蓮霧幼果分離物 ─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠之影響

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(1)國立臺灣師範大學人類發展與家庭學系碩士論文. 蓮霧帅果分離物 ─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠之影響 Effects of vescalagin and gallic acid isolated from unripe wax apple fruit on high-fructose diet-induced prediabetic rats. 指導教授：沈賜川博士吳瑞碧博士研究生：施瑞雯. 中華民國一百零一年八月.

(2) 致謝本論文承蒙恩師沈賜川與吳瑞碧兩位老師於碩士班兩年期間在學業及研究上的指導與照顧，受益良多，師恩畢生難忘，在此向兩位老師致上最深的感謝。文稿初成，感謝台北醫學大學林士祥博士於百忙之中撥冗審閱與指導我的論文，並給予許多寶貴的建議，讓學生得到更多學習的機會，使得論文更加流暢完善，於此致上最深的謝意。修業期間，感謝所上所有老師與助教的指導與照顧，使學生可以順利完成碩士學位。感謝台灣大學食品科技研究所 R305 的毓玲學姊、培梃學長、育諄學長、馨云學姊、佩芬學姊、文昌學長、巧俐學姊、鈺蒨學姊、雅筑、弘典、基彰，謝謝你們帄日的照顧；實驗室的學弟妹甄雯、貴蘭、家銘、柏伶、斌雁，謝謝你們帄時的幫忙，祝福你們未來在實驗與生活可以一切順利。還有，感謝師大研究所的大家，總是非常關心我健康的盈堤學姊、像姐姐一樣照顧我的葵蓉學姊、給我很多寶貴意見的宥苡學姊，謝謝你們把我當妹妹般的照顧；還有碩二時代的蕓菁、忻蓉、欣瑩、鈺涵，碩士兩年多虧有你們這些好姊妹的相互支持，很多困難才能迎刃而解。蕓菁、欣瑩、鈺涵祝福你們，韓國交換學生之旅一切順利；也祝福忻蓉工作一切順利。感謝我的大學同學─大包、玉潔、奶茶、雨潔、大寶、大頭、王瑋、書萱、短伯、陳熊熊，有你們陪伴的台北，一點也不孤單!!還有其他的朋友，圈圈、宜珊、便便、小標、小橋、小布、徐夢鄉、建瑋、Tony、兔兔、阿昌、小寧、戴君、冠佑，謝謝帄常的照顧與關心，還要謝謝你們總是空出你們的耳朵聽我抱怨 lab 大小事。最後，要感謝我親愛的家人，尤其是最支持我的爸爸，謝謝您無怨無悔的付出，讓我可以無憂無慮、專心於課業上；我最愛的媽媽，感謝您總是在我回家時準備我最愛吃的肉丸子和筍子湯，滿足每天外食的我；謝謝最貼心的妹妹─瑞雲，總是默默地、無怨無悔地幫助我，身為姐姐的我實在慚愧啊!! 還有親愛的奶奶與.

(3) 外婆，您們的鼓勵是我前進的動力，您們也要繼續健康下去喔!!感謝，男友及男友的奶奶、爸爸與媽媽，謝謝您們總是來電關心我的健康，多虧有您們的鼓勵，才能如期完成學業。還有，待我如女兒的伯父與伯母、遠在大陸的寶哥、美麗的堂嫂、兩個可愛又貼心的小姪女─小妤、沄沄、好事將近的建安哥哥、婉鈞堂嫂，讓我即使離鄉背井、隻身北上唸書，還可以感受到家人的關心與溫暖，你們的恩情沒齒難忘。在此，將兩年的成果與您們分享，同時祝福所有關心我的家人、幫助我的朋友們，願你們帄安、健康。. 施瑞雯謹致於國立台灣師範大學人類發展與家庭教育研究所中華民國一百零一年八月.

(4) 中文摘要糖尿病患者中約有 95%屬於第二型糖尿病，其主因多為胰島素阻抗而導致高血糖之情況。已有許多文獻證實桃金孃科 ( Myrtaceae family ) 植物具抗糖尿病之效用，本研究室先前以桃金孃科植物中的蓮霧帅果萃取物為材料，經分離、純化、鑑定與胰島素阻抗細胞模式詴驗後，確認具有抗糖尿病潛力的活性化合物 Vescalagin 與 Gallic acid 。本研究進一步進行動物實驗，探討 Vescalagin 與 Gallic acid 對以高果糖飼料誘導之高血糖、高胰島素血症糖尿病前期大鼠肝臟組織中胰島素阻抗與醣類代謝之影響，並探討其對改善糖尿病前期大鼠體內抗發炎與抗氧化之效果。結果顯示，Vescalagin 與 Gallic acid 具有明顯降低高果糖飼料誘導糖尿病大鼠血糖之效果。西方墨點法分析結果顯示，在胰島素訊息傳遞部分， Vescalagin 與 Gallic acid 可以增加胰島素受器( insulin receptor，IR )、胰島素受器受質 ( insulin receptor substrate-1，IRS-1 ) 、磷酸肌醇 3 激酶 ( Phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K ) 、 AKT/蛋白激酶 B ( AKT/Protein kinase B，AKT/PKB )、葡萄糖轉運蛋白 2 ( glucose transporter-2，GLUT2 )等蛋白質之表現量。在醣類代謝部分， Vescalagin 與 Gallic acid 可以增加糖解作用酵素，包括 Hexokinase 、 Phosphofructokinase 與 Aldolase 之蛋白質表現量；肝醣合成酵素，如 Glycogen synthase 之表現亦增加；然而糖質新生作用酵素，如 Frucotse-1,6-bisphosphatase 之表現會降低；而在磷酸五碳糖途徑酵素，如 Glucose-6-phosphate dehydrogenase 之表現亦會增加。在抗發炎反應部分， Vescalagin 與 Gallic acid 降低了 NF-κB 路徑中的 NF-κB、COX-2、MCP-1 與 ICAM-1 等發炎反應相關蛋白質之表現量。在抗氧化部分， Vescalagin 與 Gallic acid 則是增加了 SOD 、 Catalase 與 Glutathione peroxidase 酵素之活性，並且降低了體內脂質過氧化之程度。根據上述結果推測，蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 可能藉由降低發炎反應. I.

(5) 及氧化壓力，因而改善高果糖飼料誘發之糖尿病前期大鼠胰島素阻抗現象，並調節醣類的正常代謝與利用。. 關鍵字：糖尿病前期、胰島素阻抗、發炎反應、Vescalagin、Gallic acid. II.

(6) Abstract. Around 95% of the diabetic incidences belong to Type 2 diabetes mellitus (Type 2 DM). Type 2 DM is characterized as the insulin resistance and leaded to hyperglycemia. Previous studies have been confirmed the anti-diabetic effect of Myrtaceae family plants. Our laboratory previously found that vescalagin and gallic acid from wax apple, belongs to Maytaceae family plant and is one of important economic fruits in Taiwan and Oriental, fruit possessed potential on anti-diabetic in insulin resistance cell model. In the present study, we investigated the effect of vescalagin and gallic acid from pink wax. apple. on. ameliorating. carbohydrate. metabolism,. insulin. resistance,. anti-inflammation and antioxidation in vivo in high fructose diet (HFD)-induced prediabetic rats. The results show that vescalagin and gallic acid from pink wax apple significantly decrease blood glucose level in HFD-induced prediabetic rats. The Western blot analysis reveals vescalagin and gallic acid promote the expression of insulin signaling-associated protein, including insulin receptor (IR), insulin receptor substrate-1 (IRS-1), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K), AKT/Protein kinase B (AKT/ PKB) and glucose transporter-2 (GLUT2) in HFD rats. In the aspect of. III.

(7) carbohydrate metabolism in liver, the results revealed that vescalagin and gallic acid increases the protein expression of glycolysis enzymes, including hexokinase, phosphofructokinase and aldolase; increases the protein synthase; decreases the protein. expression of glycogen. expressions of frucotse-1,6-bisphosphatase; increases. the protein expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Vescalagin and gallic acid decreased the expression of inflammatory factors, such as NF-κB, COX-2, MCP-1 and ICAM-1 I D in HFD rats. Vescalagin and gallic acid also increased the activity of anti-oxidative enzymes, including SOD, catalase and glutathione peroxidase, and decrease the production of MDA in lipid peroxidation. In conclusion, vescalagin and gallic acid from pink wax apple fruit may decrease blood glucose level via their anti-inflammation and anti-oxidation stress abilities, therefore subsequently ameliorate the insulin resistance and carbohydrate metabolism in high fructose diet-induced prediabetic rats.. Key words： Prediabetes mellitus, insulin resistance, inflammation, Vescalagin, Gallic acid. IV.

