登革熱病毒簡介 - 探討登革熱二型病毒PL046之質體建構及報導基因的選擇

登革熱病毒在分類上是屬黃質病毒科（Flaviviridae）黃質病毒屬（Genus

Flavivirus），傳播途徑是藉由節肢動物叮咬患病宿主將病毒傳遞至下一位被感染者。登革熱病毒為正股的單股RNA 病毒，其 genome 在 5’端具有 cap，

3’端不具 poly A，整個基因序列只有一個 open reading frame（ORF），進行轉譯時，只會合成出一條多肽鏈（polypeptide），最後再藉由細胞內的酵素

（signalase）及病毒本身的非結構性蛋白將多肽鏈裂解成獨立的蛋白 (Henchal et al.,1990)。其基因組成可大略分為兩部份，結構性基因（structural gene）及非結構性基因（nonstructural gene）。結構性基因所對應（encode）

的蛋白質構成病毒實際結構部份，包含構成病毒的衣殼蛋白（capsid protein, C）、前驅膜蛋白（precursor membrane protein, PrM）及外膜蛋白（envelope protein, E）；非結構性基因所對應的部份，則是與病毒的 RNA 複製及病毒的蛋白裂解有關，主要有NS1、NS2A、NS2B、NS3A、NS3B、NS4 及 NS5(You et al.,1999)。

1.3 Kunjin virus 組裝訊號（packaging signal）的研究

經過查詢，登革熱病毒組裝訊號似乎沒有任何文獻探討，但是對於同 屬於 flavivirus 的 Kunjin virus 則有些許的文獻資料。過去研究 Kunjin virus 發現，在in trans 的狀況下，病毒進行組裝時，不會將結構性基因包覆至病毒顆粒中(Khromykh et al.,1998)；病毒 RNA 被組裝的前提是 RNA 要先被複製(Khromykh et al., 2001)；病毒在組裝時，需要完整的 NS3 基因(Liu et al., 2002)；NS3 基因發生突變會影響病毒 RNA 的複製，而 NS2A 蛋白則有報導指出可能與病毒的組裝有關(Liu et al.,2003)。因此 flavivirus 的組裝訊號至少有一部份可能在非結構性基因的區段中。

1.4 登革熱病毒 cDNA clone

西元1991 年，第一個登革熱病毒四型的 cDNA infectious clone 被完成，

且能在 E. coli 內大量複製(Lai et al., 1991)。然而，後續在登革熱二型病毒 cDNA infectious clone 的製作，卻發生了問題。西元 1995 年，Kapoor 等人將登革熱二型病毒分為二段進行質體建構，最後再利用in vitro ligation 的方

式，成功製作出具感染性的cDNA clone(Kapoor et al., 1995)。西元 1997 年，

Polo 等人發表了文章，利用 yeast 複製得到登革熱二型病毒全長的 cDNA infectious clone 後，將此質體放入 E. coli 內，也可成功複製，只是質體具有 的感染力較差(Polo et al., 1997)。Kinney 等人則綜合以上兩種方式，利用 low copy number 的載體，以 E. coli 複製登革熱二型病毒 cDNA infectious clone，

成功的得到具有感染性的質體(Kinney et al., 1997)。西元 2001 年，Sriburi 等人才成功的利用high copy number 載體，在 E. coli 複製出具有感染性的登 革熱二型病毒(Sriburi et al., 2001)。

1.5 cDNA clone 感染力測試（plaque assay）

過去，分析得到的登革熱病毒的cDNA clone 是否具有感染力，主要採用的方式是利用SP6 或 T7 啟動子，以 in vitro transcription 的方式，合成登革熱病毒的RNA，加上 5’端 cap 後，轉染至 BHK-21 細胞中，觀察是否有空斑（plaque）生成，然而此種方法過程煩雜且耗費時間。在 poliovirus 的研究中，Semler 等人將含有 poliovirus 全長的 cDNA 質體轉染至哺乳類動物細胞中，進行空斑測試，發現到可以得到具感染性的病毒，但生成的空斑數目不多；隨後他們在cDNA 前方加入 SV40 啟動子及 Ori（origin）後，將質體轉染至不同種類的細胞中，進行空斑測試，所得到的空斑數較先前未加啟動子及Ori 的質體可以增加 10 至 250 倍(Semler et al., 1984)。

1.6 Kozak sequence

根據 Kozak 等人的研究表示，真核細胞的 mRNA 在啟始密碼兩側的序列並非是隨機產生的。他分析了699 種脊椎動物 mRNA 的 5’端序列，歸納出在啟始密碼兩側序列多為（A/G）XXAUGG，其中，AUG 為啟始密碼，

