PPD 為硝基苯胺 (paranitroaniline) 的衍生物；為一常使用於染髮 劑、刺青染料的化學物質，其氧化能力能使毛髮脫色以利染劑附著 於毛髮上；此外，也可用在光化學實驗以及催化硫化反應上 (Singla and Miglani, 2005)。
然而，儘管對苯二胺的使用為生活帶來了些許便利性，其毒性對
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於人體的傷害卻不小，接觸對苯二胺的使用者常出現接觸性皮膚 炎、結膜水腫、流淚、更甚者，當接觸到眼球時會產生永久性失明。
若不慎誤食到對苯二胺時，會引發嚴重的喉部、臉部、咽部、舌 頭浮腫，並進而引發呼吸道窘迫，嚴重者須以氣管插管術治療之。
除此之外，某些流行病學報告(Thun et al., 1994)亦指出:對苯二胺 的使用會促使膀胱組織受損 (Sontag, 1981)；足以證明對苯二胺對 於膀胱的危害性不容小覷。
然而，對苯二胺對於膀胱基本排尿功能的損傷機制仍未釐清，有 待進一步深入探究。
六、活性氧(Reactive Oxygen Speices，簡稱 ROS)之生成機 制與其損害
地表上的生物體大部分都需要氧賴以維生，而當氧代謝後即產生 活性氧。活性氧為眾多含氧化學物質的統稱，為生物體內代謝氧後 所產生的衍生物，與細胞的訊息傳遞以及維持生物體內的恆定有密 切關係；其種類包含有:
生命週期短的可擴散性物質如: 羥類 (-OH)，烷氧類 (RO-) 或者 是過氧化基 (ROO-) 等自由基
生命週期中等的自由基如:超氧化物 (O-2) 或者是硝基 (NO-) 等 自由基。
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不屬於自由基類別者如:過氧化氫 (H2O2) 、 有 機 過 氧化氫 類 (ROOH)、以及次氯酸類 (HOCl) 等。
而在生物體內，發炎反應相關細胞會產生活性氧 (Simon and Haj-Yehia, 2000)，而活性氧本身具有破壞 DNA 以及蛋白質的能 力，也因此，當活性氧的濃度正常時，活性氧具有抵禦入侵細菌 的能力。然而，當活性氧濃度因為外在環境因素(如紫外線、高溫) 而變的過高時，會進而導致不正常的訊息傳遞、細胞失去正常功 能、發炎相關細胞(例:單核球或巨噬細胞)進入組織甚至誘發細胞 凋 亡 (apoptosis) 、細 胞自 噬 (autophagy) 或 者 發炎 性細胞死亡 (pyroptosis)等途徑而對生物體造成損害。
七、細胞凋亡 (apoptosis) 細胞自噬 (autophagy) 發炎性
細胞死亡 (pyroptosis)當粒線體中或者其他胞器中的 ROS 含量過高時，會藉由啟動凋 亡蛋白酶 (caspases)、 溶體蛋白水解酶 (lysosomal proteases) 或者 是核酸內切酶 (endonucleases) 之功能而誘發三種類型的計畫性細 胞死亡:細胞凋亡，細胞自噬或者發炎性細胞死亡。
從受損的粒線體中釋放出的 ROS (如: O2-.
以及 H2O2) 經由將粒 線體中的 cytochrome C 釋放至細胞質從而增加 caspase 3 之活性以
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及截切 Poly ADP-ribose polymerase (簡稱 PARP) 使其作用以誘發 細胞凋亡進行 (Yeh and Chiang, 2011) ；另一方面，過量之 ROS 亦 會活化 Beclin-1, LC3-II 以及 ATG5-ATG12 等蛋白之表現進而誘發 細胞自噬作用(Chien and Shyue, 2007)。
而另一種不同於細胞凋亡之計劃性細胞死亡-發炎性細胞死亡則 是會在氧化壓力升高以及發炎之時藉由活化發炎相關之介白素 (如:IL-1ß 或者 IL-18) 產生，並進一步使組織受損 (Miao and Rajan, 2011)。
八、活性氧所誘使之膀胱過動症
數種膀胱疾病如膀胱出口梗阻 (Bladder outlet obstruction, BOO)
、缺血、發炎，皆可能肇因於 ROS 的形成所導致 (Parekh and Lobel, 2001; Lin et al., 2005)；近年來亦有許多研究顯示:發炎性細胞所釋 放之 ROS 會導致膀胱壓力過高的情況，有些證據更進一步指出:過 多 ROS 的 釋 放 會 影 響 膀 胱 逼 尿 肌 上 的 蕈 鹼 受 器 (muscarinic receptor) 訊息傳遞途徑，並使膀胱逼尿肌的收縮產生異常，此發現 也代表著膀胱逼尿肌上的平滑肌構造對於 ROS 的產生相當敏感。
為了探查 ROS 誘發逼尿肌過動情形之詳細機制，前人進行研究 得到結果顯示:當將 H2O2施打入動物體內時，H2O2所產生的氧化壓 力會活化辣椒素 (capsaicin) 敏感性之 C 纖維傳入途徑，從而引發
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膀胱逼尿肌產生過動症狀(Masuda and Kihara, 2007)。
九、含鎳超氧化歧化酶 (Ni-superoxide dismutases,Ni-SOD) 之特性與其對於受損膀胱的治療效果