(8) 目錄. 第一章、前言 ………………………………………………………………………1 第二章、文獻回顧 …………………………………………………………………3 第一節糖尿病 ……………………………………………………………………3 一、糖尿病流行病學……………………………………………………………3 二、糖尿病之定義………………………………………………………………3 三、糖尿病分類…………………………………………………………………6 第二節胰島素 ……………………………………………………………………10 一、胰島素簡介…………………………………………………………………10 二、胰島素之作用………………………………………………………………10 三、胰島素於細胞層次之作用…………………………………………………11 四、胰島素訊息傳遞路徑………………………………………………………12 五、胰島素與三大營養素代謝之作用 ………………………………………..18 第三節胰島素阻抗………………………………………………………………..20 一、胰島素阻抗 ………………………………………………………………..20 二、高果糖飲食與胰島素阻抗 ………………………………………………..20 三、細胞內氧化壓力與胰島素阻抗……………………………………………22 四、發炎反應與胰島素阻抗……………………………………………………24 第四節體內抗氧化系統……………………………………………………….….27 一、自由基與活性氧之簡介……………………………………………………27 二、自由基對生物體之傷害……………………………………………………28 三、體內的抗氧化系統…………………………………………………………29 第五節抗糖尿病物質與酚類化合物…………………………………………..…33 一、常見之抗糖尿病藥物 ……………………………………………………..33 V.

(9) 二、酚酸化合物與糖尿病 ……………………………………………………35 第六節蓮霧帅果分離物─Vescalagin 與 Gallic acid……………………………39 一、蓮霧帅果分離物─Vescalagin 與 Gallic acid……………………………..39 二、Vescalagin …………………………………………………………………39 三、Gallic acid………………………………………………………………….40 第三章、研究動機與實驗架構……………………………………………………42 第一節研究動機與目的…………………………………………………………42 第二節實驗架構…………………………………………………………………43 第四章、材料與方法………………………………………………………………44 第一節蓮霧帅果分離物─Vescalagin 與 Gallic acid 之製備…………………...44 第二節實驗材料…………………………………………………………………46 第三節實驗步驟與方法…………………………………………………………51 第五章、結果………………………………………………………………………63 第一節蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠之影響……………………………………………………………………..63 一、蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠生理、生化之影響………………………………………………………………..63 二、蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠肝臟醣類代謝、胰島素訊息傳遞與發炎反應之影響…………………………..70 第二節蓮霧帅果分離物─ Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠之影響…………………………………………………………………………76 一、蓮霧帅果分離物─ Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠生理、生化之影響………………………………………………………………..76 二、蓮霧帅果分離物─ Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠肝臟醣類代謝、胰島素訊息傳遞與發炎反應之影響……………………….….83 VI.

(10) 第六章、討論………………………………………………………………………89 第一節、粉紅種蓮霧帅果分離物─Vescalagin 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠之影響………………………………………………………………89 一、蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠生理、生化之影響………………………………………………………………...89 二、蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠肝臟蛋白質表現量之影響…………………………………………………..…….98 第二節、粉紅種蓮霧帅果分離物─ Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠之影響…………………………………………………………..109 一、蓮霧帅果分離物─ Gallic acid 對高果糖尿病前期大鼠生理、生化之影響 ……………………………………………………………………………109 二、蓮霧帅果分離物─ Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠肝臟蛋白質表現量之影響………………………………………………………118 第七章、結論………………………………..……………………………………129 第八章、參考文獻………………………………………………………………..162 第九章、附件……………………………………………………………………..180. VII.

(11) 圖次. 圖 2-1、胰島素調節之代謝作用…………………………………………………..11 圖 2-2、胰島素訊息傳遞路徑……………………………………………………..12 圖 2-3、葡萄糖轉運蛋白之基本構型……………………………………………..15 圖 2-4、小腸上皮細胞葡萄糖運送方式…………………………………………..15 圖 2-5、氧化壓力活化絲胺酸激酶誘導胰島素阻抗……………………………..22 圖 2-6、肝臟組織中番木鱉甘抗氧化之機制……………………………………..26 圖 2-7、自由基與活性氧的生成途徑……………………………………………..28 圖 2-8、Hydroxycinnamic acid 與 Hydroxybenzoic acid 之化學結構………….36 圖 2-9、Vescalagin 結構圖………………………………………………………...41 圖 2-10、Gallic acid 結構圖……………………………………………………….41 圖 3-1、實驗架構…………………………………………………………………...43 圖 5-1、蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠攝食量之影響…………………………………………..131 圖 5-2、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠體重之變化………………………………………..132 圖 5-3、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠空腹血液葡萄糖濃度之變化………………...…...133 圖 5-4、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠血中胰島素濃度之變化…………………………..134 圖 5-5、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠血中 C-胜肽濃度之變...………………………….135. VIII.

(12) 圖 5-6、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠 HOMA-IR Index 之變化………………………136 圖 5-7、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠血中果糖胺之變化……………………………...137 圖 5-8、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠口服葡萄糖耐受性之變化……………………...138 圖 5-9、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠口服葡萄糖耐受性曲線下面積之變化………...139 圖 5-10、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠血中游離脂肪酸之變化…………………….…..140 圖 5-11、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠血中三酸甘油酯濃度之變化………………..…..141 圖 5-12、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠肝臟體重之變化………………………………….142 圖 5-13、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠脂質過氧化物之變化……………………………..143 圖 5-14、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠超氧歧化酶之變化………………………………..144 圖 5-15、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠觸媒之變化………………………………………..145 圖 5-16、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠麩胱甘肽過氧化酶之變化……………..………...146 圖 5-17、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠六碳醣激酶之表現………………………………..147. IX.

(13) 圖 5-18、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠磷酸果糖激酶之表現…………………………….148 圖 5-19、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠醛縮酶之表現…………………………………….149 圖 5-20、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠肝醣合成酶之表現………………………………..150 圖 5-21、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠果糖-1,6-二磷酸酶之表現………………………..151 圖 5-22、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠葡萄糖-6-磷酸脫氫酶之表現…………………….152 圖 5-23、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠胰島素受器之表現……………………………….153 圖 5-24、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠胰島素受器受質之表現………………………….154 圖 5-25、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠磷酸肌醇 3 激酶之表現………………………….155 圖 5-26、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠 AKT/ PKB 之表現……………………………….156 圖 5-27、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠葡萄糖轉運蛋白-2 之表現…………………...…..157 圖 5-28、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠細胞核轉錄因子之表現…………………………..158 圖 5-29、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠環氧化酶-2 之表現……………………………….159. X.

(14) 圖 5-30、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠單核球趨化蛋白-1 之表現………………………..160 圖 5-31、管餵蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic acid 對高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠細胞間黏附分子-1 之表現………………………..161 圖 7-1、蓮霧帅果分離物─ Vescalagin 與 Gallic aicd 改善高果糖飼料誘導糖尿病前期大鼠胰島素阻抗、醣類代謝、抗發炎可能之機制…………162. 表次. 表 2-1、糖尿病診斷標準………………………………………………………………5 表 2-2、輔助性葡萄糖轉運蛋白種類…………………………………………………17. XI.

(15) 第一章、. 前言. 醫藥科技的發達、公共衛生的改善與進步，使得傳染性疾病發生率逐漸減少；但隨著飲食精緻化、生活型態改變，慢性疾病罹病率快速上升。根據行政院衛生署統計資料顯示，糖尿病於 1987 年以後即位居台灣十大死因第五位，其中又以第 2 型糖尿病 ( 舊稱為非胰島素依賴型糖尿病 non-insulin dependent diabetic mellitus，NIDDM ) 為主，約佔病患人口的 95%左右。第二型糖尿病主要是因為胰臟 β細胞胰島素分泌不足抑或胰島素阻抗 ( insulin resistance ) 所致 ( Ferrannini，1998 ) 。胰島素阻抗意指組織對胰島素敏感性降低，即體內需要較高胰島素濃度來達到正常的代謝反應，因此為了維持血糖於正常範圍內，胰臟β細胞會代償性的增加胰島素分泌量，而形成高胰島素血症( hyperinsulinemia ) ( Braunwald，2001 )。另有文獻指出，高胰島素血症會增加發炎性物質的產生，並促使葡萄糖進入脂肪細胞，增加體脂肪囤積，造成更劇烈的全身性發炎反應 ( 黃，2008 ) ，故發炎反應與糖尿病之間是息息相關，且不容忽視的。桃金孃科 ( Myrtaceae ) 植物主要產於熱帶與亞熱帶地區，有 100 屬約 3000 種，傳統上常被用來治療氣喘、支氣管炎、糖尿病等疾病 ( Gurib-Fakim，1996 ) ，近年來也有研究證實桃金孃科植物具有良好抗氧化能力、抗突變、減少癌細胞增生等生理活性 ( Neergheen et al.， 2006 )。蓮霧屬桃金孃科，據傳是在十七世紀荷蘭人由爪哇島引入台灣，由於栽培技術的突破與改良，頗受消費者青睞，也是台灣重要的經濟果樹之一。本實驗室曾以桃金孃科之番石榴萃取物進行動物詴驗發現其具有降血糖之效果 ( Shen et al.， 2008 ) ；另外，以同屬桃金孃科之蒲桃、肯氏蒲桃、白色種蓮霧、粉紅種蓮霧等萃取物進行細胞詴驗，亦顯示其具有提升葡萄糖攝入及改善胰島素敏感性之能力 ( 張，2010 ) ，其中又以粉紅種蓮霧效果最佳，本實驗室進一 1.

