登革熱二型病毒感染性質體建構及表現

4.1.1 pcDNA3-NCS 質體建構

由於pcDNA3 上的 MCS（Multiple cloning site）並不能滿足質體建構的 需求，故將 pBluescriptⅡSK(+)上的 MCS 轉置至 pcDNA3 上。將質體 pBluescriptⅡSK(+)以限制酶 HincⅡ（blunt end）及 Xba I 進行作用，所得到 53bp 之 DNA（pBluescriptⅡ之 MCS）當作殖入片段（insert）；利用限制酶 Hin dⅢ對質體 pcDNA3 進行切割，再以 Klenow enzyme 對切位進行修飾，

形成平端（blunt end），之後以 Xba I 進行切割。將殖入片段與經限制酵素 作用的 pcDNA3 進行接合，經選殖得到的質體命名為 pcDNA3-NCS，如圖 一所示。此質體以 BamH I 及 Stu I 作用後得到 4.3 及 1.1kb 之 DNA 片段；

以 Cla I 及 Fsp I 作用後，得到 2.4、1.6 及 1.4kb 之 DNA 片段；以 HindⅢ及 Nde I 作用後，得到 5.0 及 0.4kb 之 DNA 片段；以 Nco I 及 Xba I 作用後，

得到3.3、1.0、0.7 及 0.3kb 之 DNA 片段；此外尚有額外的 band 標示為 z。

限制酵素作用位置圖及電泳圖請參照圖二十三。

4.1.2 RT-PCR

萃取病毒 RNA，以 D2F0001A’及 D2R10723A 當引子，引入限制酵素 Cla I、Xba I 之切位分別於 PCR 產物之 5’端及 3’端，利用 RT-PCR 方式得到 含病毒全部基因序列的DNA （nt 1 ~ nt 10723），預期得到全長約為 10.7kb 的 DNA 片段。取 5μl 的 RT-PCR 產物進行電泳分析。共得到三條主要的 DNA 片段，分別位於 10、3.5 及 1.5kb 的位置，另有不明顯者位於 4kb 的 位置，結果請參照圖二十四。

4.1.3 TA cloning

直接利用TA cloning 方式將 DNA 片段接入 pCR-XL-TOPO 的載體上，

命名為 pCR-XL-TOPO/DV2F ，如圖二所示。經過酵素作用後，初步判定 總共得到五個含有登革熱病毒全長cDNA 的質體，分別命名為 P、Q、R、S、

T。pCR-XL-TOPO/DV2F 經 BamH I 及 EcoR V 作用後，得到 5.0、3.5、2.1、

1.7、1.4 及 0.5kb 之 DNA 片段；經 Hind Ⅲ作用後，得到 7.5、5.0、1.1 及 0.5kb 之 DNA 片段，皆符合預期。限制酵素作用位置圖及 P 的電泳圖請參 照圖二十五。

4.1.4 登革熱二型病毒感染性質體建構

將pCR-XL-TOPO/DV2F 以限制酶 Cla I 及 Xba I 將含登革熱病毒基因 序列的DNA 切出，與經過 Cla I 及 Xba I 限制酶作用的質體 pcDNA3-NCS 進 行 接 合 。 經 過 轉 形 選 殖 後 ， 得 到 可 能 具 有 感 染 性 的 質 體 為 pcDNA3-NCS/DV2F，如圖三所示。將自 P 質體所得不同菌落的命名為 P1、

P2、P3，自 Q 質體所得到不同的菌落命名為 Q1、Q2、Q3，自 R 質體所得 不同菌落命名為R1、R2、R3，自 S 質體所得不同菌落命名為 S1、S2、S3，

自 T 質體所得不同菌落命名為 T1、T2、T3。pcDNA3-NCS/DV2F 經 Ava I 及 Xba I 作用後，得到 7.8、3.5、1.9、1.5、1.1 及 0.3kb 之 DNA 片段；經 Bam HI 及 Eco RV 作用後，得到 8.4、5.0、2.1 及 0.5kb 之 DNA 片段，皆 符合預期，限制酵素作用位置圖及P1 的電泳圖請參照圖二十六。

