質體建構 - 探討登革熱二型病毒PL046之質體建構及報導基因的選擇

pcDNA3 原本具有的 MCS（multiple cloning site）不敷後續質體建構上 使用，因為上面的酵素切位大多可以作用在報導基因 lacZ 或是登革熱病毒 的 genome 上。為了日後質體建構的方便，觀察過 pBluescriptⅡSK(+)上的 MCS 後，決定以 pBluescriptⅡSK(+)上的 MCS 取代 pcDNA 的 MCS，建構出含有新的MCS 的 pcDNA3-NCS（請參照結果 4.1.1）。經限制酵素作用後，

在 BamH I 及 Stu I 進行作用的組別有一條不符合預期的 DNA 片段（band z），請參照「圖二十三」，由於此 DNA 片段大小界於 5kb 至 6kb 之間，而 pcDNA3-NCS 的大小為 5.4kb，故推測 band z 應該是酵素作用不完全所造成。

實驗計畫先行建構出含有登革熱毒病全長的cDNA clone，以尋找出登革熱病毒的組裝訊號，並建立可行的實驗架構。在實驗的過程中，參考Siburi 等人的建議(Sriburi et al., 2001)，以抗生素濃度減半（25μg/ml）及低溫（25

℃）的條件篩選登革熱病毒full length cDNA clone。在進行結構性基因或非結構性基因報導質體建構時，也採用相同的條件，對含有登革熱病毒基因序列的報導質體進行篩選。

在 pCR-XL-TOPO/DV2F 質體建構過程中，曾試圖提高篩選溫度至 37

℃，然而在此條件下，得到的質體長度並不符合預期。而在以上述 Siburi 等人建議的條件下，培養約 24 至 48 小時，獲得的質體長度，大多符合預期。在限制酵素作用時，由於並沒有 PL046 strain 的基因序列，只能根據 NGC strain 的序列做為參考，再根據不同菌落所得到的質體經限制酵素作用後所得到的DNA 片段互相比較，並對所產生的 DNA 片段長度進行加總，

觀察質體的總長是否符合預期。

在後續的質體建構過程中，所得到的質體在以限制酶作用後，皆會與 pCR-XL-TOPO/DV2F 做比較，觀察是否有突變的狀況發生。儘管如此，假設在質體內有發生點突變（point mutation）或小片段的刪除（deletion），以限制酵素作用的方式確認，可能還是無法偵測到。在登革熱基因序列發生

了點突變或小片段刪除的狀況下，如果沒有使整個RNA 的二級或三級結構發生改變，對於整個組裝訊號的搜尋，應該不至於造成太大的影響。但亦無法排除登革熱基因序列僅發生了小片段刪除或點突變卻造成RNA 的二級或三級結構發生巨大改變的可能性。

5.2 登革熱二型病毒感染性質體建構及表現

根據結果4.1.5 顯示，質體建構得到的五個登革熱二型病毒感染性質體皆無法表現出具感染性的病毒；在結果4.1.6 顯示，雖然無法表現出具感染性的病毒，但可以轉錄出RNA；在結果 4.1.7 顯示，以 pcDNA3-NCS/DV2F

（clone P1）質體進行建構的 pcDNA3-NCS/5’S3’UTR 經過基因定序後，發現在第2512 的位置（第 806 個胺基酸位置）發生了一個點突變，使得原本應為榖胺醯胺（glutamine）的 CAA 變成 TAA，造成蛋白質轉譯的停止；為得知突變發生的時間點，再將pCR-XL-TOPO/DV2F（clone P）進行定序，

結果顯示，在pCR-XL-TOPO/DV2F（clone P）本身就已發生突變，即此一突變應該是在RT-PCR 過程就已發生。

由於只針對其中一個感染性質體進行結構性基因的序列分析，無法得知其它四個質體的DNA 序列是否也有發生突變。綜合上述結果，針對下列二點進行討論：一、pcDNA3-NCS/DV2F 突變發生的可能成因。二、假設在未發生突變的狀況下，造成 pcDNA3-NCS/DV2F 在細胞內無法製造出感染性質體的原因。