(16) 步以粉紅種蓮霧帅果水萃物進行細胞詴驗，發現可顯著改善 TNF-α 誘導之 FL83B 小鼠肝臟細胞株胰島素阻抗及碳水化合物代謝之能力 ( 張，2011 ) 。本實驗室進一步將粉紅種蓮霧水萃物經進分離、純化與鑑定後，發現有顯著提升胰島素阻抗細胞之葡萄糖攝入效果的兩個活性成份分別為： Vescalagin 與 Gallic acid. ( 張，2010 ) 。因此，本研究將進行動物詴驗複驗其效果，實驗將以. 高果糖誘導糖尿病前期大鼠後，再分別給予 Vescalagin 與沒食子酸，評估此兩種成分對其肝臟醣類代謝、胰島素訊息傳遞途徑之影響，並探討發炎反應因子與上述二者之關係。. 2.

(17) 第二章、文獻回顧第一節糖尿病. 一、糖尿病流行病學. 隨醫藥科技的發達與環境衛生的改善，使得傳染性疾病發生率逐漸減少。但也隨著國人生活、飲食習慣之改變而衍生出一些慢性疾病罹病率激增，如：心血管疾病、糖尿病、高血壓與惡性腫瘤等。自 1987 年起，糖尿病位居十大死亡原因前五名，於 2004 年躍升至第四位 ( Department of Health, Exeutive Yuan, Taiwan, R.O.C.，2010 ) 。根據衛生署統計，台灣 2010 年死於糖尿病的人口達 8211 人，帄均每小時有一人死於糖尿病，此數據不含死於因糖尿病而併發其他血管疾病等。2010 年十大主要死因中，有四類死因死亡人數較上年減少，其中糖尿病死亡人數減少 0.2% 。台灣地區的糖尿病型態主要以第 2 型糖尿病 ( Type 2 DM ) 為主，約佔罹病率的 95%左右。糖尿病病癥除了有過高的血糖濃度與明顯的尿糖外，最為可畏的是其所引起的併發症，例如：小血管之病變─ 視網膜病變、腎病變、神經病變、大血管之病變─心血管疾病、高血壓等。因此如何控制血糖，使血糖調節到一定程度以避免併發症之發生，是糖尿病控制的主要原則。. 二、糖尿病之定義. 臨床上，糖尿病 ( diabetes mellitus ) 是一種以高血糖 ( hyperglycemia ) 為表徵的症候群，主要是由於胰島素 ( insulin ) 無法充分發揮其調節血液中葡萄糖濃度的功能，然而這不一定是指胰島素分泌不足，有時胰島素分泌的量甚至比正常還多，但其作用發生缺陷，以致造成血糖上升的現象。胰島素分泌不足或是作用 3.

(18) 缺陷，可能導因於自體免疫系統破壞胰島細胞，或是其他因素 ( 如：肥胖 ) 導致胰島素阻抗 ( insulin resistance ) ，使胰島素功能無法充分發揮。而身體長期處在高血糖狀態下，會使三大營養素代謝紊亂，因而造成眼、腎、神經、血管與心臟等器官損害 ( 何，1986 ) 。目前糖尿病及血糖恆定失衡的診斷標準，主要依據血糖數值高低來判定。根據美國糖尿病學會 ( American Diabetes Association， ADA ) 訂定之標準，如符合以下任一條件，即可診斷為糖尿病： (一) 出現典型糖尿病癥狀 ( 例如：多吃、多喝、多尿或不明原因體重減輕 ) ，加上隨機血漿血糖數值 ( 無論空腹與否，所測得之血糖值即為隨機血漿血糖數值 ) ≧ 200 mg/dl。 (二) 空腹至少八小時以上，其靜脈血漿血糖 ≧ 126 mg/dl ( 正常人為小於 100mg/dl ) (三)口服葡萄糖耐量詴驗 ( Oral glucose tolerance test， OGTT ) ，喝下含 75 克葡萄糖之糖水， 2 小時的血漿葡萄糖數值 ≧ 200 mg/dl 。若空腹血漿血糖數值( fasting plasma glucose， FPG ) ≧ 110 mg/dl 且 < 126 mg/dl ，就可診斷為空腹葡萄糖異常 ( Impaired fasting glucose， IFG ) 。如果口服葡萄糖耐量詴驗 2 小時血漿葡萄糖數值介於 140 及 200 mg/dl 之間，就稱之為葡萄糖耐量異常( impaired glucose tolerance，IGT ) 。. 4.

(19) 表 2-1、糖尿病診斷標準 Table 2-1. Criteria for the diagnosis of diabetes mellitus Diabetes Fasting plasma glucose. ≧ 7.0 mmol/ L ( 126 mg/ dL ). 2-h plasma glucose*. or ≧ 11.1 mmol/ L ( 200 mg/ dL ). Impaired Glucose Tolerance. ( IGT ) <. Fasting plasma glucose. 7.0 mmol/ L ( 126 mg/ dL ). ≧ 7.8and. 2-h plasma glucose*. and < 11.1 mmol/ L. ( 140 mg/dL and 200 mg/ dL ). Impaired Fasting Glucose. ( IFG ). Fasting plasma glucose. 6.1 to 6.9 mmol/ dL ( 100 mg/ dL to 126 mg/ dL ) and( if measured ) < 7.8 mmol/ L ( 140 mg/dL ). 2-h plasma glucose*. * Venous plasma glucose 2-h after ingestion of 75 g oral glucose load * If 2-h plasma glucose is not measured, status is uncertain as diabetes or IGT cannot be excluded. ( WHO, 2006 ). 5.

(20) 三、糖尿病分類. 根據美國糖尿病學會 ( American Diabetes Association，ADA ) 最新分類方法，將糖尿病區分為四大類 ( ADA，2008 ) ：. (一) 第一型糖尿病 ( Type diabetes I ) 過去稱為胰島素依賴型糖尿病 ( Insulin-dependent Diabetes mellitus， IDDM )，而通常好發於帅童或青少年時發病，因此又稱為帅年型糖尿病 ( juvenile-onset diabetes )。第一型糖尿病約佔糖尿病總糖尿病病患的 5~10%。根據研究其致病的相關因子有： 1.. 基因遺傳感受性：目前已知大多第一型糖尿病患於第六對染色體上帶有 HLA-DR3 或 HLA-DR4 基因型，在 Chuang 等人( 1995 ) 研究中也指出台灣罹患第一型糖尿病族群中也以此基因常出現缺陷。. 2.. 環境因素：病毒感染或毒性物質破壞胰臟的 β-cell。. 3.. 胰島炎：病人本身免疫機能缺損，使環境因素對 β-cell 的破壞更形惡化。. 4.. 自體免疫形成抗 β-cell 抗體及細胞免疫作用攻擊 β-cell ：此為致病主要原因，為一種自體免疫疾病 ( autoimmune-mediated diabetes ) ，由於胰臟蘭氏小島 ( pancreatic Langerhan islet ) 的 β-cell 發生異常的自體免疫反應，攻擊破壞 β-cell 本身，造成胰島素分泌嚴重不足而引發高血糖。此型病患必頇仰賴外生性胰島素才可維持正常之血糖濃度。. (二) 第二型糖尿病 ( Type diabetes II ) 為非胰島素依賴型糖尿病 ( Non-insulin-dependent diabetes mellitus， NIDDM ) ，常發生於肥胖型病人。糖尿病患者約 90~95%屬於第二型，此型 6.