X 表示任意的核苷酸(Kozak, 1981)。隨後又發表文章指出，對啟始密碼周圍的DNA 序列做點突變，會降低轉譯的效率(Kozak, 1986)。

1.7 EMCV IRES（Encephalomyocarditis virus internal ribosomal entry site）

真核細胞的轉譯方式有兩種，cap-dependent translation 及 cap- independent translation。在真核細胞中約有95％至97％的mRNA是藉由 cap-dependent translation 的方式進行轉譯 (Merrick, 2004) 。 cap-dependent translation是藉著帶有Met-tRNAⁱ^Met與initiation factor的40S subunit，與mRNA 的5’端cap結合後，順著mRNA移動至第一個AUG的位置，形成initiation complex，啟始蛋白質的轉譯(Kozak, 1989)。

在少部份的細胞mRNA及病毒則發現到cap-independent translation。在 HCV、retrovirus及屬於Picornaviridae家族成員之一的Encephalomyocarditis virus（EMCV），都被發現到具有internal ribosomal entry site（IRES）。IRES 是富含二級結構的序列，核醣體可以在缺少cap的狀況下，直接與含有IRES 序列的RNA結合，啟始蛋白質的轉譯。在含有IRES的病毒中，以poliovirus 及EMCV的IRES最常被應用在bicistronic的質體建構中(Hennecke et al., 2001)。

1.8 實驗設計

1.8.1 登革熱病毒的 cDNA clone

要了解登革熱二型病毒組裝訊號的位置，首先，需要得到整個病毒全長的cDNA clone。我們使用 Sriburi 等人的方法(Sriburi et al., 2001)，以 high copy number 載體，在抗生素濃度減半（25μg/ml）及低溫（25℃）的生長 狀況下，篩選具有登革熱二型病毒全長基因序列質體的 E. coli。為了分析得 到具有登革熱二型病毒全長基因序列的質體是否具有感染性，參考 Semler 的方法(Semler et al., 1984)，利用能夠被真核細胞啟始的病毒啟動子序列，

使細胞的 RNA 聚合酶合成病毒的 RNA 以產生病毒所需的蛋白。我們選擇含有CMV 啟動子的載體 pcDNA3，將登革熱病毒的基因序列轉殖至此質體上，期望能得到在哺乳動物細胞內可以進行轉錄並轉譯出病毒蛋白的質

體；將此質體轉染至 BHK-21 細胞中，測試得到的登革熱病毒基因序列是否具有感染性。

1.8.2 登革熱病毒組裝訊號的搜尋

關於登革熱二型病毒組裝訊號的搜尋，計畫先將登革熱二型病毒的基因序列分成兩段，結構性基因及非結構性基因部份。將含有報導基因及結構性基因或含有報導基因及非結構性基因的質體轉染至細胞，讓細胞合成出帶有報導基因及登革熱病毒基因（結構性或非結構性基因）序列的RNA，

同時，對細胞進行登革熱病毒的感染，產生登革熱病毒所需的蛋白。登革熱病毒進行組裝時，會將具有組裝訊號的RNA 進行包覆，產生病毒顆粒，

釋放至細胞外。將產生出的病毒收集後，感染新的 BHK-21 細胞，如果能在被感染的細胞內偵測到報導基因的表現，即可得知報導基因上帶有的登革熱病毒序列具有病毒組裝訊號。

考慮到病毒組裝訊號可能有相對位置關係的狀況，我們決定將報導基因設計在結構性基因下游，非結構性基因的上游，以符合結構性基因及非結構性基因在病毒genome 上的相對位置。報導基因選擇 lacZ，則是考慮到 偵測過程簡單，只需要進行 X-gal 染色，方便觀察。此外，為了避免 RNA 的長度干擾了病毒組裝RNA 的能力，在質體建構過程中，將含有結構性基因及報導基因的質體，在後方插入一段序列，稱之為Spacer DNA，以符合病毒 genome 的長度。根據 Proutski 等人推測，登革熱病毒的 5’及 3’UTR 序列可能具有病毒的組裝訊號(Proutski et al., 1997)，因此在含有報導基因及結構性或非結構性基因的兩端皆分別加入5’及 3’UTR 的序列。

初步實驗後發現，報導基因在 BHK-21 細胞中的表現狀況並不理想，

因此參考Kozak 等人的文章(Kozak, 1981)及 pcDNA3.1 手冊上的建議，在報導基因前方加入Kozak sequence，期望能使基因表現量增加。

此外整個實驗設計原本是採用 monocistronic 的方式，期望利用細胞內的酵素（signalase），將合成出來含有報導基因及結構性或非結構性基因的多肽鏈順利分割成報導基因所含的蛋白及結構性或非結構性蛋白，然而所