一、pcDNA3-NCS/DV2F 突變發生的可能成因：第一，突變是在 RT-PCR 或是質體建構過程中發生，造成質體無法正常表現，所得到的 pCR-XL-TOPO/DV2F 與後續建構的 pcDNA3-NCS/DV2F，質體內所含的登革熱病毒基因序列都是不具功能性的。第二，突變是在實驗過程中產生的，

pCR-XL-TOPO/DV2F 內所含的登革熱病毒基因序列是具有功能性的，而接續建構的質體 pcDNA3-NCS/DV2F 所含的登革熱病毒基因序列是不具功能性的。整個實驗設計的目的在於簡化過去在建構感染性質體時，常採用的方法：利用SP6 或 T7 啟動子在 in vitro 狀況下合成出病毒 RNA 再對細胞進

行轉染。相對的，本實驗利用pcDNA3 上的 CMV 啟動子，直接以質體進行細胞轉染，讓細胞自行合成出病毒 RNA，轉譯出病毒所需的蛋白。然而，

過去在進行 flavivirus 感染性質體的建構研究指出，flavivirus 完整的 DNA 序列所產生出來的蛋白可能對 E. coli 具有毒性(Varnavski et al., 2000)。另 外，Lewin 等人針對五種病毒啟動子在 E. coli 菌體內進行分析，除了來自 HSV I 基因上 Thymine kinase 的啟動子以外，包含 CMV 等四種病毒的啟動 子可以被 E. coli 驅動並表現螢光蛋白(Lewin et al., 2005)。Mishin 等人證明 CMV 啟動子在 E. coli 內確實會被轉錄，並轉譯出螢光蛋白，若去除 CMV 啟動子的enhancer，可使螢光蛋白表現量下降 5 至 6 倍。隨後，他們便以缺少 enhancer 的 CMV 啟動子，成功的建構出日本腦炎病毒的感染性質體 (Mishin et al., 2001)。另外，在 CMV 啟動子含有 enhancer 的狀況下，他們則藉由在日本腦炎病毒基因序列中插入intron 的方式，使得整段病毒序列在 E. coli 中無法表現日本腦炎病毒的蛋白，但可在真核細胞內藉由 splicing 的 過程，去除intron 產生病毒蛋白，也成功的建構出感染性質體(Yamshchikov et al., 2001) 。我們在質體建構過程中亦發現，含有 lacZ 的 pcDNA3-NCS/5’Z(YEP)3’UTR（含有 CMV 啟動子 enhancer、CMV 及 T7 啟動子）轉形至 E. coli DH5α，如果在培養基上加入 X-gal，可以得到藍色 的菌落，即CMV 與 T7 啟動子在 E. coli DH5α strain 中至少有一個有 leaky 的現象。在登革熱二型病毒感染性質體的設計是利用含有enhancer 的 CMV 啟動子，可是沒有對登革熱病毒的ORF 中做任何的修飾。可能因登革病毒 產生的蛋白對 E. coli 具有毒性，導致質體建構得到的 pcDNA3-NCS/DV2F 是經過突變不具感染性的質體。

二、假設在未發生突變的狀況下，造成 pcDNA3-NCS/DV2F 在細胞內 無法製造出感染性質體的可能改善如下：最近的研究指出，正確的 flavivirus 之3’UTR 是在病毒複製時所必需的(Yu et al., 2005)；亦可提升細胞對病毒 RNA 進行轉譯的效率(Holden et al., 2004)。在整個實驗過程中，可能在 RT-PCR 及質體建構過程皆未發生突變，整個 ORF 的序列是可以合成出完整的多胜肽鏈（polypeptide），然而由於在實驗設計時，未將載體上 5’UTR

