%之分離膠體 ( separation gel ) ，待其凝固後再加入 4%之焦集 膠體 ( stacking gel ) ，凝固後再將膠片組合至電泳槽上，倒入電泳緩衝溶 液。取出適量蛋白質溶液加入同體積之 SDS-PAGE 樣品溶液及 2 μL 追蹤 染料，混勻後在以 100℃加熱 5 分鐘，冷卻後再以微量吸管注入樣品槽中，
裝上電源蓋，先以 80 V 進行電泳，待其追蹤染料之藍色細線通過焦集膠 體後，再將電壓改成 120 V 繼續進行電泳，待追蹤染料跑出膠體後，關閉 電源，取出膠體進行蛋白質轉印之步驟。
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SDS-PAGE 膠體溶液 ( 單位：mL )
膠體溶液 分離膠體溶液
( Separation gel ) 10%
焦集膠體溶液 ( stacking gel ) 4%
A 3.3 0.495
B 2.5 -
C - 1.24
10% SDS 0.1 0.05
H2O 4.05 3.115
APS 0.05 0.1
總體積 10 5.0
蛋白質轉印 詴劑：
轉印緩衝溶液 ( transfer buffer ) 10X
30.3 g Tris base / 14.42 g Glycine，pH 調至 8.3 後加水定量至 1 L，
使用前稀釋 10 倍後，其中含有 10% 甲醇。
方法：
將 PVDF 轉印膜先以 100% 甲醇潤濕數秒鐘後，浸泡於轉印緩衝液中備 用；而轉印所需之濾紙與海綿也先浸潤於轉印緩衝液中帄衡備用。再將完 成電泳之 SDS-PAGE 膠片浸於轉印緩衝液中帄衡約 5 分鐘，取出轉印卡 匣 ( Bio-rad 濕式轉印槽 ) ，將多孔性海綿、 3M 濾紙、 PVDF membrane、
SDS-PAGE 膠片、3M 濾紙、多孔性海綿依序鋪上，並小心避免任何氣泡 之產生，即完成轉印三明治之組合。隨後，將卡匣組合放入轉印槽中，使
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SDS-PAGE 膠片面朝向負極， PVDF 膜朝向正極，並除去卡匣外之氣泡，
以避免轉印效率降低。於 4℃下以 400 mA 之條件進行 轉印 75 分鐘。此 外，進行蛋白質轉印時，於電泳過程中加入 5 μL prestained protein marker 作為轉印效率之參考。
酵素免疫染色 詴劑：
(A) PBS ( phosphate buffer saline ) 5X
38 g NaCl / 7.8 g NaH2PO4，pH 調整至 8.3 加水定量至 1 L (B)PBST ( phosphate buffer saline and Tween 20 )
PBS 5X 稀釋至 1X，加入 0.05% ( v/v ) Tween 20，即成為 PBST。
方法：
將轉印完成之 PVDF membrane 浸於 5% 脫脂奶 ( 溶於 PBST 中 ) ， 置於室溫中 blocking 1 小時，以阻斷非專一性抗原反應；以 PBST 清洗 三次，每次 15 分鐘，接著再加入一次抗體 ( 以 PBST 稀釋至適當之倍 率 ) 於 4℃ 反應隔夜；倒除一級抗體後，以 PBST 清洗三次，每次 15 分 鐘後，再以 PBST 稀釋鍵結 HRP 之二級抗體，以相同方式作用於 PVDF membrane 1 小時後，以 PBST 清洗三次，每次 15 分鐘，最後以 ECL 方 式呈色，利用 UVP 冷光照膠系統照膠，即可得知雜合反應結果。
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一級與二級抗體使用之濃度
一級抗體 二級抗體 分子量 ( kDa )
Anti-HXK Anti-rabbit ( 1：1000 ) 103 Anti-PFK Anti-rabbit ( 1：1000 ) 63 Anti-Aldolase Anti-rabbit ( 1：1000 ) 37 Anti-GS Anti-rabbit ( 1：2000 ) 84 Anti-IR Anti-mouse ( 1：2000 ) 95 Anti-IRS-1 Anti-mouse ( 1：1000 ) 180 Anti-AKT Anti-rabbit ( 1：2000 ) 60 Anti-PI3-Kinase Anti-rabbi t( 1：2000 ) 85 Anti-Glut2 Anti-rabbit ( 1：2000 ) 57
Anti-rabbit ( 1：1000 ) Anti-rabbit ( 1：1000 ) Anti-rabbit ( 1：1000 ) Anti-rabbit ( 1：1000 ) Anti-rabbit ( 1：1000 ) Anti-rabbit ( 1：1000 )
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7. 肝臟中脂質過氧化物質─丙二醛 ( malondialdehyde,MDA ) 含量之測定
