聚合酶鏈反應

3.2 反轉錄及聚合酶鏈反應

3.2.2 聚合酶鏈反應

合成登革熱全長cDNA片段的PCR過程是使用Taq DNA Polymerase XL

（Protech，Cat.P6a），其餘的則是使用TaKaRa Ex Taq^TM（Cat. RR001A）。

合成溫度（Extension time）則依照使用說明書設定，Taq XL為 68℃，Ex Taq 為72℃。PCR反應的總體積為 50μl，內含 2μl的cDNA或 100 至 500 ng的模板，5μl的 10 倍酵素緩衝液，各 10 至 50 pmole的引子對，10μmole的 dNTP，2.5 U聚合酶。溫度設定：A. 94℃，時間 3 分鐘；B. 94℃，時間 30 秒；C. Annealing temperature，時間 1 分鐘；D. 68℃ （或 72℃），時間依合成出的DNA片段長度而定，原則上合成 1 kb的DNA需要 1 分鐘的時間；E. 68

℃（或 72℃），時間依合成出的DNA片段長度而定。其中，B、C、D重覆 30 次循環。其中Annealing temperature的設定依照計算出來的Tm值下降 2 至5℃。

3.3 以電穿孔法進行大腸桿菌勝任細胞（ competent cell ）的轉形

（transformation）

3.3.1 大腸桿菌勝任細胞的製備（電穿孔法）

挑選大腸桿菌單一菌落於5 ml 的 L-broth、37℃震盪培養隔夜後，將其轉養至500 ml 的 L-broth，37℃震盪培養，當菌液在波長 600 nm 的吸光值約0.5-0.7 時，靜置於冰上 20 分鐘。利用落地型高速離心機（BECKMAN）

以4000 g 轉速在 4 ℃離心 15 分鐘後去除上清液。加入 500 ml 預冷至 4℃

的 10％甘油重新懸浮菌體，以 4000 g 轉速在 4℃離心 15 分鐘後去除上清液。加入250 ml 預冷至 4℃的 10％甘油重新懸浮菌體，以 4000g 轉速在 4

℃離心15 分鐘後去除上清液。加入 20 ml 預冷至 4℃的 10％甘油重新懸浮菌體，以4000g 轉速在 4℃離心 15 分鐘後去除上清液。最後，加入等體積 10％甘油重新懸浮菌體，以每管 50μl 體積分裝，儲存於–80℃。

3.3.2 勝任細胞的轉形（電穿孔法）

含登革熱二型病毒基因序列的質體在轉形的過程是以 25℃、抗生素濃度為 25μg/ml 培養 24~48 小時；不含登革熱二型病毒基因序列則是以 37

℃、抗生素濃度為50μg/ml 培養 12~18 小時。

將儲存於–80℃的勝任細胞取出置於冰上解凍，然後加入質體 DNA 約 0.01~0.05 ng，混合均勻，冰浴 1 分鐘。轉置至預冷至 0℃的 0.2 cm 電極管

（Electroporation cuvette）中，置入電穿孔器中（Bio-Rad，Cat. 165-2100），

以2.5 KV、5 毫秒對勝任細胞進行電擊。電擊結束後，立即加入 SOC 培養液1 ml，混合均勻。將混合物轉移至離心管內，置於 37℃（或是 25℃）震盪培養1 小時（或是 1.5 小時）。取 50μl 塗抹至抗生素濃度為 50μg/ml（或是 25μg/ml）的 LB 固體培養基上。置於 37℃培養箱中 12~18 小時（或是 24~48 小時）。