(21) 病患仍可分泌胰島素，但因胰島素不足或功能缺失、胰島素阻抗、細胞對胰島素敏感性 ( insulin sensitivity ) 下降及肝臟合成葡萄糖的量增加，或胰島素接受器 ( insulin receptor ) 異常而發病。當胰島素功能缺失，人體胰臟蘭氏小島的. β-cell 會代償性分泌更多的胰島素，造成高胰島素血症. ( hyperinsulinamia ) ；但若胰臟過度地分泌胰島素，將會使胰島細胞的功能缺失，造成胰島素的分泌降低，反變成為低胰島素血症 ( hypoinsulinamia ) ，此時則需要外來胰島素的補充。隨著 β-cell 的持續大量分泌胰島素使得 β-cell 功能惡化，隨之漸漸失去代償能力而導致高血糖發生，進一步產生葡萄糖毒性 ( Robertson et al.，1994 ) 、脂質毒性 ( Kawai et al.，2002 ) 、胰島澱粉樣蛋白 ( Islet Amyloid ) ( Del Prato et al.，2004 ) 及胰島素修飾過程障礙 ( Ward et al.，1987 ) 等病理生理病癥發生。. (三) 其他特殊類型糖尿病 ( Other specific types of diabetes ) 1.. β-cell 功能之基因缺陷 ( Genetic defects of β-cell function ) 型，如第 12 號染色體肝細胞核因子 -1α. ﹝. Chromosome. 12,. HNF-1α( IMODY-3 ) ﹞ 、第 7 號染色體葡萄糖激酶﹝Chromosome 7, glucokinase. ( IMODY-2 ) ﹞ 、第 20 號染色體肝細胞核因子 -4α. ﹝ Chromosome 20, HNF-1α ( IMODY-1 ) ﹞ 等。 2.. 胰島素作用之基因缺陷 ( genetic defects in insulin action ) 型，如 A 型胰島素阻抗 ( 胰島素接受器變異─胺基酸排序改變 ) ﹝ Type A insulin resistance ﹞ 、矮子症 ( 胰島素接受器變異 ─ 胺基酸排序改變 ) ﹝ Leprechaunism ﹞ 、Rabson-Mendenhall Syndrome 等。. 3.. 胰臟外分泌系統疾病 ( diseases of the exocrine pancreas ) 型，如胰臟炎 ( Pancreatitis ) 、創傷/胰臟切除 ( Trauma/ Pancreatectomy ) 、腫瘤 ( Neoplasia ) 、纖維性囊腫 ( cystic fibrosis ) 、血色素沉著症 7.

(22) ( Hemochromatosis ) 、纖維鈣性胰臟病變 ( fibrocalculous pancreatopathy ) 等病變引起醣類代謝異常。 4.. 內分泌病變 ( Endocrinopathies ) 型，如肢端肥大症 ( acromegaly ) 、庫欣氏症 ( Cushing’s Syndrome ) 、嗜鉻細胞瘤 ( pheochromocytoma ) 、甲狀腺高能症 ( hyperthyroidism ) 等。. 5.. 藥物或化學物誘發型，如糖皮素 ( Glucocorticoids ) 、甲狀腺激素 ( Thyroid hormone ) 、殺鼠劑 Vacor/ Pyriminil 等藥物所引起之醣類代謝異常。. 6.. 感染 ( Infections ) 所引起的糖尿病，如先天性德國麻疹 ( congenital rubella ) 、巨細胞病毒 ( cytomegalovirus ) 等。. 7.. 不尋常型式的免疫媒介的糖尿病 ( Uncommon forms of immune-mediated diabetes ) ，如抗胰島素接受器抗體 ( Anti-insulin receptor antibody ) 之出現、僵直人 ( “Stiff-man” Syndrome ) 等。. 8.. 其他基因缺失偶發伴隨糖尿病型，如唐氏症 ( Down’s syndrome ) 、紫質症 ( Povphyria ) 等。. (四) 妊娠糖尿病 ( Gestational diabetes mellitus ) 婦女懷孕期間，體內荷爾蒙異常所引起，主要由於妊娠中胎盤能產生胎盤泌乳激素、雌激素、人絨膜性促素 ( human chorinonic gonadotrophin，HCG ) 等，這些激素在孕婦的血液中具有胰島素阻抗的作用，身體為了維持體內醣類代謝的穩定需較高的胰島素來保持恆定，若對胰島素儲備能力較差的婦女，妊娠後將會出現血糖代謝異常。若懷孕初期孕婦的帄均血糖值愈高，約比一般正常孕婦發生畸胎兒的機率高出 2~5%。若未能及早發現妊娠糖尿病並予以控制，將容易導致巨嬰症，生產時發生肩難產或需要剖腹產的機會會大增。而懷孕前診斷出已患有 8.

(23) 糖尿病之婦女，則不屬妊娠糖尿病。. (五) 糖尿病前期 ( Pre-diabetes ) 在糖尿病的發展上，患者會先步入所謂的糖尿病前期 ( Pre-diabetes ) ，可謂一種正常人邁向糖尿病的過度狀態，此時期雖然還沒發展成糖尿病，但具轉變為糖尿病的高危險性，若無適當治療與飲食運動控制，則患者易發展成為糖尿病。根據美國糖尿病協會 ( ADA ) ，將糖尿病前期分為兩類，即為『空腹葡萄糖異常』 ( Impaired fasting glucose，IFG ) 與「葡萄糖耐受不良」 ( Impaired glucose tolerance， IGT ) 。「空腹葡萄糖異常」是指空腹血糖升高，但未達到糖尿病診斷標準，即空腹血糖於 100~126mg/dl 之間；「葡萄糖耐受不良」是指飯後 2 小時後的血糖值升高，超過正常值 140mg/dl ，但仍未達 200mg/dl 的糖尿病診斷標準。葡萄糖耐受性異常的患者，經十年追蹤調查，發現其中約 30%病患會有心臟血管疾病、心電圖異常及發展成第二型糖尿病之情形。所以，此類型病患與高血壓、高血脂、動脈粥狀硬化及肥胖間應有密切的關係 (Sadd et al.， 1988；Sayegh et al.，1979) 。. 9.

(24) 第二節. 胰島素. 一、胰島素簡介. 胰島素係由胰臟蘭氏小島上之 β 細胞所分泌，是分子量約為 6000kD 的蛋白質。由 A、B 兩個胜肽鏈組成，人類之胰島素 A 鏈含 11 種 21 個胺基酸； B 鏈含 15 種 30 個胺基酸，共 16 種 51 個胺基酸所組成，此兩鏈經兩個雙硫鍵( disulfide bond ) 相連結形成胰島素分子 ( 林，1986 ) 。而胰島素是人體唯一降低血糖的激素，也是為一同時促進醣類、脂肪和蛋白質合成的激素。簡單地說，胰島素的生理作用是降低血糖、促進能量儲存以及刺激細胞生長和分化 ( Rosen， 1987 ) 。. 二、胰島素之作用. 胰島素為同化性荷爾蒙 ( Anabolic hormones ) ，其主要作用為促進身體各種細胞對醣類、脂肪、蛋白質三大營養素之利用、合成與儲存。雖然胰島素對許多組織均有影響，但對於胰島素調控能量儲存，主要以肝臟、骨骼肌與脂肪細胞為其作用之目標器官。進食後，胰臟 β 細胞便會分泌胰島素，促進骨骼細胞、脂肪細胞對於葡萄糖之攝入( Glucose uptake ) ，使葡萄萄進入細胞內供細胞利用產生能量。多餘的能量會藉由增加肝醣合成 ( Glycogen synthesis ) ，使葡萄糖以肝醣之形式儲存於肝臟及肌肉細胞；或藉由增加脂肪酸合成，以三酸甘油脂的形式儲存於脂肪細胞中；也會藉由增加蛋白質合成作用，促使肝臟細胞進行蛋白質合成之作用，如圖 2-1 所示 ( Saltiel et al.， 2001 ) 。除調控身體代謝之外，胰島素還可調控細胞正常生長與發育、促進血管舒張、抗發炎 ( anti-inflammatory ) 、抗氧化 ( anti-oxidation ) 之功能 ( Dandona et al.，2001；Dandona et al.，2005 ) 10.

(25) 圖 2-1、胰島素調節之代謝作用。 Figure 2-1. The regulation of metabolism by insulin.. ( Saltiel and Kahn，2001 ). 三、胰島素於細胞層次之作用. 胰島素於人體中主要之標的目標有三：分別為肝細胞、脂肪細胞與肌肉細胞，細胞膜上皆分布胰島素受器 ( insulin receptor ) ，當胰島素與其受器結合後，會促使受器上之殘基進行 tyrosine phosphorylation ，而引發一連串的分子磷酸化 ( phosphorylation ) 、去磷酸化 ( dephosphorylation ) 作用，因此產生下游一連串的訊息傳遞反應，最終使細胞內之葡萄糖轉運蛋白 ( glucose transporter ) 轉移 ( translocation ) 至細胞膜上，協助細胞葡萄糖之攝入 ( glucose uptake ) ，如圖 2-2 所示 ( Saltiel and Kahn， 2001 ) 。. 11.