為了保護生物體免於遭受活性氧的傷害，細胞本身具有超氧化歧 化酶 (SOD)；歧化作用本身即代表著在分開的兩個分子上，產生相同 卻反應方向相反之兩個反應，而 SOD 可抓住兩個超氧化物陰離子 (superoxide anion)，將其中一個超氧化物的多餘電子剝離並交給另一 個超氧化物，因此，SOD 可將毒性高的含氧自由基催化反應成毒性 較低的過氧化氫 (H2O2) 以及氧 (O2)；通常，SOD 多存在於粒線體 與細胞質中， 已知有以金屬銅 (Cu)、錳 (Mn)、鐵 (Fe) 以及鋅 (Zn) 作為輔酶 (coenzyme) 等不同種類的 SOD。而近年來，新發現的是與 鎳 (Ni) 結合出現的 Ni-SOD ( Goodsell et al., 2007) 。
( Goodsell et al.,2007) 各種 SOD 結構比較示意圖
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實驗動機與目的
PPD 的使用在現今社會十分廣泛，而美髮從業人員以及染髮的廣大
民眾皆有可能受到 PPD 的影響。但截至目前，尚無相關文獻報導有 關 PPD 造成膀胱功能失調之資料與動物模式。
因此，本研究希望能夠釐清 1)PPD 的使用對於誘發膀胱過動症以及 膀胱發炎的病理生理機轉，並 2)評估新開發藥 Ni-SOD 對於治療膀胱 過動症與發炎的可能性。
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材料與方法 一、 實驗動物的照護準備
在實驗動物的選擇上，本人所使用的實驗動物乃是購自樂斯科生技 股份有限公司 (BioLasco Taiwan Co.,Ltd) 週齡九至十二週，體重介於 250 至 300 公克重、飼養於溫度濕度穩定以及光週期固定環境 (上午 六點至下午六點供應光源)之 Wistar 品系雌鼠。雌鼠的選用，可以避 免雄性生殖器官在實驗進行中對於膀胱的觀察造成干擾。此外，所有 實驗動物之飼養照護條件均遵照國 立 台 灣 師 範 大 學 實 驗 動物倫理 委員會之法規。
二、插管手術
在實驗進行初期，本人選用胺基鉀酸酯 (urethane, Sigma, St. Louis, MO, USA) 作為麻醉實驗動物之麻醉劑，urethane 之劑量為 1.2 g/kg。
首先，我們將 urethane 分三次施打於腹腔，大腿肌肉，頸部皮下等處，
以避免過快的麻醉劑注射對於動物體造成負擔以及影響膀胱正常收 縮功能。在麻醉完成後，使用大小為 240 之 PE 管進行氣管插管，以 利麻醉狀態下的動物保持順暢呼吸。在氣管插管完成後，我們利用大 小為 50 的 PE 管插入股動脈或者頸動脈進行血壓量測，PE 管會先以 肝素 (heparin,Sigma, St. Louis, MO, USA) 沖洗過以避免血液凝集造
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成血壓量測不準確；在動靜脈的插管完成之後，則會進行開腹腔手 術；膀胱露出之後，將頂端剪開一小開口插入大小為 50 的 PE 管再以 棉繩綁縛避免漏水，而 PE 管則銜接上自動打水器 (infusion pump)；
以每分鐘 0.04 mL 的固定流速施打生理食鹽水進入膀胱；再使用三向 閥接上壓力轉換器 (pressure transducer) 以量得膀胱壓力值。
膀胱頂部插管示意圖
(Sutherland et al., 1997) 三、儀器設備
1.微量天平 (Mettler, PJ100C-T, Greifiensee-Zurich, Switzerland):實驗
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中用以秤量藥物、試劑之重量，可精確至公克以下小數點四位。
2.分光光度計 (Spectrophotometer, V-630, JASCO, USA):實驗中用來 測定檢體中蛋白質之濃度及酵素活性測定。
3.生理記錄儀 (MacLab/PowerLab, ADInstruments, USA):將多項記錄 器中之數據轉移到電腦上。
4. 化 學 冷 光 分 析 儀 (Chemiluminescence analyzing system, CLD-110&CLA-ID3, Tohoku Electronic Industrial Co., Sendai, Japan) : 實驗中用來測定活體及離體自由基的含量。
5.離心機 (Centrifuge, 5804R, Eppendorf, German) :實驗中用來分離組 織研磨後的檢體及血液。
7.石蠟切片機 (Paraffin microtome, RM 2125 RTS, LEICA, German) : 將已包埋好的蠟塊檢體切成所需的厚度，供後續染色以進行研究觀 察。
8.顯微鏡(microscope, DM 750, LEICA, German):透過目鏡與物鏡的高 倍率將組織的表現情況放大觀察
9.照相系統(camera system, SG-130, SHENG-CHUAN, Taiwan):將從顯 微鏡中看到的影像拍攝下來並後製加上尺規
四、實驗藥品與來源
1. 胺基鉀酸酯 (urethane, Sigma, St. Louis, MO, USA):為麻醉劑，使用
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劑量為每公斤 1.2 公克。
2. 肝素 (heparin;Sigma, St. Louis, MO, USA):用於動脈插管時預防血 液凝固而阻塞血管。
3. 0.9% NaCl (0.9% 生理食鹽水) 用以配置藥品與補充動物體液。
4. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate ; Sigma, St. Louis, MO, USA ):實驗中用以偵測血液及尿液離體自由基的冷光劑。
