蓮霧帅果分離物─ Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠肝臟蛋

A. 蓮霧帅果分離物─ Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠肝臟醣類代 謝之影響

1. 糖解作用 ( Glycolysis )

糖解作用是所有生物細胞進行葡萄糖代謝過程的第一步，一分子的葡 萄糖，經過十個步驟、十個酵素作用，轉變成兩分子丙酮酸 ( pyruvate ) 。 許多動物實驗結果顯示第二型糖尿病鼠的 Glycolysis 相關酵素活性顯著 下降 ( Panneerselvam and Govindaswamy，2002；Punithavathi et al.，2011 )。

本實驗以高低劑量之 Gallic acid 管餵高果糖飼料誘導糖尿病前期大 鼠，皆能改善肝臟中 Hexokinase 蛋白質之表現量 ( 圖 5-17 )。糖解作用 中催化第一個步驟之酵素為 Hexokinase ，此酶將葡萄糖磷酸化，轉換成 glucose-6-phosphate 才能繼續以下的步驟。細胞研究發現，經胰島素處理 30 分鐘後，此酶活性會上升而提升葡萄糖利用率 ( Ivy et al.，1986 )；動物實 驗發現，以 STZ 誘導之糖尿病鼠，Hexokinase 活性大幅下降，而在給予兩 個劑量之 Gallic acid ( 10 mg / Kg B. W. 與 20 mg / Kg B. W. ) 皆能改善 Hexokinase 之活性。

Phosphofructokinase ( PFK ) 為糖解作用中第三個步驟，也是速率決定 之 關 鍵 酵 素 ， 其 將 fructose-6-phosphate 磷 酸 化 轉 變 成 fructose-1,6-bisphosphate 此步驟為不可逆反應。 PFK 之活性會受到細胞 或組織所分泌之物質如胰島素、細胞激素的調節 ( Silva et al.，2010 )，當 給 予 胰 島 素 時 ， 胰 島 素 會 刺 激 細 胞 增 加 促 PFK 活 性 因 子 fructose-2,6-bisphosphate ( F-2,6-BP ) 的 合 成，而造 成 PFK 活 性上升 ( Deprez et al.，1997；Rider et al.，2004 ) 。

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Aldolase 亦 是 糖 解 作 用 中 之 重 要 酵 素 之 一 ， 會 將 二 磷 酸 己 糖 ( fructose-1,6-bisphosphate ) 分 解 為 glyceraldehye-3-phosphate 與 dihydroxyacetone phosphate ( DHAP ) 等兩個磷酸三碳糖，此反應為可逆醇 醛縮合反應 ( Aldol reaction ) ( Yamakoshi et al.，2011)。此酵素活性除了與 糖解作用具關連性外，臨床上也可利用血清中醛縮酶 ( Aldolase ) 活性檢 測病患肝臟相關疾病，如：肝硬化、慢性肝炎。

本實驗結果顯示 ( 圖 5-17、圖 5-18、圖 5-19 )，糖尿病前期大鼠管 餵高低劑量之 Gallic acid 後，其 Hexokinase、Phosphofructokinase 與 Aldolase 等三個糖解作用之酵素之蛋白質表現量皆有上升之趨勢。可加速 進入細胞葡萄糖進行糖解作用之速率，並產生能量以供細胞利用。

2. 肝醣合成 ( Glycogensis )

哺乳動物的周邊組織及肝臟之肝糖合成作用是對於攝食後血液中葡萄 糖含量增加的一種生理反應 ( Ferrer et al.，2003 )。正常情況下，胰島素會 引發一連串訊息傳遞，經改變磷酸化狀態以活化肝醣合成酶 ( glycogen synthase，GS ) ，促使葡萄糖合成肝醣儲存，並降低血液中過多的血糖 ( Saltiel and Kahn，2001 ) 。