原理：本方法參考 Tatum and Changchit (1990 ) 之方法，脂質過氧化產物 malondialdehyde ( MDA ) 與 thiobarbituric acid ( TBA ) 於酸性高溫下會形 成紅色複合物，此複合物在波長 532 nm 有最高吸光值，經由對照 MDA 標 準曲線以內插法可換算出樣品中 MDA 之含量。
藥品配置：
●Tris-HCl ( 150mM ) 溶液
取 Tris-HCl 粉末 4.728 公克，加去離子水至總體積 200 ml，並且以 1 N NaOH 溶液調整 pH 值至 7.2。
●Ascorbic acid ( 0.1mM ) 溶液
取 Ascorbic acid 17.61 毫克，加去離子水至總體積 10 ml，然後取其中 1 ml 稀釋 100 倍即可。
●TBA ( 0.6%, w/v ) 溶液
取 TBA 0.6 公克，加去離子水 50 ml，以超音波震盪加熱 30 分鐘，至 完全溶解，冷卻後再加去離子水，定量至 100 ml。
●SDS ( 9.8%, w/v ) 溶液
取 SDS 9.8 公克，加入去離子水約 50 ml，緩慢搖晃均勻後靜置至粉末完 全溶解，然後再加去離子水定量至 100 ml。
●FeCl2 ( 4mM ) 溶液
取 FeCl2 50 毫克，加入去離子水 10 ml，待溶解後，再以去離子水定量 至 100 ml。
●TEP 標準溶液
取 25 μl TEP 以乙醇稀釋至 25 ml ( A 液 ) ，4℃ 下可保存一個月。取 500 μl 之 A 液，以乙醇稀釋至 100 ml ( B 液 ) ，4℃ 下可保存 14 天。
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取 B 液稀釋成 10、15、20 μM 之標準溶液，並製作檢量線。
實驗步驟：
(1) 秤取 0.5 公克之肝臟，以 150 mM Tris-HCl ( pH7.2 ) 緩衝溶液，均質 2 分鐘，即為肝臟均質液
(2) 將肝臟均質液以 500 g，10 min 之條件離心，取上清液繼續下面之實驗 (3) 分別加入下面詴劑
(4) 以 Vortex 混合均勻，於 37℃下，水浴培養 1 小時 (5) 將各組詴管加入 500 μl 0.1 N HCl 混合均勻 (6) 200 μl 9.8% SDS 混合均勻
(7) 900μl 超純水混合均勻 (8) 2 ml 0.6% TBA 混合均勻
(9) 95℃ 水浴 30 分鐘後，冰浴，待冷卻至室溫
(10) 加入正丁醇 ( n-butanol ) 5 ml 混合均勻 ( 40sec/tube ) (11) 25℃，1000×g 之離心條件，離心 25 分鐘
(12) 取正丁醇層於 532nm 下，測其吸光值
8. 肝臟中抗氧化能力之測定 (1) 組織均質液製備
取肝臟 0.3 公克，加入 0.5ml 50mM 磷酸鈉緩衝溶液 ( pH7.4 )，於冰浴中 以組織均質機，1400rpm 均質 30sec。再從均質液中取出 200μl 加入 280 μl 50mM 磷酸鈉緩衝溶液 ( pH7.4 ) 及 480μl 2% triton X-100，混合均 勻後，於 4℃ 10000×g，離心 5 分鐘，上清液為組織均質液。
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(2) Glutathione peroxidase ( GSH-Px ) 活性之測定
原理：參考 Paglia and Valentine ( 1967 ) 所提出之方法，乃是利用 glutathione ( GSH ) 為還原當量來源，經 glutathione peroxidase ( GSH-Px ) 作用，
將過氧化物質 cumene hydroperoxide 還原成醇類，再以 NADPH 與 glutathione reductase ( GSSG-R ) 將反應產生的氧化態 glutathione disulfide ( GSSG ) 迅速轉換成還原態，伴隨著 NADPH 氧化成 NADP+。測定每單位時間內 NADPH 氧化成 NADP+的速率 ( 340nm 下吸光值變化 ) 可得知 GSH-Px 活性。一單位 GSH-Px 定義為每分 鐘 NADPH 所氧化的微莫耳數 ( ɛ 340=6.1cm2/μmole )。
藥品配置：
●磷酸鉀緩衝溶液 ( 0.25M，pH7.4 )
取 1.616 公克 KH2PO4、11.551 公克 K2HPO4及 9.306 公克 Na2EDTA 加 入 200ml 去離子水後，以 3M NaOH 調整至 pH7.4，再以去離子水定量 至 250ml，於 4℃可儲存 2 星期。
●0.1% NaHCO3
取 0.05 公克 NaHCO3加入 49.95ml 去離子水，室溫下儲存備用。
