數種膀胱疾病如膀胱出口梗阻 (Bladder outlet obstruction, BOO)
、缺血、發炎，皆可能肇因於 ROS 的形成所導致 (Parekh and Lobel, 2001; Lin et al., 2005)；近年來亦有許多研究顯示:發炎性細胞所釋 放之 ROS 會導致膀胱壓力過高的情況，有些證據更進一步指出:過 多 ROS 的 釋 放 會 影 響 膀 胱 逼 尿 肌 上 的 蕈 鹼 受 器 (muscarinic receptor) 訊息傳遞途徑，並使膀胱逼尿肌的收縮產生異常，此發現 也代表著膀胱逼尿肌上的平滑肌構造對於 ROS 的產生相當敏感。
為了探查 ROS 誘發逼尿肌過動情形之詳細機制，前人進行研究 得到結果顯示:當將 H2O2施打入動物體內時，H2O2所產生的氧化壓 力會活化辣椒素 (capsaicin) 敏感性之 C 纖維傳入途徑，從而引發
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膀胱逼尿肌產生過動症狀(Masuda and Kihara, 2007)。
九、含鎳超氧化歧化酶 (Ni-superoxide dismutases,Ni-SOD) 之特性與其對於受損膀胱的治療效果
為了保護生物體免於遭受活性氧的傷害，細胞本身具有超氧化歧 化酶 (SOD)；歧化作用本身即代表著在分開的兩個分子上，產生相同 卻反應方向相反之兩個反應，而 SOD 可抓住兩個超氧化物陰離子 (superoxide anion)，將其中一個超氧化物的多餘電子剝離並交給另一 個超氧化物，因此，SOD 可將毒性高的含氧自由基催化反應成毒性 較低的過氧化氫 (H2O2) 以及氧 (O2)；通常，SOD 多存在於粒線體 與細胞質中， 已知有以金屬銅 (Cu)、錳 (Mn)、鐵 (Fe) 以及鋅 (Zn) 作為輔酶 (coenzyme) 等不同種類的 SOD。而近年來，新發現的是與 鎳 (Ni) 結合出現的 Ni-SOD ( Goodsell et al., 2007) 。
( Goodsell et al.,2007) 各種 SOD 結構比較示意圖
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實驗動機與目的
PPD 的使用在現今社會十分廣泛，而美髮從業人員以及染髮的廣大
民眾皆有可能受到 PPD 的影響。但截至目前，尚無相關文獻報導有 關 PPD 造成膀胱功能失調之資料與動物模式。
因此，本研究希望能夠釐清 1)PPD 的使用對於誘發膀胱過動症以及 膀胱發炎的病理生理機轉，並 2)評估新開發藥 Ni-SOD 對於治療膀胱 過動症與發炎的可能性。
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材料與方法 一、 實驗動物的照護準備
在實驗動物的選擇上，本人所使用的實驗動物乃是購自樂斯科生技 股份有限公司 (BioLasco Taiwan Co.,Ltd) 週齡九至十二週，體重介於 250 至 300 公克重、飼養於溫度濕度穩定以及光週期固定環境 (上午 六點至下午六點供應光源)之 Wistar 品系雌鼠。雌鼠的選用，可以避 免雄性生殖器官在實驗進行中對於膀胱的觀察造成干擾。此外，所有 實驗動物之飼養照護條件均遵照國 立 台 灣 師 範 大 學 實 驗 動物倫理 委員會之法規。
二、插管手術
在實驗進行初期，本人選用胺基鉀酸酯 (urethane, Sigma, St. Louis, MO, USA) 作為麻醉實驗動物之麻醉劑，urethane 之劑量為 1.2 g/kg。
首先，我們將 urethane 分三次施打於腹腔，大腿肌肉，頸部皮下等處，
以避免過快的麻醉劑注射對於動物體造成負擔以及影響膀胱正常收 縮功能。在麻醉完成後，使用大小為 240 之 PE 管進行氣管插管，以 利麻醉狀態下的動物保持順暢呼吸。在氣管插管完成後，我們利用大 小為 50 的 PE 管插入股動脈或者頸動脈進行血壓量測，PE 管會先以 肝素 (heparin,Sigma, St. Louis, MO, USA) 沖洗過以避免血液凝集造
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成血壓量測不準確；在動靜脈的插管完成之後，則會進行開腹腔手 術；膀胱露出之後，將頂端剪開一小開口插入大小為 50 的 PE 管再以 棉繩綁縛避免漏水，而 PE 管則銜接上自動打水器 (infusion pump)；
以每分鐘 0.04 mL 的固定流速施打生理食鹽水進入膀胱；再使用三向 閥接上壓力轉換器 (pressure transducer) 以量得膀胱壓力值。
膀胱頂部插管示意圖
(Sutherland et al., 1997) 三、儀器設備
1.微量天平 (Mettler, PJ100C-T, Greifiensee-Zurich, Switzerland):實驗
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中用以秤量藥物、試劑之重量，可精確至公克以下小數點四位。
2.分光光度計 (Spectrophotometer, V-630, JASCO, USA):實驗中用來 測定檢體中蛋白質之濃度及酵素活性測定。
