3-1 蛋白質結晶
3-1-1 簡介
蛋白質是建構所有生物體的基本單位，而且是活體系統中能量和訊息傳遞過
程中(information and energy processing)必備的構成要素。為了瞭解基因組(genome)對應於蛋白質
（可能是未知性質的一連串胺基酸或是核苷酸(nucleotide)序列）的
“結構-功能＂關係、探討巨分子如何在一個生物系統中作用，甚至是新藥物(抑制劑)的開發，
而開啟了近年來在蛋白質結晶這領域的研究123。
不同蛋白質、核酸(nucleic acid)、以及蛋白質-核酸複合物(complex)的數量，相較於已知無 機物可能組成的相(phase)，可能是數十萬倍以上。此種情況造成我們至今無法以定量的方式 預測一種新的生物巨分子的結構或是結晶狀況2。另一方面，雖然逐漸進步的核磁共振(NMR) 技術正提高可接受蛋白質分子尺寸的上限；以繞射方法，包括：X-ray、電子以及中子繞射，
仍然是現今檢測蛋白質結構的主流 4。
與一般無機材料不同的是蛋白質的結晶中還納入了溶液中大量的水分子、離子以及少量 的中性分子2，而且晶體中蛋白質巨分子互相接觸用以穩定晶體結構的鍵結，比起一般無機物 或是簡單有機物複合物的結晶顯得相對脆弱且為數稀少，且晶體之中存在大量不規則排列的 溶質通道，由於以上原因，使得在 X-ray 繞射圖形下才會發現，即使巨觀上看起來是各晶面 整齊漂亮的蛋白質晶體，實際上並不一定是高度組成以及結構統一之巨分子秩序排列的晶體
3。為了提高解析度至 1.5~2Å4 ，X-ray 等各類繞射方法需要足夠大(通常是 0.3~1.3mm)、低缺陷、
高組成統一，以及結構統一的單晶。日前蛋白質的表達(expression)、純化、檢測儀器發展以及 繞射數據的電腦分析系統，都有快速的成長以提高解(solve)蛋白質結構的速度。最大的瓶頸惟 獨存在於：製備高品質的蛋白質晶體以提供 X-ray 繞射的素材 3 4。
在結晶的過程之外，許多生物化學或是生物醫學方面的研究，常常受限於因為無法完全 透視蛋白質成核成長的機制而窒礙難行。例如在藥物釋放方面，因為晶體較為緩慢的溶解速 率，可以達成較穩定長時間藥物治療的目的，已被使用在胰島素和其他蛋白質藥物上4。在這 方面的需求上，體積大且等體積而數量少的晶體能夠達成緩慢且穩定之溶解速率的要求，當 然遠遠勝過體積較小而數量多的晶體。為了達成這樣的目的，需要縮短成核時間，並使所有 晶體都於相同遞減的過飽和度下成長4。
其他結晶在生物醫學上相關的研究包括：在人體內因為蛋白質結晶或是其他規則性的固 體聚集造成的疾病，例如鐮刀型貧血症以及白內障4；蛋白質工程以及合成疫苗的設計3。 蛋白質的分子大(幾個 nm)、成長速度慢(成長速率可以秒計算)，滿足於現今表面檢測 工具的限制，可以直接檢測出成長實況。因此蛋白質晶體的成長，也為傳統基礎的晶體學和 成長機制的研究提供理論或是實證上的貢獻4。
綜合以上各項因素，蛋白質結晶大約於 80 年代早期成為一門獨立的研究領域4。如前所 述，受限於此系統龐大的複雜性，目前尚無方法可以預測一未知蛋白質可能的結構或是可能
得蛋白質結晶逐漸成為一門較偏向經驗性(empirical search)的學門，眾多回顧蛋白質結晶的文 獻，常常以“蛋白質結晶是一門藝術而非科學…＂作為開端3。而此經驗性的研究方法大致可 分為兩步驟 5：
1. 從錯誤中嘗試找到適當的溶液，使蛋白質能夠結晶而不是非晶質的析出物。
2. 調整溶液的比例和濃度，使晶體長到適合的大小，足以提供 X-ray 繞射檢測 結構。