上游及3’UTR 下游多餘的 DNA 序列進行刪除（deletion），留下多餘的基因序列（請參照表三）。在蛋白質合成出來後，即便合成出完整的登革熱病毒，

感染到下一個細胞，但由於 5’及 3’UTR 兩側多出來的 RNA 序列，可能影響 RdRp 與 RNA 的結合，干擾 RNA 的複製，使得病毒不具感染性。根據稍早文獻指出，RNA 病毒的 5’及 3’端若存在有非病毒本身的核苷酸會大幅減少病毒的感染力（infectivity），並推測這些多出的核苷酸可能會妨礙 RNA 的合成。至於影響的程度，則與非病毒本身核苷酸的序列、長度及病毒的種類有關(Boyer et al., 1994)。在 Kunjun virus（同屬 flavivirus）的研究中指出，在3’UTR 後面加上一個 HDVr（hepatitis delta virus ribozyme），將多餘的 RNA 切除，可以使整個感染率上升大約 2.6 倍(Liu et al., 2003)。關於 flavivirus 在 5’端的非病毒序列與病毒感染力的分析，並沒有查詢到相關的 文獻記載；但過去在設計病毒感染性質體時，皆採取直接在啟動子後方加上 5’端的病毒序列，減少 5’端的非病毒序列的生成。雖然多餘的 3’端的非病毒序列並不至於造成病毒感染力完全喪失，但亦無法排除 5’端的非病毒序列或者 5’與 3’端的非病毒序列同時存在時，使得病毒感染力喪失的可能性。

綜合上述的二個問題，接下來需要確認所得到的登革熱病毒基因序列是否能表現。建議可以利用 PCR 方法，以 pCR-XL-TOPO/DV2F 當模板，

合成出不含非病毒本身核苷酸序列並帶有SP6 或 T7 啟動子的登革熱病毒全長DNA，利用 in vitro 方式轉錄出病毒 RNA，加上 5’端 cap 後，對 BHK-21 細胞進行轉染及空斑測試，以確認所獲得的 5 個 cDNA clone

（pCR-XL-TOPO/ DV2F）內含的登革熱病毒序列是否具有功能性。在確認合成出來的蛋白是具有功能性之後，再針對登革熱病毒 PL046 株去做更深一步的研究與探討。

5.3 報導基因的表現

登革熱病毒的基因序列只有一個 ORF，在細胞進行轉譯後，生成一條多肽鏈，再藉由細胞內的酵素（signalase）將結構性蛋白與非結構性蛋白分

開(von Heijne, 1985)。一開始實驗在設計報導質體的建構時，原本想利用上述方式，合成出一條含有β-半乳糖苷酶與登革熱病毒的結構性或非結構性蛋白的多肽鏈，再藉由細胞內的酵素，將β-半乳糖苷酶與登革熱病毒的結構性或非結構性蛋白分開。然而，在建構出 pcDNA3-NCS/5’ZNS(MONO) 3’UTR 並轉染至 BHK-21 細胞後，結果顯示報導基因的表現狀況不佳（請參照結果4.6）。

為了增加報導基因表現的量，針對了三個方向做修正。第一，根據黃熱病毒replicon 的研究指出，要讓 replicon 所含的報導質體順利表現，主要有兩種方法：第一種是 monocistronic 的方法，報導基因與黃熱病毒基因共用一個ORF，並在中間插入一個 2A（autoproteolytic peptide from foot and mouth disease virus）的基因序列，當多肽鏈合成出來後，2A 蛋白可將報導基因蛋白與黃熱病毒蛋白切開，讓報導基因蛋白順利表現。第二種是 bicistronic 的方法，也就是將報導基因與黃熱病毒基因各為一個 ORF，在二個 ORF 中間插入一段 IRES，以使第二段 ORF 轉譯效率增加(Jones et al., 2005)。由於使用單一 ORF 的方法，在質體建構完成後，若要更動其中的某段基因片段，需要考慮in frame 的因素，會使整個過程變得複雜，因此我們選擇 bicistronic 的方式。在β-半乳糖苷酶與登革熱結構性或非結構性基因中間加入IRES，做為實驗設計的藍圖。第二，我們發現到報導基因的來源 YEP363 內所含的β-半乳糖苷酶基因序列有變異，造成限制酶 Eco RI 切位 消失。於是更改報導基因來源，改採用pBAG 上的β-半乳糖苷酶基因作為報導基因來源。最後，根據Kozak 發表的文章，在β-半乳糖苷酶基因上游加入Kozak sequence，希望能增加β-半乳糖苷酶的表現量(Kozak, 1981)。

在文檔中探討登革熱二型病毒PL046之質體建構及報導基因的選擇 (頁 51-56)