3.生理記錄儀 (MacLab/PowerLab, ADInstruments, USA):將多項記錄 器中之數據轉移到電腦上。
4. 化 學 冷 光 分 析 儀 (Chemiluminescence analyzing system, CLD-110&CLA-ID3, Tohoku Electronic Industrial Co., Sendai, Japan) : 實驗中用來測定活體及離體自由基的含量。
5.離心機 (Centrifuge, 5804R, Eppendorf, German) :實驗中用來分離組 織研磨後的檢體及血液。
7.石蠟切片機 (Paraffin microtome, RM 2125 RTS, LEICA, German) : 將已包埋好的蠟塊檢體切成所需的厚度，供後續染色以進行研究觀 察。
8.顯微鏡(microscope, DM 750, LEICA, German):透過目鏡與物鏡的高 倍率將組織的表現情況放大觀察
9.照相系統(camera system, SG-130, SHENG-CHUAN, Taiwan):將從顯 微鏡中看到的影像拍攝下來並後製加上尺規
四、實驗藥品與來源
1. 胺基鉀酸酯 (urethane, Sigma, St. Louis, MO, USA):為麻醉劑，使用
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劑量為每公斤 1.2 公克。
2. 肝素 (heparin;Sigma, St. Louis, MO, USA):用於動脈插管時預防血 液凝固而阻塞血管。
3. 0.9% NaCl (0.9% 生理食鹽水) 用以配置藥品與補充動物體液。
4. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate ; Sigma, St. Louis, MO, USA ):實驗中用以偵測血液及尿液離體自由基的冷光劑。
5. Luminol (5-amino-2, 3-dihydro-1,4-phthalazinedione ; Sigma, St.
Louis, MO, USA ) :實驗中用以偵測血液及尿液離體自由基的冷光劑。
6. 對苯二胺(p-Phenylenediamine, Sigma, St. Louis, MO, USA):作為 染髮劑中的脫色劑，於本文中被施用於實驗動物體內以觀察膀胱受 損程度。
五、實驗流程
實驗動物分組:本次實驗將 Wistar rats 分為四組，每組各為五 隻，分別是:(一) 控制組， (二) 腹腔注射 PPD 一個月，(三) 腹腔注射 PPD 一個月後使用抗氧化劑 WCT 003 (1.5 mg/kg) 腹腔注射兩週，以及 (四) 腹腔注射 PPD 一個月後使用抗氧 化劑 WCT 006 (1.5 mg/kg)腹腔注射兩週
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以及壓力感測器 (transducer)。自動打水器以 0.04 mL/min 的固定流速 將生理食鹽水注射入膀胱中，再以 PowerLab 觀測膀胱壓力值。
八、血液以及尿液自由基數量的量測
為了更進一步確認對苯二胺 (p-Phenylenediamine, Sigma, St. Louis, MO, USA) 對於動物體內代謝造成的影響，我們會抽取動物體內的血 液 以 及 收 取 尿 液 並 利 用 化 學 冷 光 分 析 儀 (Chemiluminescence analyzing system, CLD-110, Tohoku Electronic Industrial Co., Sendai, Japan)偵測血液以及尿液中自由基的含量；於每次試驗中，將 200 μL 之樣本加入冷光分析儀之孔盤後，先施測 60 秒以取得基準線，而基 準線之 CL counts 通常落於 500~700；取得基準線後，在第 60 秒時滴 加入 500 μL 之 luminol(5-amino-2, 3-dihydro-1,4-phthalazinedione ; Sigma, St. Louis, MO, USA ) 或 者 500 μL 之 lucigenin(bis-N-methylacridinium nitrate ; Sigma, St. Louis, MO, USA )；lucigenin 可作為專門偵測超氧陰離子氧化物的化學冷光指示 劑 ( Pascual et al., 2006)；而 luminol 又名發光氨，可作為偵測 H2O2
以及 HOCl 等物質在樣本中數量的化學冷光指示劑，以上兩種試劑可 作為判定樣本中自由基含量之用。
九、活體自由基數量測量
動物如前述插完膀胱插管以及動靜脈插管之後，將整隻動物置入化學 冷光分析儀 (Chemiluminescence analyzing system, CLA-ID3 , Tohoku
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Electronic Industrial Co., Sendai, Japan) 中進行整隻活體動物之自由 基含量量測。而在自由基含量降至穩定數值之後，即從膀胱插管之