雖然以目前的狀況看來，從嘗試錯誤中個別找出適合不同蛋白質的結晶條件，似乎能達 到較佳的結晶效率。但是如何將蛋白質結晶在藝術之外，真正納入科學可以接受的領域？部 分相信，實驗結果顯示，由於蛋白質結晶是一種過於龐雜的過程和系統，很難歸納出有系統 的基本原則；然而近十年來，眾多研究開始著重於各情況下成核以及成長機制的推演。在眾 多研究中，推衍出一個合理的規則系統，才是這些方法背後迫切需要3而且最終應該達成的目 的。深度的理論研究和實驗技術上操作的同時並進，才能真正促成一門學問的發展與演進2。 在蛋白質成長機制的研究中，以Hen Egg White Lysozyme (HEWL)作為實驗材料者，佔 有相當顯著的比例 4 6。HEWL 這種醣類的水解酵素，是最早利用 X-ray 解出結構的蛋白質之 一7。除了因為長期的研究使得這個蛋白質累積相較於其他種類蛋白質為多的實驗經驗和參數 外，不少實驗已證實以HEWL 為基礎所推衍出的成長機制適用於其他廣大範圍的蛋白質4。 HEWL 也常使用於蛋白質 folding dynamic 以及其他蛋白質相關的基礎研究中4。
本實驗的目的是觀察在外加電場環境下，蛋白質晶體成長機制的變化－以HEWL 為例。
在接下來的章節中，本文將陸續回顧蛋白質晶體各類技術上的成長方法，以及現今所知的結
構、成長機制和檢測技術，接著導入本實驗進行的流程設計。
3-1-2 常用方法簡介
與一般傳統的結晶方式相同，要開始蛋白質結晶的第一步驟即是使溶液中的溶質濃度達 到足夠的過飽和度。當溫度、pH 值或其他因素改變時，巨分子靜電特性、表面型態以及結構
都可能隨之改變，同時也影響蛋白質溶液的溶解度。除了溫度和pH 值，蛋白質結晶系統中 另外一個較為常用的參數是析出劑(precipitant)。析出劑通常是鹽類或高分子：鹽類會跟蛋白
質競爭水分子；高分子，如PEG (polyethylene glycol)會在溶液中與水作用，逐漸擴大體積而 迫使水中的巨分子擠在一起，在其他條件相同的狀況下，使蛋白質溶液的濃度提高。基本的 巨分子結晶方法就是在定溫下調控pH 值以及嘗試找出可能的析出劑，不斷的試驗之中，慢 慢降低溶解度，提高巨分子濃度，以達到足夠的過飽和度。
目前可用以結晶巨分子的方法如下所列：
1. Bulk Crystallization 2. Batch Method 3. Evaporation 4. Bulk Dialysis
5. Concentration Dialysis 6. Microdialysis
7. Liquid Bridge
8. Free Interface Diffusion 9. Vapor Diffusion 10. Sequential Extraction 11. pH-Induce Crystallization
一般最常使用且成功率最高的兩者為2. Batch Method 以及 9. Vapor Diffusion 。在本小節中 僅就此兩方法的原理、操作方法以及優缺點作一介紹。
3-1-2-1 Vapor Diffusion
Vapor Diffusion 是目前最廣為使用的方法，適合用來篩檢(screen)大量、不同溶液的各類
結晶情形，從中選取適合的溶液，再加以調整濃度，成長出可以用來做X-ray 繞射試驗大小 的晶體。
Vapor Diffusion 依支撐液體方式的不同可分為 hanging drop、sitting drop 以及 sandwich。右圖 3-1 所示為 hanging drop。
圖3-1 Cdrop (圖中 drop 的濃度)不能達到足以析出結晶的過飽和度。且 C析出劑indrop< C析出劑in reservoir。因蒸汽壓隨鹽類析出劑的濃度增加而降低，