本實驗結果顯示 ( 圖 5-20 )，高低劑量之 Gallic acid 可提高糖尿病 前期大鼠肝臟中 GS 蛋白質之表現量，故能有效地將體內多餘的葡萄糖轉 換成肝醣，儲存於肝臟中。

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3. 糖質新生作用 ( Gluconeogenesis )

糖質新生作用主要作用部位為肝臟，其代謝途徑是糖解作用的逆向過 程。此作用主要是將非醣物質 ( 乳酸、某些胺基酸及甘油 ) 轉換為葡萄 糖，對生物體的意義為預防體內葡萄糖過低 ( 葡萄糖是紅血球唯一能夠使 用的能量 )，人體保護機轉，可提供警告訊息及升血糖作用，來應付低血 糖 ( Reginald and Charies，2005)。體內儲存的肝醣是人體對抗低血糖情況 時的重要物質之一，經由肝醣分解作用可產生葡萄糖，在夜間空腹時有 75%

的葡萄糖是由肝臟中的肝醣提供 ;不過肝醣的儲存量約只夠使用 l2 至 16 小時，因此還需要糖質新生作用，將一些非醣類之養分轉變成葡萄糖以 供人體使用，在長時間饑餓下，這種作用是最主要的葡萄糖提供方式，當 人體饑餓兩天半時，糖質新生負責了 97%以上的葡萄糖供應 ( Reginald and Charies，2005)。

許多動物實驗結果顯示第二型糖尿病鼠的糖質新生酵素活性增加，而 與其逆向代謝的糖解作用酵素活性則會下降 ( Clore et al.，2000 ) 。 Fructose-1,6-bisphosphatase ( F-1,6-BP ) 是糖質新生作用之速率決定步驟的 關鍵酵素；本實驗結果發現 HF 組糖尿病前期大鼠 F-1,6-BP 蛋白質表現 量明顯低於 Control 組 ( 圖 5-21 )，此結果與其他學者研究報告之結果相 符 Punithavathi et al.，2011 )。

綜合上述結果推論 ( 圖 5-21 )， Gallic acid 管餵高果糖飼料誘導 糖尿病鼠四周後，會增加其體內糖解作用與肝醣合成，降低了其逆向代謝 的糖解作用，改善細胞對葡萄糖的利用率。

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4. 磷酸五碳糖途徑 ( Phophate Pentose Pathway，PPP)

磷酸五碳糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）是將含有磷酸根 的 葡 萄 糖 ( Glucose-6-phosphate ) 經 由 脫 氫 酶 ( Glucose-6-phosphate Dehydrogenase ) 作用，釋出一分子之 CO2，並形成兩分子 NADPH，所剩 下的五碳酸則進入各種合成、代謝路徑。還原態的 NADPH 可以提供一些 大分子，特別是脂肪酸合成時所需的能量。五碳醣 ( ribose 5-phosphate ) 等 中間產物，則是核酸 ( DNA、RNA ) 或木質素等的基本成分，對於新細胞 的形成有所助益，因此 PPP 對於成長中的分生組織而言是相當重要的 ( Reginald and Charies，2005)。

Glucose-6-phosphate dehydrogenase 是 PPP 中速率決定步驟的重要酵 素，可將 glucose-6-phosphate 脫氫後形成 6-phosphogluconolactone，並產 生 NADPH ( Abdel-Rahim et al.，1992 ) 。當外來物的刺激，如：藥物、發 炎反應、化學氧化物、UV 等，皆會促使體內 ROS 大量產生而消耗大量 的 G6PD，甚至會導致酵素失活 ( Nikolaidis et al.，2006 ) 。本實驗結果 顯示 ( 圖 5-22 )，雖然餵食高、低劑量之 Gallic acid 並未改善高果糖飲 食誘導糖尿病前期大鼠肝臟中 G6PD 蛋白質表現量，但其 G6PD 表顯量 仍有小幅增加，且回復到與正常大鼠相當之程度，表示 Gallic acid 仍具有 促進肝臟中醣類進行 pentose phosphate pathway 之效果。