PE 管 以 固 定 流 速 施 打
2-Methyl-6-(4-methoxyphenyl)-3,7-dihydroimidazo- [1,2-a]-pyrazin- 3-one-hydrochloride (MCLA) (0.02 mL/min)，做為偵測動物體內超陰離 子氧化物自由基含量之用(Lin et al., 2009)。
十、病理切片染色
在實驗動物完成紀錄之後，施打過量之 urethane 進入心臟進行犧 牲，於犧牲後收取動物之膀胱檢體進行後續實驗觀察。取下的膀胱會 截切四分之一塊送交台北病理中心 (Taipei Institute of Pathology, Taipei, Taiwan) 進行石蠟包埋以供切片染色觀察之用，剩餘之四分之 三部分冰存入攝氏零下八十度以供後續作西方墨點法。
交回之臘塊會先以石臘切片機 (RM 2125 RTS, LEICA, German) 切 成 0.2 μm 之厚度並貼於透明玻片上風乾一日以利後續染色作業。
染色初步會先將玻片置於烘箱並設定攝氏六十度烘烤十五分鐘以 利溶臘；烘片完成後，再將玻片浸泡於二甲苯 (xylene) 中十分鐘共 兩次以進行完全脫蠟；脫蠟完成後，將玻片浸泡於酒精中以完成漸次 脫水，首先將玻片浸泡於濃度為 100 % 的酒精，接著再置換到濃度 為 95 % 的酒精，接著換成濃度為 75 % 的酒精，最後是濃度為 50 %
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的酒精，以上的浸泡時間皆各為兩分鐘。
脫水完成後，將玻片浸泡於二次水中三至五分鐘進行覆水，避免檢 體因脫水過度而皺縮。以上步驟完成後，再因不同染色法之需求進行 不同的步驟。本文中所用到的染色法有:
(1) 肥大細胞 (mast cell) 染色:覆水後滴入甲苯胺藍 (toluidine blue)，
再以流動的自來水洗淨。甲苯胺藍為鹼性染料，當遇到肥大細胞 中含量甚多的糖氨多糖時，會因為異染性 (metachromasia) 而呈現 出紫紅色，因此可藉此斷定組織的發炎情況。
(2) H&E 染色:覆水後使用蘇木素 (Hematoxylin) 染五分鐘，再以自 來水沖洗乾淨，而後以二次水浸潤數秒，於 PBS 溶液中使組織呈 現藍色即可，接著再浸泡於 95 %之酒精中。接著使用伊紅 (eosin) 染約三十秒即完成 H&E 染色，以待後續封片。蘇木素本身為鹼性，
主要使細胞核內的染色質以及細胞質中的核醣體呈現紫藍色；而 伊紅為酸性染料，主要可使細胞質以及胞外基質呈現出紅色。
(3) 免疫組織化學染色 (Immunohistochemistry stain) :覆水後使用抗原 恢復劑以攝氏 95 度加熱 10 分鐘，加熱完成後使用濃度 3 %的 H2O2
浸潤玻片 15 分鐘，再以 PBS 溶液清洗兩次，每次五分鐘。接著以 濃度為 2%的小牛血清蛋白(BSA) 在室溫下封鎖 (blocking) 三十 分鐘，完成後再使用 PBS 清洗兩次各五分鐘，清洗完成後即可使
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用一級抗體染特定蛋白至少一小時以上，一級抗體染完後再用 PBS 清洗兩次各五分鐘，接著以二級抗體染色置於攝氏 37 度三十 分鐘。二級抗體染好之後，再使用 PBS 清洗兩次各五分鐘將抗體 充分移除避免染色太久造成背景值髒亂。最後，使用 DAB 呈色法 將 DAB 滴加上玻片，有變橙色即可將液體移除蔭乾。蔭乾之後的 玻片先使用二次水沖洗再用蘇木素 (Hematoxylin) 染細胞核三至 五分鐘；接著再以 PBS 清洗，清洗完後的玻片將其浸泡於氨水中 直至蘇木素脫乾，最後即可以自來水沖洗乾淨等待封片。
(4) TUNEL stain (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling): 脫臘完成後用 pH8.0 之 Tris/HCl 稀釋 100 倍的 proteinase K 至 20 μg/mL；再以稀釋好的 proteinase K 與組織 於室溫作用 20 分鐘，接著用 1X TBS 浸洗，完成組織穿透步驟。
利用 methanol 將 30％的 H2O2稀釋 10 倍，並加到組織上於室溫作 用 10 分鐘，再以 1X TBS 浸洗以抑制內生性酵素。將 5X TdT equilibration buffer 用二次水稀釋五倍，而後加到組織上於室溫作 用 10 分鐘；接著移除 equilibration buffer，隨後加入 TdT 酵素混和 液，於 37℃作用 1.5 個小時完成 TdT 酵素標定反應。標定反應完 成後以 1X TBS 浸洗，再加入 Stop solution 停止 TdT 酵素反應，
而後再以 1X TBS 浸洗。酵素反應完成後，加入 blocking buffer，
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室溫下反應 10 分鐘，接著移除 blocking buffer，再加上用 blocking
室溫下反應 10 分鐘，接著移除 blocking buffer，再加上用 blocking