4.1.5 登革熱二型病毒感染性質體的表現

利用QIAGEN Plasmid Midi 抽取感染性質體 P1、Q2、R3、S3、T1。

將質體利用Calcium phosphate 的方法轉染至 BHK-21 細胞中，經過 48 小時，

收集上清液，以0.22μm 過濾器過濾。將被轉染的 BHK-21 細胞直接加入 4 毫升1.1﹪的 methyl cellulose，置於 37℃培養 7 天。而經過濾的上清液則對 新的BHK-21 細胞進行感染，在 37℃感染兩個小時後，加入 4 毫升 1.1﹪的 methyl cellulose，置於 37℃培養 7 天。最後以甲醛固定 15 分鐘，再以結晶 紫染色 2 小時後，以清水沖洗，觀察是否有空斑形成。結果顯示，在實驗 組方面（P1、Q2、R3、S3、T1），不論是被轉染的細胞，或是以上清液感

染的細胞皆無任何的空斑生成。在控制組方面，以病毒感染的控制組有明 顯空斑生成；以 pcDNA3 進行轉染的細胞，不論是被轉染的細胞，或是以 上清液感染的細胞皆無任何的空斑生成，P1 的結果如圖四十一所示。

4.1.6 確認感染性質體是否能在 BHK-21 細胞中進行轉錄

結果4.1.5 顯示，得到的五個感染性質體在進行空斑試驗時，皆無任何 的空斑生成。為確定感染性質體的轉錄過程是否有問題，選擇了二個感染 性質體，將其轉染至BHK-21 細胞 48 小時後，抽取細胞的 RNA，利用 RT-PCR 方式，確認感染性質體是否能在細胞中成功轉錄出 RNA，同時也進行一組 含有E 基因質體的 pcDNA3-E14（本實驗室邱美惠提供，請參照附圖七），

已被確認可以在 BHK-21 細胞中進行轉錄，當作是 positive control，另以 pcDNA3 質體當作為 negative control。過程中以 E 基因的引子（E14F 及 E14R）

做為RT-PCR 所需要的引子。為確認結果並非因為 RNA 萃取的過程中，萃 取到轉染時殘留的質體造成的false positve，另外取 RNA 直接進行 PCR，

與 RT-PCR 的結果做為對照。又為了確認結果並非因為 PCR 材料被質體污 染所造成，進行一管未加任何模板的PCR 混合物，直接一起進行 PCR 反應，

所獲得的RT-PCR 或 PCR 產物，取 5μl 進行電泳分析。結果顯示，經過 P1、

Q3 轉染的細胞所抽取的 RNA 皆可在 RT-PCR 中得到約 1.5kb 的 band，而經 pcDNA3 轉染的細胞所抽取的 RNA 在 RT-PCR 的結果並沒有 1.5kb 的 band 生成。而以 RNA 當模板的電泳分析，則未有任何 band 的生成，如圖四十 二所示。

4.1.7 DNA 定序

感染性質體可以在細胞中進行轉錄，卻不能表現出感染性的病毒，故 先將含clone P1 結構性基因進行 DNA 定序（若 DNA 序列過長，可能會干 擾定序結果，故先以含結構性基因的質體 pcDNA3-NCS/5’S3’UTR 進行定 序，建構過程請參照4.4.1），定序引子在質體上的相對位置圖請參照圖四十 五，定序結果請參照表一。將定序所得的基因序列轉換成胺基酸序列的結

果請參照表二。結果顯示，對應於登革熱二型病毒新幾內亞株（NGC strain, M29095, NCBI）核苷酸序列上第 2512 的位置（第 806 個胺基酸位置，位於 NS1 蛋白）發生了一個點突變，使得原本應為榖胺醯胺（glutamine）的 CAA 變成TAA，造成蛋白質轉譯的停止。

為確認核苷酸序列上第2512 位置的突變是在 RT-PCR 時產生的或是在 將登革熱全長cDNA clone 由 pCR-XL-TOPO/DV2F 轉殖至 pcDNA3-NCS 時 產生的，將 pCR-XL-TOPO/DV2F（P clone）進行定序，結果顯示，在 pCR-XL-TOPO/ DV2F（P clone）上本身就已發生突變。