3.4 質體 DNA 之萃取

3.4.1 小量質體之萃取

在質體建構時所使用的質體DNA是以ExcelPure^TMPlasmid Miniprep Purification Kit（Cat. N-PM050）萃取。將單一大腸桿菌菌落培養於 5 ml的 LB培養液，抗生素濃度為 50μg/ml （含登革熱二型病毒基因序列的質體使用的抗生素濃度為25μg/ml），培養於 37℃（或 25℃），12 至 16 小時（或 24~48 小時）後，以Miniprep Purification Kit進行質體萃取。萃取過程依照產品內附說明書操作。操作過程如下：首先，將菌液以轉速2500 rpm離心 12 分鐘，去除上清液；加入 200μl的solution I，以震盪器混合均勻；加入 200μl的solutionⅡ，小心混合均勻；加入 200μl的solutionⅢ，小心混合均勻；利用微量離心機在室溫以轉速13000 rpm離心 5 分鐘，將上清液轉置至 spin column；利用微量離心機在室溫以轉速 13000 rpm離心 1 分鐘，去除濾液；加入700μl的washing buffer，利用微量離心機在室溫以轉速 13000 rpm 離心 1 分鐘，去除濾液，將此步驟重覆一次；利用微量離心機在室溫以轉速13000 rpm離心 3 分鐘，將spin column移至新的微量離心管，置於 60℃加熱 5 分鐘；加入適量的TE溶液，利用微量離心機在室溫以轉速 13000 rpm 離心1 分鐘，所得到的溶液內含質體DNA，將溶液儲存於–20℃。

3.4.2 大量質體萃取

在進行轉染時所使用的質體DNA 是以 QIAGEN Plasmid Midi Kit（Cat.

12143）萃取，萃取過程依照產品內附說明書操作，各緩衝液的成份請參照附錄八。操作過程如下：將單一大腸桿菌菌落培養於5 ml 的 LB 培養液，

抗生素濃度為50μg/ml （含登革熱二型病毒基因序列的質體使用的抗生素濃度為25μg/ml），培養於 37℃（或 25℃）8 小時（或 16~24 小時）後，轉養至25 ml 的 LB 培養液，培養於 37℃（或 25℃）12 至 16 小時（或 24~48 小時）。將菌液轉移至離心管，利用落地型高速離心機（BECKMAN）以轉速6000 g 在 4℃離心 15 分鐘，去上清液；加 4 ml 的 Buffer P1，以震盪器

混合均勻；加入4 ml 的 Buffer P2，小心混合均勻，靜置室溫 5 分鐘；加入 Buffer P3，並混合均勻，插入冰中靜置 15 分鐘；利用落地型高速離心機以轉速20000 g 在 4℃離心 30 分鐘，將上清液轉移至新的離心管，再以轉速 20000 g 在 4℃離心 15 分鐘，在離心的同時，取 Qiagen-tip 並加入 4 ml 的 Buffer QBT，利重力使加入的溶液自底端流出；離心完成時，將上清液轉移至經過Buffer QBT 作用後的 Qiagen-tip；等溶液完全流出後，以二次 10 ml 的Buffer QC 清洗 Qiagen-tip；等溶液完全流出後，加入 5 ml 的 Buffer QF，

收集流出的溶液至離心管，在溶液中加入3.5 ml 的 2-propanol，混合均勻，

利用落地型高速離心機以轉速15000 g 的轉速離心 30 分鐘，去除上清液；

加入2 ml 的 70％酒精，並將溶液轉移至微量離心管；利用微量離心機以轉速13000 rpm 在 4℃離心 10 分鐘，去除上清液，置於室溫風乾 5 分鐘，加入適量體積的0.1 × TE，溶解質體 DNA，並以分光光度計測量濃度及純度。

所得的質體儲存於–20℃。

3.5 限制酵素反應

為製備實驗所需之 DNA 片段，取適量的 DNA （約 0.5~10μg）至適量反應體積（20 至 50μl），以限制酵素進行作用，原則上 1 μg 的 DNA 是以2 U 的酵素在適當的溫度作用 2 小時至 3 小時；反應完成後，置於適當溫度加熱以終止反應。反應的溫度、終止反應溫度及緩衝液的濃度則依照酵素內附之說明書設定。利用洋菜膠體電泳分析。依實驗所需，直接進行脫鹽去蛋白或從洋菜膠體回收DNA 片段。