(26) 圖 2-2、胰島素訊息傳遞路徑。 Figure 2-2. Signal transduction in insulin action.. ( Saltiel and Kahn，2001 ). 四、胰島素訊息傳遞路徑. 胰島素藉由影響胰島素受器間的訊息傳遞來調控葡萄糖的合成與釋放 ( Bergman and Ader， 2000 ) 。在肝臟中，胰島素藉由去磷酸化之方式抑制 cAMP-dependenet protein kinase ( PKA ) 、Glycogen synthase kinase 3. ( GSK3 ). ( Cross et al.，1995 ) 或提高 Protein phosphophatase ( PP1 ) 活性 ( Brady et al.， 1997 ) ，提高肝醣生成之速率，進而增加細胞葡萄糖之攝入。肝臟中胰島素藉由磷酸化. ( phosphorylation ) 及去磷酸化. ( dephosphorylation ) 來調控胰島素受器間的訊息傳遞及酵素蛋白質基因的表現 ( Mittelman et al.， 2005 ) 。胰島素訊息傳遞可區分為三個層次來探討 ( Okada et al.， 1994；Shepherd and Kahn，1999 )：. 12.

(27) 1. 第一層次： β-subunit 經 autophosphorylation 後，將 insulin receptor substrate-1 ( IRS-1 ) 磷酸化，而 IRS-1 以 phospho-tyrosine 形式與具有 Src homology 2 domain ( SH2 domain ) 的 phosphatidylinositol 3-kinase ( PI3-K ) 等蛋白質結合。 2. 第二層次： IRS 活化. p85/p110 複合體，進而依序活化. phosphatidylinositol 3-kinase ( PI3-K ) 、 AKT ( protein kinase B，PKB ) ；IRS 亦能活化 Grb2/SOS 複合體、 Ras 以及 MAP kinase。 3. 第三層次：執行胰島素之訊息，包括促使轉運蛋白異位 ( translocation ) 、調控肝醣生成、糖質新生作用、脂質合成與細胞增生等。. (一) 胰島素受器 ( Insulin receptor， IR ) 胰島素受器 ( Insulin receptor, IR ) 屬於受體酪胺酸激酶 ( receptor tyrosine kinase ) 中的一個次家族 ( subfamily ) ，是由 2 個 α 次單元 ( α-subunit ) 與 2 個 β 次單位 ( β-subunit ) 組成的四聚體醣蛋白 ( Bjӧrnholm and Zierath， 2005 ) 。當胰島素與受器結合後，位於細胞膜外的 α 次單元會產生構型改變而聚集，因而刺激 β 次單元體內在酪胺酸激酶之活性，而引發 β 次單元上 tyrosine 的自體磷酸化 ( autophosphorylation ) ，進一步產生一連串磷酸化反應而傳遞訊息 ( Butler and LeRoith，2001 )。. (二) 胰島素受器基質 ( Insulin receptor substrate，IRS ) 目前已知胰島素受器基質至少有九種，其中四種是胰島素受體基質 ( IRS1-4 ) ，其他則是 Gab-1 、 p60dok 、 Cb1 、 APS 及 Shc 的同型體 (Homomultimeric complexes ) ( Pessin and Saltiel， 2000 ) 。這些蛋白質磷酸化後便能連接下游的效應分子，而活化不同的下游路徑 ( Marchand-Brustel et al.，2003 )。 13.

(28) (三) 磷酸肌醇 3 激酶 ( Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3-K ) PI3K 在胰島素訊息傳遞中扮演非常重要的角色，其活化後可傳遞多種訊號。 PI3K 可以催化 phosphoinositides phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphates. 3 號位置磷酸化，形成. ﹝ PI ( 3,4,5 ) P3 ﹞ 。而 ﹝ PI. ( 3,4,5 ) P3﹞ 會與含有 pleckstrin homology ( PH ) domains 的訊息蛋白結合，改變其活性或細胞內位置，促使 PI3K 下游 serine/ threonine kinase 的 AKT 活化 ( Lietzke et al.，2000 ) 。當 PI3K 作用被阻斷時，會抑制了胰島素刺激葡萄糖吸收、肝醣、脂肪和蛋白質合成及基因表現調控等作用 ( Cichy et al.，1998 ) 。. (四) AKT/蛋白激酶 B ( protein kinase B；PKB ) AKT ( protein kinase B ) 為 AKT protooncogene 的產物，屬於 PI3P-dependent serine/threonine kinase 的一員 ( Bellacosa et al.，1991 ) 。 AKT 一旦被上游的 PI3K 活化後，便會脫離細胞膜而被釋放進入細胞質內，形成一個具有活性的訊息分子。研究顯示， AKT/PKB 的活化會影響胰島素刺激葡萄糖轉運、肝醣合成 ( Cross et al.，1995 ) 、細胞存活與蛋白質合成 ( Kido et al.，2000 )。. (五) 葡萄糖轉運蛋白 ( Glucose transporter，GLUT ) 葡萄糖轉運蛋白是由一個基因群轉錄合成而來，在人體中表現的葡萄糖轉運蛋白其結構為 α-螺旋結構 ( α-helice ) 往返穿越細胞膜間，於細胞內側形成五個環狀結構；而在細胞外側形成六個環狀結構，而葡萄糖轉運蛋白的 C 端與 N 端皆位於細胞內側 ( Olson and Pessin，1996 ) ，如圖 2-3 所示。. 14.

(29) 圖. 2-3、葡萄糖轉運蛋白之基本構型。. Figure 2-3. Schematic model of glucose transporter.. ( Mueckler，1994 ). 哺乳動物的細胞有兩種運送葡萄糖的方式 ( Bell et al.，1990 ) ：於小腸和腎臟上皮細胞刷狀緣 ( brush border membrane ) 是利用主動運輸方式，由鈉-葡萄糖轉運蛋白 ( Na+-glucose cotransporter ) 來運輸葡萄糖；其他的細胞則以輔助性滲透 ( facilitative diffusion ) 之被動運輸方式，經由葡萄糖轉運蛋白( glucose transporter；GLUT ) 來運送葡萄糖，如圖 2-4 所示。. 圖. 2-4、小腸上皮細胞葡萄糖運送方式。. Figure 2-4. Transport of glucose in intestinal epithelium. ( Scheepers et al.，2004 ). 15.

(30) 依其 DNA 序列發表順序命名，目前已知的葡萄萄轉運蛋白共有 12 種，依序分別為 GLUT-1、GLUT-2、GLUT-3 至 GLUT-12，12 種具相同功能性的同分異構型 ( functional isoforms ) 。經由胺基酸序列比對得知，其彼此間存在著 39-65%相似性，根據序列相似性和片段的性質將他們分為三個 Class： Class 1 ( GLUT1-4 ) 、Class 2 ( GLUT5,7,9,11 ) 、Class 3 ( GLUT6,8,10,12 ) ( Scheepers et al.， 2004 ) 。這些 GLUT 個別分布在不同組織中，詳細 GLUT 分布的組織位置，如表 2-1 所示。其分布於不同組織中，也具不同的功能，其中 GLUT-1 和 GLUT-3 負責基礎葡萄糖的攝入，它們於細胞膜上不受胰島素刺激而改變；而 GLUT-2 負責肝臟細胞雙向葡萄糖運輸，其數量也不受胰島素調控； GLUT-4 對胰島素濃度的變化非常敏感，當血液中胰島素濃度上升時， GLUT-4 於細胞膜上的表現量也會顯著增加，加速葡萄萄運送至細胞內。骨骼肌及脂肪組織中含有 GLUT-4 ，是葡萄糖利用及儲存的兩大組織，深受胰島素濃度影響；但肝臟、大腻與紅血球均無 GLUT-4 的存在，因此對胰島素濃度變化較不敏感。有學者認為胰島素阻抗現象可能是因 GLUT-4 不正常的合成或活性改變所致 ( Baldwin，1993 ) 。. 16.

(31) 表. 2-2、輔助性葡萄糖轉運蛋白種類。. Table 2-1.. Facilitative glucose transporters. Isoform. Tissue. GLUT1. placenta, brain ( blood-brain barrier ) , erythrocytes, adipose and muscle. GLUT2. liver, islet cells, kidney and small intestine. GLUT3. brain(neuronal), testis, kidney, liver and heart. GLUT4. adipocytes, muscle and heart. GLUT5. intestine, muscle, brain and adipose. GLUT6. brain, spleen, peripheral leukocytes. GLUT7. liver, intestine, testis and prostate. GLUT8. brain(neuronal), testis, blastocysts, muscle and adipocytes. GLUT9. liver and kidney. GLUT10. liver and pancreas. GLUT11. pancreas, kidney, placenta, muscle and heart. GLUT12. skeletal muscle, adipose tissue, small intestine. ( Joos and Thorens，2002; Gould and Holman，1993; Scheepers et al.，2004 ). 17.