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B. 蓮霧帅果分離物─ Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠肝臟胰島素 訊息傳遞路徑之影響

1. 胰島素受器 ( Insulin receptor，IR )

胰島素受器 ( Insulin receptor，IR ) 是細胞膜上具四構體之醣蛋白，

正常情況下胰島素會與其結合，並發生自體磷酸化作用，以活化下游分 子而調解體內葡萄糖之帄衡 ( White，2003；Zick，2001 ) 。Tzeng 等人 ( 2011 )發現以 60% 果糖飲食誘導之糖尿病大鼠，其肌肉中的 IR 表現量 有顯著下降之趨勢 ( Tzeng et al.，2011)。高果糖飲食誘導胰島素阻抗之 大鼠，其體內細胞內氧化壓力增加或是過多活性氧屬自由基 ( Reactive oxygen species，ROS ) 亦會經由活化 IKKβ 和 TNF-α 等而導致胰島素 阻抗 ( Togashi et al.，2000 ) 。

本實驗以高果糖飼料誘導之糖尿病前期大鼠也觀察到此現象 ( 圖 23 )，證實於高果糖飲食下，會使體內氧化壓力增加抑制大鼠肝臟中 IR 之表現，進一步抑制了下游訊息傳遞分子之活化，而導致胰島素阻抗，

體內調解葡萄糖之能力下降。而糖尿病前期大鼠在管餵 Gallic acid 四周 後，肝臟中 IR 表現量有明顯增加之趨勢 ( 圖 5-23 )，另一方面，前述 Gallic acid 可以提升 SOD、Catalase 與 Glutathione peroxidase 三種抗氧 化酵素活性 ( 圖 5-14、圖 5-15、圖 5-16 )，故推論這兩種植化素促進糖 尿病前期大鼠肝臟中 IR 表現量提升之原因，可能是因為改善了糖尿病 前期大鼠之體內氧化壓力所致。

2. 胰島素受器受質 ( Insulin receptor substate-1，IRS-1 )

胰島素受器受質 ( IRS-1 ) 為細胞內訊息傳遞之載體蛋白，負責協調 合併細胞外重要的生物訊息，例如：辨認胰島素受器所供給的訊息。Tzeng 等人 ( 2011 ) 發現以 60% 果糖飲食誘導之糖尿病大鼠，其肌肉中的

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IRS-1 表現量有顯著下降之趨勢 ( Tzeng et al.，2011)。

本實驗結果，也發現，高果糖飼料誘導的糖尿病前期大鼠，其肝臟 中 IRS-1 表現量有下降之趨勢 ( 圖 5-24 )。而糖尿病前期大鼠管餵 Gallic acid 四周後，肝臟中 IRS-1 表現量有明顯增加之趨勢，推測其原 因亦可能是這兩種植化素改善了糖尿病前期大鼠體內氧化壓力之關係。

3. 磷酸肌醇激酶 ( Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K )

PI3K 在胰島素訊息傳遞中扮演非常重要的角色，其活化後可傳遞下 游多種訊號。 PI3K 可以催化 phosphoinositides 3 號位置磷酸化，形 成 phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphates ﹝ PI ( 3,4,5 ) P3 ﹞ 。而

﹝ PI ( 3,4,5 ) P₃﹞ 會與含有 pleckstrin homology ( PH ) domains 的 訊息蛋白結合，改變其活性或細胞內位置，促使 PI3K 下游 serine/

threonine kinase 的 AKT 活化 ( Lietzke et al.，2000 ) 。當 PI3K 作用 被阻斷時，會抑制了胰島素刺激葡萄糖吸收、肝醣、脂肪和蛋白質合成 及基因表現調控等作用 ( Cichy et al.，1998 ) 。Tzeng 等人發現以 60%