5. Luminol (5-amino-2, 3-dihydro-1,4-phthalazinedione ; Sigma, St.
Louis, MO, USA ) :實驗中用以偵測血液及尿液離體自由基的冷光劑。
6. 對苯二胺(p-Phenylenediamine, Sigma, St. Louis, MO, USA):作為 染髮劑中的脫色劑，於本文中被施用於實驗動物體內以觀察膀胱受 損程度。
五、實驗流程
實驗動物分組:本次實驗將 Wistar rats 分為四組，每組各為五 隻，分別是:(一) 控制組， (二) 腹腔注射 PPD 一個月，(三) 腹腔注射 PPD 一個月後使用抗氧化劑 WCT 003 (1.5 mg/kg) 腹腔注射兩週，以及 (四) 腹腔注射 PPD 一個月後使用抗氧 化劑 WCT 006 (1.5 mg/kg)腹腔注射兩週
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以及壓力感測器 (transducer)。自動打水器以 0.04 mL/min 的固定流速 將生理食鹽水注射入膀胱中，再以 PowerLab 觀測膀胱壓力值。
八、血液以及尿液自由基數量的量測
為了更進一步確認對苯二胺 (p-Phenylenediamine, Sigma, St. Louis, MO, USA) 對於動物體內代謝造成的影響，我們會抽取動物體內的血 液 以 及 收 取 尿 液 並 利 用 化 學 冷 光 分 析 儀 (Chemiluminescence analyzing system, CLD-110, Tohoku Electronic Industrial Co., Sendai, Japan)偵測血液以及尿液中自由基的含量；於每次試驗中，將 200 μL 之樣本加入冷光分析儀之孔盤後，先施測 60 秒以取得基準線，而基 準線之 CL counts 通常落於 500~700；取得基準線後，在第 60 秒時滴 加入 500 μL 之 luminol(5-amino-2, 3-dihydro-1,4-phthalazinedione ; Sigma, St. Louis, MO, USA ) 或 者 500 μL 之 lucigenin(bis-N-methylacridinium nitrate ; Sigma, St. Louis, MO, USA )；lucigenin 可作為專門偵測超氧陰離子氧化物的化學冷光指示 劑 ( Pascual et al., 2006)；而 luminol 又名發光氨，可作為偵測 H2O2
以及 HOCl 等物質在樣本中數量的化學冷光指示劑，以上兩種試劑可 作為判定樣本中自由基含量之用。
九、活體自由基數量測量
動物如前述插完膀胱插管以及動靜脈插管之後，將整隻動物置入化學 冷光分析儀 (Chemiluminescence analyzing system, CLA-ID3 , Tohoku
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Electronic Industrial Co., Sendai, Japan) 中進行整隻活體動物之自由 基含量量測。而在自由基含量降至穩定數值之後，即從膀胱插管之
PE 管 以 固 定 流 速 施 打
2-Methyl-6-(4-methoxyphenyl)-3,7-dihydroimidazo- [1,2-a]-pyrazin- 3-one-hydrochloride (MCLA) (0.02 mL/min)，做為偵測動物體內超陰離 子氧化物自由基含量之用(Lin et al., 2009)。
十、病理切片染色
在實驗動物完成紀錄之後，施打過量之 urethane 進入心臟進行犧 牲，於犧牲後收取動物之膀胱檢體進行後續實驗觀察。取下的膀胱會 截切四分之一塊送交台北病理中心 (Taipei Institute of Pathology, Taipei, Taiwan) 進行石蠟包埋以供切片染色觀察之用，剩餘之四分之 三部分冰存入攝氏零下八十度以供後續作西方墨點法。
交回之臘塊會先以石臘切片機 (RM 2125 RTS, LEICA, German) 切 成 0.2 μm 之厚度並貼於透明玻片上風乾一日以利後續染色作業。
染色初步會先將玻片置於烘箱並設定攝氏六十度烘烤十五分鐘以
染色初步會先將玻片置於烘箱並設定攝氏六十度烘烤十五分鐘以