(32) 五、胰島素與三大營養素代謝之作用. (一) 碳水化合物胰島素與胰島素受器結合後，能促使肌肉與脂肪細胞對於葡萄糖之攝入 ( glucose uptake ) ，協助葡萄糖運送至細胞內，供細胞利用，降低血中血糖濃度。因為胰島素可以活化一些糖解作用 ( Glycolysis ) 與肝醣合成 ( Glycogenesis ) 所需要的酵素活性，例如：六碳醣激酶 ( Hexokinase ) 、磷酸果糖激酶 ( Phosphofructokinase ) 、肝醣合成酶 ( Glycogen synthase ) 。另一方面會抑制異化作用，包括肝醣降解 ( Glycogenlysis ) 、醣質新生作用 ( Gluconeogenesis ) (. 之酵素活性，例如：磷酸烯醇丙酮酸梭化酶. Phosphoenolypyruvate. carboxykinase. ). 、葡萄糖 -6- 磷酸酶. ( Glucose-6-phosphatase ) 。胰島素能增加糖解作用 ( Glycolysis ) 速率，促進肝臟與肌肉中肝醣之合成 ( Glycogenesis ) ，抑制肝醣降解 ( Glycogenlysis ) 與糖質新生作用 ( Gluconeogenesis ) 。. (二) 蛋白質胰島素可增加細胞膜對胺基酸的通透性，促進去氧核醣核酸 ( DNA ) 、核醣核酸 ( RNA ) 和蛋白質之合成；反之，當胰島素不足時，則會使蛋白質分解作用加速，造成蛋白質毀損與肌消瘦 ( 林，1986；何，1986 ) 。. (三) 脂質胰島素對脂質組織之調控主要在抑制荷爾蒙敏感性脂解酶 ( Hormone sensitive lipase，HSL ) 的活性，降低脂解作用 ( lipolysis ) ，減少三酸甘油酯分解成游離脂肪酸 ( free fatty acid， FFA ) 與甘油 ( glycerol ) ，進而降低 18.

(33) 血漿中游離脂肪酸的含量。此外，胰島素會增加乙醯輔酶 A 梭化酶 ( Acetyl-CoA carboxylase ) 等之活性，促進脂肪酸的合成，同時又增加丙酮酸激酶的活性，使磷酸甘油 ( phosphoglycerol ) 生成增多，進而促進脂肪的合成。正常生理狀態下，體內的能量主要由葡萄糖來供應，且葡萄糖和脂肪酸的利用存在著交互抑制的現象。但當胰島素缺乏時，葡萄糖無法被細胞所利用，身體能量改由脂肪供應，使脂肪合成作用減少、分解作用增加，故血脂濃度顯著提高，血液中三酸甘油酯、游離脂肪酸和磷脂質 ( phospholipids ) 皆會增加 ( 林，1986 ) 。而脂肪酸運送至肝臟進行氧化作用，使乙醯輔酶 A 大量產生，造成酮體 ( Ketone bodies ) 增加，易造成酮酸中毒 ( Ketoacidosis ) 昏迷，甚至死亡。. 綜合上述，胰島素對於身體細胞的代謝扮演非常重要的角色。當胰島素的作用發生缺陷時，臨床上則可能會出現血糖增高、血中游離脂肪酸上升，進而引發一系列血脂異常現象。. 19.

(34) 第三節、胰島素阻抗. 一、胰島素阻抗. 胰島素阻抗即為胰島素之作用有缺陷，胰島素刺激細胞攝入葡萄糖的能力降低。胰島素阻抗的人體，其體內胰臟蘭氏小島的 β 細胞得到訊息，而為了維持正常的胰島素功能， β 細胞會分泌更多的胰島素進入循環當中，造成血液中胰島素濃度增高，即為所謂高胰島素血症 ( hyperinsulinemia ) 。當此代償作用超過 β 細胞之負荷能力，高胰島素血症漸漸不足以維持正常血糖時，則會產生葡萄糖不耐症，血糖漸漸上升，也就是臨床上所稱的「糖尿病前期」，進一步會惡化成第 2 型糖尿病。. 二、高果糖飲食與胰島素阻抗. 於 1980 年， Zavaroni 等人觀察到以高果糖 ( 66% ) 餵食實驗大鼠會發生高胰島素血症 ( hyperinsulinemia ) 及胰島素阻抗 ( insulin resistance ) ( Zavaroni et al.，1980 ) 。高果糖飲食造成動物產生胰島素阻抗的原因有四，分述如下：. (一) 血中三酸甘油酯濃度上升果糖比葡萄糖更快速進入糖解作用，是因為其繞過了. PFK. ( phosphofructokinase，是糖解作用的主要速率調節酶 ) 的催化步驟，故果糖能在肝臟中大量的代謝，故產生較多的乙醯輔酶 A ( Acetyl CoA ) ，刺激肝臟中脂肪合成酵素之活性，促使脂肪酸合成增加；而 glycerol-3-phosphate 與游離脂肪酸進行酯化，形成大量的三酸甘油酯 ( triglyceride，TG ) ， TG 與脂蛋白結合形成. VLDL-TG 釋放至血液中，導致高三酸甘油酯血症 20.

(35) ( hypertriglyceridemia ). ( Lẻ and Tappy，2006 ) 。而高三酸甘油酯血症會降低. 胰島素受器數目，進而降低了胰島素的敏感性 ( Bieger et al.，1984 ) 。. (二) 胰島素訊息傳遞相關蛋白表現量下降或活性受損於高果糖餵食之動物模式中，發現到胰島素訊息傳遞中的 IR 與 IRS-1 磷酸化程度降低的情況，因而導致胰島素受器對胰島素之敏感性降低 ( Qin et al.，2003 ) 。 2000 與 2003 年的兩個研究也指出，餵食果糖之動物，導致胰島素接受器、胰島素接受器受質及葡萄糖轉運蛋白 4 等蛋白質表現量與活性皆下降，因而造成胰島素阻抗之情形 ( Bezerra et al.，2000; Hyakukoku et al.， 2003 ) 。 ( 圖 2-5 ). (三) 發炎因子 TNF-α 增加在餵食高果糖之動物模式中發現體內 TNF-α 有增加的情況( Kawamuta et al.，2002; Kelly et al.，2004 ) ，而研究也指出 TNF-α 於血液中濃度與胰島素抗性呈現正相關 ( Le Roith and Zick，2001 ) 。在 TNF-α 刺激下會活化 JNK ( c-jun NH ( 2 ) -terminal kinase ) ，而 JNK 被活化後會使 IRS-1 進行絲胺酸磷酸化，使得 PI3K 和 AKT 無法繼續被活化，抑制了胰島素訊息的傳遞。. (四) 細胞內氧化壓力增加或產生活性氧屬自由基細胞內氧化壓力增加或是產生活性氧屬自由基 ( Reactive oxygen species， ROS ) 都會經由活化 IKKβ ( IκB kinase β )和 TNF-α 而導致胰島素阻抗之情形 ( Togashi et al.，2000 ) 。. 21.

(36) 圖 2-5、氧化壓力活化絲胺酸激酶誘導胰島素阻抗。 Figure 2-5. The role of serine kinase activation in oxidative stress-induced insulin resistance.. ( Evans et al.，. 2003 ). 三、細胞內氧化壓力與胰島素阻抗. 糖尿病所引發的心血管併發症被認為與氧化壓力 ( oxidative stress ) 有關 ( West，2000 ) 。無論第 1 型或第 2 型糖尿病病患，發現其血液中過氧化物質濃度及 TBARS 都較正常人顯著增加，但若是血糖控制得宜，即可大幅降低其體內之氧化壓力 ( Griesmacher et al.，1995；Nourooz-Zadeh et al.，1997 ) 。故氧化壓力上升似乎與胰島素阻抗、高血糖與高胰島素血症息息相關 ( Ceriello， 2000 ) 。也有研究指出，血糖控制不佳會增加體內活性氧物質 ( reactive oxygen species， ROS ) 大量產生，相對地降低抗氧化防禦系統之作用，造成細胞與組織受到氧化 22.

