4-1 結晶
結晶部分的實驗採用前述 micro batch 結晶法。分外加電場的實驗組以及不加電場之對照
組，結果分別以光學顯微鏡觀察。實驗使用之溶液、裝置以及流程如下文敘述。實驗全程於 室溫下進行。
溶液
A. 0.1M PH=4.6 醋酸鈉水溶液
B. 10% 氯化鈉溶於 0.1M PH=4.6 之醋酸鈉水溶液中
C. 8% 及 20% HEWL 溶於 0.1M PH=4.6 之醋酸鈉水溶液中 裝置
為觀察電場對於HEWL 晶體成長的影響，本實驗利用微影技術設計一可施加電場並可承載液 體之裝置於矽晶圓上。並設計各類形狀的電極以觀察在不同電場分佈下，HEWL 晶體成長的 變化情形。實驗裝置及流程如下頁圖示。
實驗流程
矽晶圓
以乾氧方式成長約 3000Å 之氧化矽薄膜
利用微影技術在氧化矽薄膜上定義溶液承載器皿 的位置及大小(1.5mm 平方)。並利用乾式蝕刻法 完成此蝕刻部分。
再次利用微影技術以及乾式蝕刻法定義金屬電極 的位置
利用電子槍鍍覆不同形狀之鈦-金電極。且金屬電極與矽晶 圓、與先前定義之溶液承載器皿之間皆留有氧化矽薄膜作為 絕緣之用。
利用濕式蝕刻法完成一可施加電場並可承載液體之裝置的製 作
採用micro batch 結晶法。混合適量之醋酸鈉以及氯化鈉水溶
Ti-Au 電極
Si-溶液槽
氧化矽上設計16 組不同形狀的電極，用來測驗不同電力線分布時，對晶體成長的影響 Top view
將蓋玻片切成小塊並以丙酮清洗，蓋住溶液。
用礦物油封住玻璃片，避免水蒸氣揮發。
(不外加電場的對照組，結晶部分實驗到此告一段落，等待結 晶。)
施加直流電場，等待結晶。
圖4-1 實驗流程
4-2 原子力顯微鏡(AFM)檢測
目前雖有人提出生物巨分子成核機制與傳統結晶學之成核理論有所差異15，但是因為此
理論尚未獲得廣泛的證實，在本文中不列為討論範圍。故不論一般傳統無機物或是生物巨分 子的結晶過程，大致皆可分為成核和成長兩部分。成核部分難以由影像直接觀察，目前多以 小角度 X-ray 散射8或是 Light scattering5 8 9 15作為檢測方法。成長部分由於可在晶體表面可預測 的位置進行觀察，原子力顯微鏡(AFM)在近年來已逐漸成為直接觀察生物巨分子成長及相關 現象的有力工具8。關於原子力顯微鏡(AFM)在生物巨分子晶體檢測方面的文獻已於前一章節 介紹，本小節將著重於本實驗中原子力顯微鏡(AFM)使用時有別於文獻的樣品準備方式以及 操作。
Top view
樣品準備及數據收集
1. 加入礦物油於上述裝置中覆蓋第一部分取得的已存在結晶之溶液
雖然如 HEWL 一般的標準品已可由商業管道取得，但是一般蛋白質的取得仍須自經 過自行純化的步驟，實屬得來不易。另外由文獻資料可以得知利用原子力顯微鏡作為檢測 工具時，樣品準備多依據以下兩種方法 : 其一，先長出晶種在移至蓋玻片上以適當濃度 的蛋白質溶液潤濕22 23 24，或是直接於蓋玻片上直接成長晶體，然後挑選一方位適當的晶體 作為檢測之用8 25 ( 各約 50uL )23。為節省蛋白質溶液的使用量，本實驗僅使用第一部分結 晶所需的溶液量(約 0.4uL)，實驗至結晶出現之後即利用礦物油(密度~0.8g/㎝3)覆蓋於溶液 上，避免溶液在檢測時蒸發。由於 AFM 檢測可在液態中進行，不若掃描式顯微鏡(SEM) 須經過脫水以及鍍金的處理21。此舉不但可如文獻中所期待在不使晶體表面接觸到空氣，
盡量維持晶體自然的狀況下檢測8 22 23 24 25
，相較於文獻中兩法(各約 50uL)，皆減少了蛋白質 溶液的使用量。
樣品準備好之後即置於 AFM 所配備之 standard liquid cell 之下，利用氣壓吸附上述裝 置於 AFM 之壓電平台，配置如下圖 4-2 所示。
2. 原子力顯微鏡(AFM)之數據收集
本實驗收集數據時所使用的AFM 機型為 Digital Nanoscope Ⅲa ( Digital Instruments ) 。
難題
由於生物巨分子易碎和柔軟的特性，在利用 AFM 檢測時，常常遭遇一些實際操作上的困 難。
i. 第一個難處是因為檢測必須在液態中進行，首先要克服的就是如何將待測的 晶體固定於基材上，避免因為晶體漂浮在溶液之中造成滑動而無法檢測的情 形8。
ii. 其二則為前述溶液暴露在空氣造成揮發的問題。
iii. 利用 AFM 探針掃描成像的過程中，最困難的部分則是礙於生物巨分子晶體的 過於柔軟以及對探針的敏感8。甚至有可能因為探針的掃描而對晶體表面產生 物理性的傷害8。
解決方案
根據文獻，晶體難以固定的問題可以依賴直接在基材，通常是蓋玻片，上直接成長巨分 子晶體來解決8 25；或是在檢測時使用彈性的碳纖維將晶體“鉗＂(clamp)住8。在實作經驗中，
我們也曾經嘗試直接將晶體成長於蓋玻片上，但是並未因此得到良好的固定效果，同時在水 中漂流的晶體嚴重干擾了 AFM 懸臂(cantilever)的移動。但嘗試將晶體成長於上述設計的裝置 中時，由於溶液的體積減少，成長出的晶體減少，而觀察所得全部的晶體都成長於矽晶圓表
面，而且附著良好，不至於因為探針掃描而移動位置，倒是適切地解決了晶體飄動的問題。
對於生物巨分子晶體的過於柔軟，不易檢測，且為了避免探針和晶體表面的其他交互作 用力，懸臂之彈性係數(spring constant)須小於 1N/m8 25 。根據文獻，AFM 的 tapping mode 雖然 可能造成獲得的影像較 contact mode 不清晰，但在某種程度上已經稍微克服了巨分子晶體過於 柔軟不易檢測的困難8。但在本實驗實際操作過程中，這仍然是一個相當棘手的問題。即使在 以拍敲式掃瞄(tapping mode)的情況下，為了獲得較清晰的影像，我們必須施加一個較大的力 量於 AFM 探針，增加探針對待測物表面高低起伏的敏感度。但是過大的力量即會對生物巨分 子晶體造成物理性的傷害。得到清晰的影像實為不易，在這方面的實驗技術仍需要更加改進。