●40mM glutathione ( GSH ) (避光，當日配置)
取 0.0122 公克 GSH 加入 1 ml 0.25M 磷酸鉀緩衝溶液 ( pH7.4 )，於冰浴 中備用。
●5 unit/ ml glutathione reductase ( GSSG-R ) (避光，當日配置)
取 5unit GSSG-R 加入 1 ml 0.25M 磷酸鉀緩衝溶液 ( pH7.4 )，於冰浴 中備用。
●20mM NADPH (避光，當日配置)
取 0.0017 公克 NADPH 加入 100μl 1% NaHCO3溶液，於冰浴中備用。
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●15mM cumene hydroperoxide (避光，當日配置)
取 2.283μl cumene hydroperoxide 加入 1 ml 0.25M 磷酸鉀緩衝溶液 ( pH7.4 )，於冰浴中備用。
實驗步驟：
取 250μl 組織均質液加入 2250μl Na-P Buffer ( pH7.4 ) ( 稀釋 10 倍 ) 後，再取 500μl 均質液依序加入 1000μl 5unit/ ml GSSG-R，250μl 40mM GSH 以及 3100μl 0.25M K-P Buffer ( pH7.4 )混合均勻，加入當日 新鮮配置之 50μl 20mM NADPH，最後再加入 100μl 15mM cumene hydroperoxide，混合均勻後立即以 340nm 測定吸光值( 25℃中每 15sec 讀 取一次吸光值，測定 1min 中內吸光值之變化量 )。
(3) Superoxide dismutase ( SOD ) 活性之測定
原理：本方法參考 Marklund and Marklund ( 1974 ) 所提之方法，其測定原 理乃是 pyrogallol (鄰苯三酚) 在 pH 值小於 7 的環境中甚為穩定，
但若在 pH 值大於 7 的環境下會發生自氧化反應，產生超氧陰離子 自由基，同時以一定速率生成有色的中間產物紅桔酚，而 SOD 可 以將超氧陰離子自由基歧化，因而使鄰苯三酚的自氧化速率受到抑 制，再根據抑制程度高低，可換算 SOD 之活性。
藥品配置：
●50mM Tris-HCl 緩衝溶液 ( pH8.2 )
取 1.514 公克 trizma base、0.093 公克 Na2EDTA 加入 125ml 去離子水，
以 6N HCl 調整至 pH8.2，再以去離子水定量至 250ml，於 4℃中可儲存 2 星期。
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●50mM pyrogallol
取 0.315 公克 pyrogallol 以 0.01N HCl 定量至 50ml，室溫下於褐色瓶中 可儲存 1 星期。
實驗步驟：
取 20μl 均質液加入 6 ml Tris-HCl，再加入 30μl pyrogallol，上下搖 晃均勻後，於 325nm 下測其吸光值 ( 每 15sec 測一次，測定 1min 中吸光 值變化量 )。
(4) Catalase 活性之測定
原理：參考 Aebi ( 1983 ) 之方法，原理為在波長 240nm 時，H2O2會在 Catalase 的存在下，逐漸減少其吸光值 ( ɛ240=40.0 cm2/μmole )。
藉由其單位時間內吸光值的變化量，可測得 catalase 的活性。一單 位 catalase 定義為每分鐘 H2O2所消耗的毫莫耳數。
藥品配置：
●50mM 磷酸鈉緩衝溶液 ( pH7.0 )
取 30.5 ml 0.2M Na2HPO4及 19.5 ml 0.2M NaH2PO4以去離水定量至 200ml，於 4℃可儲存 2 星期。
●30mM H2O2 (當日配置)
取 0.17 ml 30% H2O2以 50mM 磷酸鈉緩衝溶液 ( pH7.0 ) 定量至 25ml，
於冰浴中備用。
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實驗步驟：
將肝臟均質液稀釋 1000 倍後，取 6 ml 稀釋液加入 3 ml H2O2溶液，立 即混合均勻後，以分光光度計於 240nm 下，測定其吸光值之變化量 ( 每 15sec 測一次，測定 1 分鐘內吸光值變化量 )。
三、統計分析
實驗結果以 SAS v 9.2 版(SAS Institute Inc，Cary，NC，USA)軟體執行統計分 析，以 one-way ANOVA 判定有無差異性，再以鄧氏新多變預測驗法(Duncan’s New Multiple Range Test)檢定兩兩之間是否有顯著差異，以 p < 0.05 作為有顯著性差異 之標準。
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