3.6 Klenow fill-in

取適量的DNA （約 5μg），以 Klenow enzyme 將 DNA 被限制酶作用的切位補成平端，反應體積為50μl。原則上 1μg 的 DNA 以 1 U 的 Klenow enzyme 在 25℃作用 15 分鐘。反應完成，加入 1μl 的 0.5M EDTA 至反應溶液中，置於75℃加熱 20 分鐘終止反應。實驗步驟依照內附說明書操作。反應完成後依實驗所需，直接進行脫鹽去蛋白或從洋菜膠體回收DNA 片段。

3.7 去磷酸反應

DNA 的去磷酸反應是利用 SAP （ Shrimp Alkaline Phosphatase ， Promega，Cat. M8201）進行。實驗步驟依照內附說明書操作，原則上 1μg 的DNA 是以 1 U 的酵素進行反應；反應溫度 37℃，時間 15 分鐘。反應完成後，75℃加熱 20 分鐘終止反應。直接進行電泳並萃取洋菜膠內之 DNA。

3.8 萃取洋菜膠內之 DNA 片段

使用Gel Extraction Kit（PREMIER）萃取出洋菜膠內之 DNA 片段。萃取過程依照產品內附說明書操作。操作過程如下：將切下之洋菜膠（約 50 至150 mg），置於微量離心管內，加入 500μl 的 Binding solution，以 60℃

加熱至洋菜膠完全溶解後，將溶液轉移至spin column，利用微量離心機以轉速 13000 rpm 在室溫離心 1 分鐘，去除濾液；加入 700μl 的 Washing solution，利用微量離心機以轉速 13000 rpm 在室溫離心 1 分鐘，去除濾液，

將此步驟重覆一次；利用微量離心機以轉速13000 rpm 在室溫離心 3 分鐘；

將 spin column 移至新的微量離心管，置於 60℃加熱 5 分鐘；加入適量的 TE 溶液，利用微量離心機以轉速 13000 rpm 在室溫離心 1 分鐘，所得到的溶液內含欲萃取之DNA，將溶液儲存於–20℃。

3.9 接合反應

總體積為10μl，內含 1 倍緩衝液、5 U 的接合酶（T4 DNA Ligase，

Fermentas，Cat. EL0014）、50 ng 的 vector 及適量的 insert（vector 與 insert 的分子數比約1：3），靜置 14℃約 16 小時，於 65℃去活化 10 分鐘，儲存於–20℃或直接進行大腸桿菌勝任細胞的轉形。

3.10 細胞繼代培養及轉染

3.10.1 BHK-21 細胞繼代培養

吸除培養液，以PBS沖洗兩次，加入 1 ml的TrypLE^TMExpress（Gibco，

Cat. 12605-010），置於室溫下約 2 分鐘，加入適量的培養液輕沖底盤使細胞脫落，置於15 ml離心管中，以 2000 rpm離心 5 分鐘。去除上清液，加入適量血清培養液混合均勻後，取適量細胞轉移至新的培養皿中。

3.10.2 轉染

轉染前一日先於3.5 公分培養皿置入約 3 x 10⁵的BHK-21 細胞。轉染前1 至 4 小時置換 2 毫升新鮮培養液。取一微量離心管加入 25μl的 2.5M 氯化鈣溶液及4μg的質體DNA，以二次水將體積補至 250μl；另在 7 毫升離心管內置入250μl的 2 × HeBS，取內含HeBS的離心管以約 2000 rpm轉速持續震盪，同時緩慢加入含DNA的氯化鈣溶液。靜置室溫 20 分鐘，加入 BHK-21 細胞中，將細胞置於 37℃、5％二氧化碳的狀態。16 個小時後，以 PBS沖洗細胞兩次，加入 2 毫升新鮮的培養液，置入培養箱中培養。在轉染 48 小時後，取出細胞，依實驗需要進行X-gal staining或空斑試驗。