得到的結果並不理想。於是改而採用bicistronic 的方式，也就是經細胞轉譯出來的 RNA 含有報導基因及結構性基因或非結構性基因兩個轉譯讀框

（open reading frame，ORF），並在後方 ORF 的上游接上 EMCV IRES，以增加後方ORF 基因的表現量。

近代西方發現類似登革熱疫情至今，大約已有二百年左右。整個病毒的生活史，從病毒感染細胞後，RNA 的複製、病毒多肽鏈的合成及裂解、

各蛋白的功能及病毒組裝過程，都有程度不一的了解。然而登革熱病毒組裝時所需要的組裝訊號（packaging signal），至今仍然沒有任何文獻的探討。

究竟在病毒組裝過程中，如何區別病毒產生的 RNA 與細胞產生的 RNA，

以便將病毒的RNA 進行組裝，合成出具有感染性的病毒顆粒？這些訊號位於病毒RNA 的何處？為了瞭解登革熱二型病毒組裝訊號的位置，進行一連串的質體建構、報導基因的選擇及表現，期望能為整個實驗建立可行的基本架構。

貮、材料

2.1 菌株

Escherichia coli DH5α（Dr. Yang’s laboratory collection）

Escherichia coli TOP10（Invitrogen）

2.2 細胞株

BHK-21（幼倉鼠腎臟纖維母細胞，baby hamster kidney cell）

2.3 病毒

Dengue virus type 2 PL046 strain（Taiwan local strain）

2.4 質體

質體 特性 Reference

pBAG Retroviral vector 上含有 reporter gene，

β-galactosidase gene。請參照附錄一。 Yang’s lab.

pBluescriptⅡSK(+) 篩選標記為 Ampicillin，含有 lac 及 T7 啟

動子。請參照附錄二。 Stratagene

pcDNA3 篩選標記為 Ampicillin，含有 T7 及 CMV

啟動子。請參照附錄三。 Invitrogen pcDNA3-NCS pcDNA3 上的 MCS 以 pBluescriptⅡSK(+)

的MCS 置換。本研究

pcDNA3-NCS/

5’Z(YEP)3’UTR

pcDNA3-NCS 上帶有來源為 YEP363 且不含Kozak sequence 的 lac Z；lac Z 的上游帶 有PL046 strain 的 5’UTR ，下游帶有 PL046 strain 的 3’UTR。

本研究

pcDNA3-NCS/

5’KZ(YEP)3’UTR

pcDNA3-NCS 上帶有來源為 YEP363 且含有Kozak sequence 的 lac Z；lac Z 的上游帶

pcDNA3-NCS 上帶有來源為 pBAG 且含有 Kozak sequence 的 lac Z；lac Z 的上游帶有 PL046 strain 的 5’UTR ，下游帶有 PL046 strain 的 3’UTR。

本研究

pcDNA3-NCS/5’Z NS(MONO)3’UTR

pcDNA3-NCS 上帶有來源為 YEP363 且含有Kozak sequence 的 lac Z；lac Z 的上游帶

pcDNA3-NCS 上帶有來源為 pBAG 且含有 Kozak sequence 的 lac Z；lac Z 的上游帶有 PL046 strain 的 5’UTR ，下游帶有 IRES、

PL046 strain 的非結構性基因及 3’UTR。lac Z 與非結構性基因分別使用各自的 ORF。

本研究

pcDNA3-NCS/5’S ZSp3’UTR

pcDNA3-NCS 上帶有來源為 pBAG 且含有 Kozak sequence 的 lac Z；lac Z 的上游帶有 PL046 strain 的 5’UTR 及結構性基因，下游帶有 Spacer DNA 及 PL046 strain 的

pcDNA3-NCS 上帶有來源為 pBAG 且含有 Kozak sequence 的 lac Z；lac Z 的上游帶有 PL046 strain 的 5’UTR、結構性基因及

本研究

EMCV IRES，下游帶有 Spacer DNA 及 PL046 strain 的 3’UTR。結構性基因與 lac Z 分別使用各自的ORF。

pcDNA3-NCS/

DV2F

pcDNA3-NCS 上帶有 PL046 strain 全長的

基因序列。本研究

pCR-XL-TOPO 篩選標記為Kanamycin 及 Zeocin，並含 lac

啟動子。請參照附錄四。 Invitrogen pCR-XL-TOPO/

DV2F

pCR-XL-TOPO 上帶有 PL046 strain 全長的

基因序列。 Invitrogen

pGEM-T 篩選標記為Ampicillin，含有 T7 及 SP6 啟

動子。請參照附錄五。 Promega

pGS-EMCV 篩選標記為Ampicillin，含有 CMV 啟動子及EMCV IRES。 (Lee et al., 2005)

中原大學吳宗遠老師實驗室

YEP363 篩選標記為 Ampicillin ，含有 β

-galactosidase gene。請參照附錄六。 Yang’s lab.

2.5 引子

2.5.1 針對質體建構及 RT-PCR 所使用的引子

引子序列5’~3’ 位置

YlacF CCCAAGCTTATG{CCCGCCGTCG TTTTACAAC}

lacZ(V00296；NCBI) gene: +19 ~ +37

引子序列5’~3’ 位置

在文檔中探討登革熱二型病毒PL046之質體建構及報導基因的選擇 (頁 16-0)