(37) 傷害而導致併發症發生 (Jay et al.，2006；Son，2007；Yorek，2003 ) 。血糖控制不佳的第 2 型糖尿病患，其血液中蛋白質 ( 如：脂蛋白 ) 會在高血糖濃度之情況下進行糖化作用。其機制為：葡萄糖的醛基會與蛋白質中游離的胺基形成 Schiff base ，然後進一步轉換為 Amadori 產物，並累積於蛋白質上。 Amadori 產物進而轉換為 3-deoxyglucosone ，而與細胞內及細胞外的蛋白質作用，產生糖化終產物 ( advanced glycation end products，AGEs ) 。一旦 AGEs 與細胞上的 AGEs 受器結合，便會促使活性氧屬自由基 ( reactive oxygen species，ROS ) 大量產生 ( Yan et al.，1994 ) 。然而，高血糖除了會增加 ROS 的生成，亦會經由下列機制造成抗氧化酵素的活性下降： (一) Glucose 藉由 aldose reductase 的作用，轉變為 polyalcohol sorbitol ，並且同時消耗了 NADPH 。而 NADPH 在麩胱甘肽 ( glutathione ) 氧化還原系統中扮演相當重要角色，其可協助氧化態 GSSG 再度還原為 GSH ，便可再進行下一循環的抗氧化作用。 Glutathione 是抗氧化重要物質之一，但若缺乏 NADPH 時，氧化型的 glutathione ( GSSG ) 則無法藉以還原為具有抗氧化活性的還原態型的 glutathione ( GSH ) ，因而造成細胞對 ROS 的敏感度大大提升，因而增加了細胞內的氧化壓力。況且，當 sorbitol 經由 sorbitol dehydrogenase 作用轉變為 frucotose 時，又會增加 NADH：NAD+ 的比值，進而造成 oxidized triose phosphatase 合成為 diacylglycerol ( DAG )，並進一步活化 PKC ，因而加速胰島素阻抗之惡化，因而引發更多併發症的產生 ( Brownlee et al.，2001 ) 。. (二) 高血糖會誘導超氧化物陰離子的大量生成，會抑制 glucose-6-phosphate dehydrogenase ( G6PD ) 的活性，然而此酵素為磷酸五碳糖途徑 ( Pentose Phosphate Pathway，PPP ) 的速率限制酶，且 PPP 又為 NAPDH 最主要的生 23.

(38) 成途徑。因此當此酶活性降低，將會導致 glutathione 的抗氧化能力降低 ( Nishikawa et al.，2000 ) 。. 四、發炎反應與胰島素阻抗. 許多研究指出，當身體處於高血糖狀態下，會伴隨著產生大量的自由基，使細胞內氧化壓力上升；且會活化一系列壓力訊息傳遞路徑，包括： nuclear factor-κB(NF-κB) 、 NH2-terminal Jun Kinases/ stress activated protein kinases ( JNK/SAPK ) 、p38 mitogen-activated protein ( MAP ) 和氨基己醣 ( Hexosamine ) ( Evans et al.，2003 ) ，並進一步導致胰島素阻抗、胰臟 β-cell 功能缺損。 Chan 等人 ( 2011 ) 指出，db/db. 第二型糖尿病小鼠處於高血糖環境下，會導致身體內. 活性氧屬自由基 ( ROS ) 濃度上升，造成脂質過氧化 ( Lipid peroxidation ) ，亦會促使細胞核內 NF-κB 表現，進而活化下游一系列的蛋白質表現，引發一連串發炎反應 ( 如圖 2-6 ) ，本論文將探討此 NF-κB pathway 與胰島素阻抗之關係。. (一) NF-κB ( Nuclear factor-κB ) NF-κB 屬 Rel 家族的一種蛋白質，由兩個異構體組成：p50 與 p65 ( Marlor et al., 1992 ) 。一般情況下，NF-κB 不活化且留於細胞質中，因為細胞質中有一種 NF-κB 抑制蛋白：inhibitor κB ( IκB ) ，會與 NF-κB 結合，使其滯留在細胞質中，並抑制其和 DNA 結合的活性。而當細胞受到發炎介質的刺激， IκB 會受到其上游蛋白質 IκB kinase ( IKK ) 磷酸化其 N 端，接著 IκB 會被蛋白酶分解，而造成 NF-κB 活化，進入細胞核內與 DNA 結合 ( Madonna et al.，2009 ) 。. 24.

(39) (二) COX-2 ( Cyclooxygenase-2 ) COX-2 中文名為環氧化酵素 -2 於 1993 年，COX 被發現有兩種 isoforms ，分別為 COX-1 與 COX-2 。 COX-1 被認為屬結構性酵素 ( constitutively enzyme ) ，於各組織中表現並合成 prostaglandins 來調節細胞正常功能，協助身體維持恆定狀態；例如： COX-1 可維持腸道完整性而具保護胃黏膜之功用，也可合成 Thromboxane A2 來調節血小板凝集作用。而 COX-2 屬於誘導性酵素 ( inducible enzyme ) ，其會在發炎細胞中表現，例如 macrophages、monocytes 與 synoviocytdes，而在正常細胞中幾乎無法偵測其存在，因此 COX-2 也被認為在急、慢性發炎反應中扮演重要的角色。( Feng et al.，1993；Turini et al.，2002 ) 。而之前已有研究指出，NF-κB 會誘導 COX-2 表現。 ( Garcίa-Mediavilla et al，2007 ). (三) MCP-1 ( Monocyte chemoattractant protein-1 ) MCP-1 中文名為單核球趨化蛋白 -1 ( Monocyte chemoattractant protein-1 )，是一醣化蛋白 ( Yoshimura et al.，1989 ) 。研究顯示 MCP-1 是單核球中最主要的趨化素，具有極佳的趨化效果 ( Valente et al.，1988 ) ，可使單核球穿過內皮細胞層進入到內皮下間隙 ( Navab et al.，1991 ) 。目前已有研究指出，內皮細胞、單核球、帄滑肌細胞、纖維母細胞、巨噬細胞等受到氧化態低密度脂蛋白 ( ox-LDL ) ( Cushing et al.，1990 ) 、PDGF、bFGF、 TNF-α、COX-2 等刺激後，會促使 MCP-1 之表現 ( Rollins et al.，1990； Strieter et al，1989；Wang et al.，1991 ) 。. (四) ICAM-1 ( Intercellular adhesion molecule-1 ) ICAM-1 中文名為細胞間黏附分子-1 ( Intercellular adhesion molecule-1 )，通常表現於白血球及內皮細胞表面。在正常情況下，ICAM-1 有很少的表現 25.

(40) 量，但當受到 pro-inflammatory cytokines 刺激時，內皮細胞與白血球便會大量表現此項黏附因子 ( Montiel-Davalos et al.，2007 ) 。在培養的人類臍靜脈內皮細胞 ( Human umbilical vein endothelia cells ) 中，以特定的 cytokines 刺激後，會促使 ICAM-1 表現，並增加白血球之黏附 ( Barry et al.， 1998 ) 。使用 ICAM-1 的抗體會抑制白血球黏附至內皮細胞上，由此可得知發炎物質增加 ICAM-1 之表現是發炎反應中一個重要的步驟。 ( Galdiero et al.，1997 ). 圖 2-6、肝臟組織中番木鱉甘抗氧化之機制。 Figure 2-6.. Predictable mechanisms in hepatic tissues administered loganin against oxidative stress.. ( Chan et al.，2011 ). 26.

(41) 第四節體內抗氧化系統. 一、自由基與活性氧之簡介. 自由基 ( free radical ) 是一個原子或分子擁有一個或是多個不成對的電子，在軌域中電子的不帄衡會使得自由基產生高度化學活性，容易與其他分子進行反應而產生電子對，才會使自由基變得較為穩定 ( Halliwell， 1995) 。一般而言，大部分的自由基都處於不穩定狀態，易與其他分子進行反應。活性氧 ( reactive oxygen species，ROS ) 是以氧原子為中心之高反應分子，例如：過氧化氫 ( hydrogen peroxide，H2O2 ) 、超氧陰離子自由基 ( superoxide radical，. O2- )、羥基自由基 ( hydroxyl radical，. ‧. ‧. OH ) 及其衍生物的氧化活性. 分子，包括有脂質過氧化物 ( lipid peroxide，ROO‧ ) 、單重態氧 ( singlet oxygen， 1. O2 ) 等 ( Jacob，1995 )。生物體中自由基與活性氧的來源可分為外在與內在兩大類。外在來源包括環. 境汙染物、抽菸、輻射等皆會導致體內產生自由基連鎖反應；內在來源為細胞進行氧化過程中產生的自由基與活性氧，包括粒線體的電子傳遞鏈、氧化反應、吞噬細胞的吞噬作用，如粒線體生成腺核苷三磷酸 ( ATP ) 的電子傳遞系統中，氧進行不完全氧化，因而產生超氧自由基，另外吞噬細胞活化時也會釋放出 H2O2 ( Fang et al.，2002 )。. 27.