3.11 X-gal staining

吸除培養液，加入 1 毫升 0.5﹪glutaraldehyde，靜置室溫 15 分鐘，吸除glutaraldehyde，以 PBS 沖洗三次後，加入 X-gal 染液，置於 37℃中 2~16 小時，置於顯微鏡下觀察並計數藍色細胞的數目。

3.12 空斑試驗（Plaque assay）

進行空斑試驗的前一天先在六孔培養盤中置入 5 × 10⁵ 的細胞，置於培養箱中培養。隔日，細胞約九成滿時，將病毒進行序列稀釋，稀釋液為未含血清的培養液。序列稀釋完成後，取出前一日培養的細胞，加入 500 μl序列稀釋的病毒溶液，置於培養箱中 2 小時進行感染，每半個小時輕晃培養盤。最後加入4 毫升的 1.1﹪methyl cellulose，置入培養箱中培養五至七天後，取出細胞，吸除培養液，加入適量3.7％甲醛以固定細胞，置於室溫15 分鐘，吸除甲醛，加入適量結晶紫溶液染色，置於室溫 2 小時，以清水沖洗培養盤。置於室溫風乾後，計數空斑的數目並觀察形狀。

肆、結果

4.1 登革熱二型病毒感染性質體建構及表現

4.1.1 pcDNA3-NCS 質體建構

由於pcDNA3 上的 MCS（Multiple cloning site）並不能滿足質體建構的需求，故將 pBluescriptⅡSK(+)上的 MCS 轉置至 pcDNA3 上。將質體 pBluescriptⅡSK(+)以限制酶 HincⅡ（blunt end）及 Xba I 進行作用，所得到 53bp 之 DNA（pBluescriptⅡ之 MCS）當作殖入片段（insert）；利用限制酶 Hin dⅢ對質體 pcDNA3 進行切割，再以 Klenow enzyme 對切位進行修飾，

形成平端（blunt end），之後以 Xba I 進行切割。將殖入片段與經限制酵素作用的 pcDNA3 進行接合，經選殖得到的質體命名為 pcDNA3-NCS，如圖 一所示。此質體以 BamH I 及 Stu I 作用後得到 4.3 及 1.1kb 之 DNA 片段；

以 Cla I 及 Fsp I 作用後，得到 2.4、1.6 及 1.4kb 之 DNA 片段；以 HindⅢ及 Nde I 作用後，得到 5.0 及 0.4kb 之 DNA 片段；以 Nco I 及 Xba I 作用後，

得到3.3、1.0、0.7 及 0.3kb 之 DNA 片段；此外尚有額外的 band 標示為 z。

限制酵素作用位置圖及電泳圖請參照圖二十三。

4.1.2 RT-PCR

萃取病毒 RNA，以 D2F0001A’及 D2R10723A 當引子，引入限制酵素 Cla I、Xba I 之切位分別於 PCR 產物之 5’端及 3’端，利用 RT-PCR 方式得到 含病毒全部基因序列的DNA （nt 1 ~ nt 10723），預期得到全長約為 10.7kb 的 DNA 片段。取 5μl 的 RT-PCR 產物進行電泳分析。共得到三條主要的 DNA 片段，分別位於 10、3.5 及 1.5kb 的位置，另有不明顯者位於 4kb 的位置，結果請參照圖二十四。

4.1.3 TA cloning

直接利用TA cloning 方式將 DNA 片段接入 pCR-XL-TOPO 的載體上，

命名為 pCR-XL-TOPO/DV2F ，如圖二所示。經過酵素作用後，初步判定總共得到五個含有登革熱病毒全長cDNA 的質體，分別命名為 P、Q、R、S、

T。pCR-XL-TOPO/DV2F 經 BamH I 及 EcoR V 作用後，得到 5.0、3.5、2.1、

在文檔中探討登革熱二型病毒PL046之質體建構及報導基因的選擇 (頁 34-0)