在實驗進行初期，本人選用胺基鉀酸酯 (urethane, Sigma, St. Louis, MO, USA) 作為麻醉實驗動物之麻醉劑，urethane 之劑量為 1.2 g/kg。
首先，我們將 urethane 分三次施打於腹腔，大腿肌肉，頸部皮下等處，
以避免過快的麻醉劑注射對於動物體造成負擔以及影響膀胱正常收 縮功能。在麻醉完成後，使用大小為 240 之 PE 管進行氣管插管，以 利麻醉狀態下的動物保持順暢呼吸。在氣管插管完成後，我們利用大 小為 50 的 PE 管插入股動脈或者頸動脈進行血壓量測，PE 管會先以 肝素 (heparin,Sigma, St. Louis, MO, USA) 沖洗過以避免血液凝集造
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成血壓量測不準確；在動靜脈的插管完成之後，則會進行開腹腔手 術；膀胱露出之後，將頂端剪開一小開口插入大小為 50 的 PE 管再以 棉繩綁縛避免漏水，而 PE 管則銜接上自動打水器 (infusion pump)；
以每分鐘 0.04 mL 的固定流速施打生理食鹽水進入膀胱；再使用三向 閥接上壓力轉換器 (pressure transducer) 以量得膀胱壓力值。
膀胱頂部插管示意圖
(Sutherland et al., 1997) 三、儀器設備
1.微量天平 (Mettler, PJ100C-T, Greifiensee-Zurich, Switzerland):實驗
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中用以秤量藥物、試劑之重量，可精確至公克以下小數點四位。
2.分光光度計 (Spectrophotometer, V-630, JASCO, USA):實驗中用來 測定檢體中蛋白質之濃度及酵素活性測定。
3.生理記錄儀 (MacLab/PowerLab, ADInstruments, USA):將多項記錄 器中之數據轉移到電腦上。
4. 化 學 冷 光 分 析 儀 (Chemiluminescence analyzing system, CLD-110&CLA-ID3, Tohoku Electronic Industrial Co., Sendai, Japan) : 實驗中用來測定活體及離體自由基的含量。
5.離心機 (Centrifuge, 5804R, Eppendorf, German) :實驗中用來分離組 織研磨後的檢體及血液。
7.石蠟切片機 (Paraffin microtome, RM 2125 RTS, LEICA, German) : 將已包埋好的蠟塊檢體切成所需的厚度，供後續染色以進行研究觀 察。
8.顯微鏡(microscope, DM 750, LEICA, German):透過目鏡與物鏡的高 倍率將組織的表現情況放大觀察
9.照相系統(camera system, SG-130, SHENG-CHUAN, Taiwan):將從顯 微鏡中看到的影像拍攝下來並後製加上尺規
四、實驗藥品與來源
1. 胺基鉀酸酯 (urethane, Sigma, St. Louis, MO, USA):為麻醉劑，使用
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劑量為每公斤 1.2 公克。
2. 肝素 (heparin;Sigma, St. Louis, MO, USA):用於動脈插管時預防血 液凝固而阻塞血管。
3. 0.9% NaCl (0.9% 生理食鹽水) 用以配置藥品與補充動物體液。
4. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate ; Sigma, St. Louis, MO, USA ):實驗中用以偵測血液及尿液離體自由基的冷光劑。
5. Luminol (5-amino-2, 3-dihydro-1,4-phthalazinedione ; Sigma, St.
Louis, MO, USA ) :實驗中用以偵測血液及尿液離體自由基的冷光劑。
6. 對苯二胺(p-Phenylenediamine, Sigma, St. Louis, MO, USA):作為 染髮劑中的脫色劑，於本文中被施用於實驗動物體內以觀察膀胱受 損程度。
五、實驗流程
實驗動物分組:本次實驗將 Wistar rats 分為四組，每組各為五 隻，分別是:(一) 控制組， (二) 腹腔注射 PPD 一個月，(三) 腹腔注射 PPD 一個月後使用抗氧化劑 WCT 003 (1.5 mg/kg) 腹腔注射兩週，以及 (四) 腹腔注射 PPD 一個月後使用抗氧 化劑 WCT 006 (1.5 mg/kg)腹腔注射兩週
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以及壓力感測器 (transducer)。自動打水器以 0.04 mL/min 的固定流速 將生理食鹽水注射入膀胱中，再以 PowerLab 觀測膀胱壓力值。
八、血液以及尿液自由基數量的量測
為了更進一步確認對苯二胺 (p-Phenylenediamine, Sigma, St. Louis, MO, USA) 對於動物體內代謝造成的影響，我們會抽取動物體內的血 液 以 及 收 取 尿 液 並 利 用 化 學 冷 光 分 析 儀 (Chemiluminescence analyzing system, CLD-110, Tohoku Electronic Industrial Co., Sendai, Japan)偵測血液以及尿液中自由基的含量；於每次試驗中，將 200 μL 之樣本加入冷光分析儀之孔盤後，先施測 60 秒以取得基準線，而基 準線之 CL counts 通常落於 500~700；取得基準線後，在第 60 秒時滴 加入 500 μL 之 luminol(5-amino-2, 3-dihydro-1,4-phthalazinedione ; Sigma, St. Louis, MO, USA ) 或 者 500 μL 之 lucigenin(bis-N-methylacridinium nitrate ; Sigma, St. Louis, MO, USA )；lucigenin 可作為專門偵測超氧陰離子氧化物的化學冷光指示 劑 ( Pascual et al., 2006)；而 luminol 又名發光氨，可作為偵測 H2O2