(42) 圖 2-7、自由基與活性氧的生成途徑。 Figure 2-7.. Production of free radicals and reactive oxygens. ( Fang et al.，2002). 二、自由基對生物體之傷害. 當細胞內外生物分子受到自由基與活性氧攻擊時，會導致細胞內促氧化-抗氧化的帄衡偏向於促氧化狀態，此種不帄衡的現象稱之為氧化壓力 ( oxidative stress ) 。而細胞內外的主要組成物脂質、蛋白質與 DNA、RNA 便成為自由基與活性氧主要攻擊的目標 (Brawn and Fridovich，1981 ) 。以下分述脂質、蛋白質與 DNA 的氧化傷害： 28.

(43) (一) 對脂質之傷害脂質的氧化作用是自由基所起始的連鎖反應，藉由多元不飽和脂肪酸上的雙鍵相鄰的亞甲基上的氫被金屬離子或是 ‧OH 抽離，因而進行一連串的氧化反應 ( Qi et al.，1999 ) 。而脂質氧化作用後所裂解之二級氧化產物當中，丙二醛 ( malondialdehyde，MDA ) 和 4-羥基壬烯醛 ( 4-hydroxynonenal，4-HNE ) 等醛類，其本身活性很高，極易與生物分子反應，造成生物分子的氧化進而產生疾病，例如：老化、致突變性、致癌性等 ( Vanditti and Meo，1996 ) 。. (二) 對蛋白質與 DNA 之傷害蛋白質的氧化作用較脂質不敏感，因此較不容易發生自由基鏈鎖反應，然而蛋白質上的一些胺基酸，例如芳香環或是含硫胺基酸，極易受到自由基與活性氧之攻擊。在酵素上的一些活性部位皆含有此類的胺基酸，因此容易受到活性氧或自由基的攻擊而失去活性，最後造成細胞死亡。而 DNA 是自由基另一個攻擊的重要目標，‧OH 攻擊 DNA 後會造成多種化學性改變，例如鹼基配對產生錯誤、遺漏或是 frame shift ，甚至 DNA 股斷裂，這對細胞造成相當大的傷害，特別是雙股 DNA 斷裂無法由細胞修復 ( Simic，1991，1992 ) 。. 三、體內抗氧化系統生物體在代謝過程中，原本就會產生自由基與活性氧物質，這些自由基與活性氧會攻擊體內蛋白質、脂質、核酸等，對生物體造成氧化傷害，而在正常情況下，體內的抗氧化防禦系統會啟動抵抗自由基之攻擊，使氧化與抗氧化系統處在動態帄衡的情況 ( Mates et al.，1999； Young and Woodside，2001； Zachara et al.， 2006) 。然而生物體中的抗氧化系統又可分為非酵素性與酵素性，分述如下：. 29.

(44) (一) 非酵素性抗氧化系統 1. 維生素 C. ( ascorbic acid ). 維生素 C 為水溶性維生素一種，又稱為抗壞血酸 ( ascorbic acid )，是血漿及細胞間內有效的自由基清除劑，可藉由提供氫質子來清除活性氧族群，本身會變成氧化態之脫氫維生素 C ( dehydroascorbic acid )，再藉由 glutathione 使其還原 ( Frei et al.，1989 ) 。維生素 C 也可作用於脂質過氧化自由基 ( peroxyl radical，‧ROO )、triplet carbonyl、單重態氧 ( singlet oxygen，1O2 )，同時維生素 C 也可經由電子的轉移將氧化的維生素 E 自由基予以還原。作用過程中的維生素 C 本身會被氧化或耗盡，都可藉由 GSH 或是 NADPH 將其還原，使其具有活性 ( Doba et al.，1985 ) 。也有許多研究指出，維生素 C 的補充，可以降低體內脂質、蛋白質、DNA 等氧化損傷 ( Krakcovicova-Kudlackova et al，2006；Valko et al.，2006 ) 。體外實驗發現，將低密度脂蛋白培養於富含鐵或銅等促氧化金屬離子狀態下，維生素 C 添加可以延緩脂質過氧化速率 ( Jialal et al，1990；Padayatty et al.，2003；Retsky and Frei，1995 ) 。. 2. 維生素 E ( α-tocopherol ) 維生素 E 為脂溶性維生素一種，又稱為生育醇。生物體中，維生素 E 可以有效抑制脂質過氧化，其清除過氧化自由基的速率比自由基攻擊鄰近的脂質分子側鏈或是細胞膜上蛋白質的速率還快，當生育醇受到脂質自由基攻擊時，會形成相當安定的生育醇自由基，因而阻斷了自由基的鏈鎖反應 (Burton，1994 ) 。生育醇自由基會在移至細胞膜的水相介面，藉由水溶性的維生素 C 再將其還原生育醇 ( Doba et al.，1985 ) 。因此，維生素 C 與生育醇具有相輔相成之作用，以保護細胞膜對抗脂質過氧化脂傷害。. 30.

(45) 3. 麩胱甘肽 ( glutathione， GSH ) 麩胱甘肽由三種胺基酸所組成，分別為甘胺酸 ( glycine ) 、半胱胺酸 (cysteine )、麩胺酸 ( glutamic acid ) ，為一低分子量的硫醇類物質，是體內重要的天然抗氧化物質。GSH 具有兩項功能，一是做為過氧化氫和有機氫過氧化物的還原劑，在麩胱甘肽過氧化酶的作用下，可將過氧化物還原，還原態的麩胱甘肽 ( reduced glutathione ， GSH ) 為一具有 γ -glutamyl-cysteinyl-glycine 三個胺基酸所組成的低分子量蛋白質，還原態的 glutathione 會在 glutathione peroxidase 的協助下將過氧化物質還原，而使其本身轉變為氧化態的 glutathione ( glutathione disulfide，GSSG ) ，而氧化的 glutathione 會再藉由 glutathione reductase 以及 NAPDH 的輔助之下，還原成還原態的 glutathione ( Von Sonntag，1987 ) 。GSH 本身也具抗氧化性，當羥基自由基攻擊 DNA 時，會從 DNA 上奪取氫質子因而形成 DNA 自由基，而 GSH 即可提供氫質子予以修復此種損傷。. (二) 酵素性抗氧化系統 1. 超氧歧化酶 ( superoxide dismutase，SOD ) 超氧歧化酶 ( superoxide dismutase，SOD ) 是一群含有金屬離子之蛋白質家族，通常存在於粒線體中，是生物體內抗氧化酵素之一，主要功能為清除體內過多的‧O2-，而根據酵素活性中心所含的金屬離子不同，SOD 又可區分為 Cu/ Zn-SOD、Mn-SOD 與 extracellular superoxide dismutase ( EC-SOD )等 ( Arslantas，2002；Mates et al.，1999) 。 SOD 會將生物體內的. O2-轉變為毒性較低的 H2O2，以避免在細胞內堆積，對細胞造成傷. ‧. 害。. 31.

(46) 2. 觸酶 ( catalase，CAT ) 主要存在於細胞中的過氧化小體 ( peroxisome ) 內，人體以肝臟與紅血球中含量最高。Catalase 為四個蛋白質次單元體組成，每個單元體各含一個 heme group 與一分子的 NADPH，分子量約 240 kDa，其反應速率非常快，約莫 107 M/ sec，顯示其可有效快速的將 H2O2 轉換為 H2O 與 O2 ( Mates et al.，1999；Young and Woodside，2001 ) 。. 3. 麩胱甘肽過氧化酶 ( glutathione peroxidase，GPx ) 麩胱甘肽過氧化酶 ( glutathione peroxidase，GPx ) 為四個單元體所組成，分子量大小約莫 80 kDa，為一活性中心帶有微量元素硒 ( Se ) 之抗氧化酵素，其主要功能為清除 H2O2 或是其他氫過氧化物 ( LOOH/ ROOH ) ，而在催化的過程中需要有 GSH 的存在，才能進行氧化還原反應。目前已知存在於哺乳動物體中之 GPx 共有五種形式，其中除 GPx5 以外，其餘四種皆為硒依賴型酵素。GPx1 主要作用於清除 fatty acid hyroperoxide 與 H2O2，存在於大部分組織中，在紅血球、腎臟與肝臟中含量最多；GPx2 與 GPx3 體內含量並不多，而 GPx2 主要存在於腸胃道中，GPx3 則主要位於腎臟中；GPx4 位於大部分組織的細胞質與細胞膜上，可以保護脂質蛋白或細胞膜抵抗氧化傷害，其中又以腎臟上皮細胞及睪丸中濃度最高；GPx5 是近期被發現的新成員，主要存在於副睪中 ( Mates et al.，1999；Zachara et al.，2006 ) 。. 32.