果糖飲食誘導之糖尿病大鼠，其肌肉中的 PI3K 表現量亦有顯著下降之 趨勢 ( Tzeng et al.，2011)。

實驗結果，也發現高果糖飼料誘導的糖尿病前期大鼠，其肝臟中 PI3K 表現量有下降之趨勢 ( 圖 5-25 )；而糖尿病前期大鼠在給予樣品

─ Gallic acid 四周後，改善了氧化壓力，也增加了肝臟中 PI3K 之表現 量。

4. AKT/ Protein Kinase B ( AKT/ PKB )

AKT 又稱為 PKB，為細胞中管控生長的主要蛋白。AKT 可藉由活 化 GSK-3α、GSK-β，進一步調控葡萄糖轉運蛋白及肝醣合成，而 AKT

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之活性受到上游蛋白 PI3K 所調控。若使用 PI3K 抑制劑 ( wortmannin ) 將上游調控蛋白質抑制後，會導致 AKT 無法磷酸化；胰島素訊息傳遞 中 IRS-1 酪胺酸磷酸化形式的蛋白質與 IRS-1 連結的 PI3K 活性可使 得 AKT 磷酸化，以上推測 AKT 是藉上游訊息傳遞而產生活性。研究 發現以果糖飲食誘導之糖尿病大鼠，其肌肉中的 PI3K 表現量有顯著下 降之趨勢 ( Tzeng et al.，2011)。

本實驗結果發現，高果糖飼料誘導的糖尿病前期大鼠，其肝臟中 AKT 表現量有下降之趨勢 ( 圖 5-26 )，推測可能是因上游調控蛋白質 ( IR、IRS-1、PI3K ) 受抑制後，會導致 AKT 無法磷酸化。糖尿病前期 大鼠管餵 Gallic acid 四周後，肝臟中 IR、IRS-1、PI3K ( 圖 5-23、圖 5-24、

圖 5-25 ) 表現量皆有明顯增加之趨勢，而在 AKT 結果部分，表現量也 有上升之趨勢 ( 圖 5-26 )，故推測上游調控蛋白活化與否，會影響肝臟 中 AKT 之表現量多寡。

5. 葡萄糖轉運蛋白 2 ( Glucose transporter-2，GLUT-2 )

目前至少發現有 12 種葡萄糖轉運蛋白 ( Glucose transporter-2 ) 分 布不同的細胞中負責葡萄萄攝入之工作 ( Joost et al.，2002 ) 。而本研究 所探討的 GLUT-2，主要存在於小腸、肝臟、腎臟與胰臟 β-cell ( Thorens et al.，1995 ) ，與其他葡萄糖轉運蛋白不同的是： GLUT-2 為葡萄糖敏

感性轉運蛋白，不直接受到胰島素調控，在肝中負責細胞葡萄糖攝入及 輸出 ( James，1995 ) ；而 GLUT-2 需受到 AKT 刺激才能被活化，進而 轉移到細胞膜上協助葡萄糖之攝入。

本實驗結果觀察到在高果糖飼料誘導之糖尿病 前期大鼠肝臟中 GLUT-2 表現量下降約 43%，而在管餵 Gallic acid 四周後，大鼠肝臟中 GLUT-2 表現量明顯提升 ( 圖 5-27 )。推論其可能原因是上游 AKT 活

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化後刺激 GLUT-2 表現量顯著增加。

綜合以上結果推論，Gallic acid 可以增加糖尿病前期大鼠體內抗氧 化酵素活性，以清除體內過氧化物質，因此改善了胰島素阻抗程度，使 胰島素訊息傳遞路徑順利進行，並使血液中葡萄糖能有效被細胞利用，

因此改善高血糖之情況。另一方面，因為葡萄糖有效進入細胞，使細胞 有足夠能量可利用，降低脂質分解作用，血清中游離脂肪酸濃度也因此

因此改善高血糖之情況。另一方面，因為葡萄糖有效進入細胞，使細胞 有足夠能量可利用，降低脂質分解作用，血清中游離脂肪酸濃度也因此