所以液滴中的水氣會逐漸揮發(液滴中的析出劑濃度一定相對 reservoir 為高)，直到最終系統內液滴和 reservoir 的蒸汽壓達到平衡。驅使液 滴發生過飽和現象。(C: concentration)
雖然支撐方法不同，但這三種方式的基本原理是類似的。首先必須將固定pH 值之緩衝溶液 (buffer solution)內加入析出劑。析出劑和緩衝溶液的混和溶液稱為 reservoir。如上圖 3-1 所示。
希望結晶出現的液滴(drop)中可能由極小量的蛋白質溶液，reservoir，或是其他析出劑所組成，
液滴內析出劑的量必須少於可以在溶液中析出蛋白質的量，也就是液滴濃度不能達到足以析
許reservoir 和液滴中的水或其他揮發性溶劑進行交換。因蒸汽壓隨鹽類析出劑的濃度增加而 降低，所以液滴中的水氣會逐漸揮發(液滴中的析出劑濃度一定相對 reservoir 為高)，直到最
終系統內液滴和reservoir 的蒸汽壓達到平衡。這樣的過程激發了至少兩項行為驅使液滴發生 過飽和現象：
1. 提高液滴中析出劑的濃度。
2. 提高液滴中蛋白質的濃度。
以此原理在可商業取得的 Linbro plate (如下圖所示)的每個凹槽中，設計不
圖3-2 Linbro plate。每個凹槽中，設計不同種類溶液混合的 reservoir，即可初步檢索出最適合於某種巨分子晶體生長的容易 條件
同種類溶液混合的reservoir，進行養晶實驗，即可初步檢索出最適合於某種巨分子晶體生長 的容易條件。完成初步的檢索後，再微調溶液濃度，培養體積和品質足以使用於X-ray 繞射 的巨分子晶體。
但是在絕大多數的 Vapor diffusion 系統中，液滴和 reservoir 之間必定存在空氣，而當操 作的液滴體積在幾個微升(micro Liter、uL)時，即使是少量的空氣也會使液滴中的水氣揮發，
由於操作的速度快慢和其他人為因素影響，即造成了每次實驗的結果不一定能定量再現5。
3-1-2-2 Batch Method
Batch Method 是結晶和蛋白質晶體最古老的結晶法。此種方法的基本原理即是：直接把
未飽和的蛋白質溶液混入析出劑。析出劑加入後會調整原來蛋白質溶液的濃度使巨分子達到 足夠的過飽和度而析出成核。因為他的方便性，常用於設計觀察蛋白質晶體成長過程的影像 攝錄裝置中，或是用於粒徑分析(light scattering)、干涉式光學顯微鏡(interferometric optical microscopy)、原子力顯微鏡(atomic force microscopy)等各類分析時的操作5。此法中所需的蛋 白質溶液少則幾微升(uL)多則可達幾百毫升(mL)。小體積的 Micro Batch Method 為了避免水
分揮發，常搭配礦物油的使用5。近期也發展出利用不同密度的礦物油將小體積液滴置於兩種 不同密度的油之間，以懸浮不碰觸器壁的方式結晶。但此種方法不適用於需要緩慢地增加濃 度以達到足量過飽和度的某些蛋白質。
此外，micro batch method 由於析出劑和未飽和之蛋白質溶液接觸時，立即造成蛋白質溶
液濃度提高，故無論是將析出劑注入蛋白質溶液或是將後者注入前者混合時，微量分注器 (micropipette)滴入的速度以及注入溶液分佈都有可能造成不同的局部過飽和狀況，導致同樣
變因的不同組別實驗可能發現不同的成核數目或是晶體數目，此現象容易發生於低濃度的蛋
變因的不同組別實驗可能發現不同的成核數目或是晶體數目，此現象容易發生於低濃度的蛋