1.8.1 登革熱病毒的 cDNA clone
要了解登革熱二型病毒組裝訊號的位置，首先，需要得到整個病毒全 長的cDNA clone。我們使用 Sriburi 等人的方法(Sriburi et al., 2001)，以 high copy number 載體，在抗生素濃度減半（25μg/ml）及低溫（25℃）的生長 狀況下，篩選具有登革熱二型病毒全長基因序列質體的 E. coli。為了分析得 到具有登革熱二型病毒全長基因序列的質體是否具有感染性，參考 Semler 的方法(Semler et al., 1984)，利用能夠被真核細胞啟始的病毒啟動子序列，
使細胞的 RNA 聚合酶合成病毒的 RNA 以產生病毒所需的蛋白。我們選擇 含有CMV 啟動子的載體 pcDNA3，將登革熱病毒的基因序列轉殖至此質體 上，期望能得到在哺乳動物細胞內可以進行轉錄並轉譯出病毒蛋白的質
體；將此質體轉染至 BHK-21 細胞中，測試得到的登革熱病毒基因序列是 否具有感染性。
1.8.2 登革熱病毒組裝訊號的搜尋
關於登革熱二型病毒組裝訊號的搜尋，計畫先將登革熱二型病毒的基 因序列分成兩段，結構性基因及非結構性基因部份。將含有報導基因及結 構性基因或含有報導基因及非結構性基因的質體轉染至細胞，讓細胞合成 出帶有報導基因及登革熱病毒基因（結構性或非結構性基因）序列的RNA，
同時，對細胞進行登革熱病毒的感染，產生登革熱病毒所需的蛋白。登革 熱病毒進行組裝時，會將具有組裝訊號的RNA 進行包覆，產生病毒顆粒，
釋放至細胞外。將產生出的病毒收集後，感染新的 BHK-21 細胞，如果能 在被感染的細胞內偵測到報導基因的表現，即可得知報導基因上帶有的登 革熱病毒序列具有病毒組裝訊號。
考慮到病毒組裝訊號可能有相對位置關係的狀況，我們決定將報導基 因設計在結構性基因下游，非結構性基因的上游，以符合結構性基因及非 結構性基因在病毒genome 上的相對位置。報導基因選擇 lacZ，則是考慮到 偵測過程簡單，只需要進行 X-gal 染色，方便觀察。此外，為了避免 RNA 的長度干擾了病毒組裝RNA 的能力，在質體建構過程中，將含有結構性基 因及報導基因的質體，在後方插入一段序列，稱之為Spacer DNA，以符合 病毒 genome 的長度。根據 Proutski 等人推測，登革熱病毒的 5’及 3’UTR 序列可能具有病毒的組裝訊號(Proutski et al., 1997)，因此在含有報導基因及 結構性或非結構性基因的兩端皆分別加入5’及 3’UTR 的序列。
初步實驗後發現，報導基因在 BHK-21 細胞中的表現狀況並不理想，
因此參考Kozak 等人的文章(Kozak, 1981)及 pcDNA3.1 手冊上的建議，在報 導基因前方加入Kozak sequence，期望能使基因表現量增加。
此外整個實驗設計原本是採用 monocistronic 的方式，期望利用細胞內 的酵素（signalase），將合成出來含有報導基因及結構性或非結構性基因的 多肽鏈順利分割成報導基因所含的蛋白及結構性或非結構性蛋白，然而所
得到的結果並不理想。於是改而採用bicistronic 的方式，也就是經細胞轉譯 出來的 RNA 含有報導基因及結構性基因或非結構性基因兩個轉譯讀框
（open reading frame，ORF），並在後方 ORF 的上游接上 EMCV IRES，以 增加後方ORF 基因的表現量。
近代西方發現類似登革熱疫情至今，大約已有二百年左右。整個病毒 的生活史，從病毒感染細胞後，RNA 的複製、病毒多肽鏈的合成及裂解、
各蛋白的功能及病毒組裝過程，都有程度不一的了解。然而登革熱病毒組 裝時所需要的組裝訊號（packaging signal），至今仍然沒有任何文獻的探討。
究竟在病毒組裝過程中，如何區別病毒產生的 RNA 與細胞產生的 RNA，
以便將病毒的RNA 進行組裝，合成出具有感染性的病毒顆粒？這些訊號位 於病毒RNA 的何處？為了瞭解登革熱二型病毒組裝訊號的位置，進行一連 串的質體建構、報導基因的選擇及表現，期望能為整個實驗建立可行的基 本架構。
貮、材料