以及 HOCl 等物質在樣本中數量的化學冷光指示劑，以上兩種試劑可 作為判定樣本中自由基含量之用。
九、活體自由基數量測量
動物如前述插完膀胱插管以及動靜脈插管之後，將整隻動物置入化學 冷光分析儀 (Chemiluminescence analyzing system, CLA-ID3 , Tohoku
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Electronic Industrial Co., Sendai, Japan) 中進行整隻活體動物之自由 基含量量測。而在自由基含量降至穩定數值之後，即從膀胱插管之
PE 管 以 固 定 流 速 施 打
2-Methyl-6-(4-methoxyphenyl)-3,7-dihydroimidazo- [1,2-a]-pyrazin- 3-one-hydrochloride (MCLA) (0.02 mL/min)，做為偵測動物體內超陰離 子氧化物自由基含量之用(Lin et al., 2009)。
十、病理切片染色
在實驗動物完成紀錄之後，施打過量之 urethane 進入心臟進行犧 牲，於犧牲後收取動物之膀胱檢體進行後續實驗觀察。取下的膀胱會 截切四分之一塊送交台北病理中心 (Taipei Institute of Pathology, Taipei, Taiwan) 進行石蠟包埋以供切片染色觀察之用，剩餘之四分之 三部分冰存入攝氏零下八十度以供後續作西方墨點法。
交回之臘塊會先以石臘切片機 (RM 2125 RTS, LEICA, German) 切 成 0.2 μm 之厚度並貼於透明玻片上風乾一日以利後續染色作業。
染色初步會先將玻片置於烘箱並設定攝氏六十度烘烤十五分鐘以 利溶臘；烘片完成後，再將玻片浸泡於二甲苯 (xylene) 中十分鐘共 兩次以進行完全脫蠟；脫蠟完成後，將玻片浸泡於酒精中以完成漸次 脫水，首先將玻片浸泡於濃度為 100 % 的酒精，接著再置換到濃度 為 95 % 的酒精，接著換成濃度為 75 % 的酒精，最後是濃度為 50 %
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的酒精，以上的浸泡時間皆各為兩分鐘。
脫水完成後，將玻片浸泡於二次水中三至五分鐘進行覆水，避免檢 體因脫水過度而皺縮。以上步驟完成後，再因不同染色法之需求進行 不同的步驟。本文中所用到的染色法有:
(1) 肥大細胞 (mast cell) 染色:覆水後滴入甲苯胺藍 (toluidine blue)，
再以流動的自來水洗淨。甲苯胺藍為鹼性染料，當遇到肥大細胞 中含量甚多的糖氨多糖時，會因為異染性 (metachromasia) 而呈現 出紫紅色，因此可藉此斷定組織的發炎情況。
(2) H&E 染色:覆水後使用蘇木素 (Hematoxylin) 染五分鐘，再以自 來水沖洗乾淨，而後以二次水浸潤數秒，於 PBS 溶液中使組織呈 現藍色即可，接著再浸泡於 95 %之酒精中。接著使用伊紅 (eosin) 染約三十秒即完成 H&E 染色，以待後續封片。蘇木素本身為鹼性，
主要使細胞核內的染色質以及細胞質中的核醣體呈現紫藍色；而 伊紅為酸性染料，主要可使細胞質以及胞外基質呈現出紅色。
(3) 免疫組織化學染色 (Immunohistochemistry stain) :覆水後使用抗原 恢復劑以攝氏 95 度加熱 10 分鐘，加熱完成後使用濃度 3 %的 H2O2
浸潤玻片 15 分鐘，再以 PBS 溶液清洗兩次，每次五分鐘。接著以 濃度為 2%的小牛血清蛋白(BSA) 在室溫下封鎖 (blocking) 三十 分鐘，完成後再使用 PBS 清洗兩次各五分鐘，清洗完成後即可使
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用一級抗體染特定蛋白至少一小時以上，一級抗體染完後再用 PBS 清洗兩次各五分鐘，接著以二級抗體染色置於攝氏 37 度三十 分鐘。二級抗體染好之後，再使用 PBS 清洗兩次各五分鐘將抗體 充分移除避免染色太久造成背景值髒亂。最後，使用 DAB 呈色法 將 DAB 滴加上玻片，有變橙色即可將液體移除蔭乾。蔭乾之後的 玻片先使用二次水沖洗再用蘇木素 (Hematoxylin) 染細胞核三至 五分鐘；接著再以 PBS 清洗，清洗完後的玻片將其浸泡於氨水中 直至蘇木素脫乾，最後即可以自來水沖洗乾淨等待封片。
(4) TUNEL stain (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling): 脫臘完成後用 pH8.0 之 Tris/HCl 稀釋 100 倍的 proteinase K 至 20 μg/mL；再以稀釋好的 proteinase K 與組織 於室溫作用 20 分鐘，接著用 1X TBS 浸洗，完成組織穿透步驟。
利用 methanol 將 30％的 H2O2稀釋 10 倍，並加到組織上於室溫作 用 10 分鐘，再以 1X TBS 浸洗以抑制內生性酵素。將 5X TdT equilibration buffer 用二次水稀釋五倍，而後加到組織上於室溫作 用 10 分鐘；接著移除 equilibration buffer，隨後加入 TdT 酵素混和 液，於 37℃作用 1.5 個小時完成 TdT 酵素標定反應。標定反應完 成後以 1X TBS 浸洗，再加入 Stop solution 停止 TdT 酵素反應，
而後再以 1X TBS 浸洗。酵素反應完成後，加入 blocking buffer，
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室溫下反應 10 分鐘，接著移除 blocking buffer，再加上用 blocking buffer 稀釋 50 倍的 50X 的 Conjugate buffer，室溫下反應 30 分鐘。
反應完成後用 1X TBS 浸洗。接著將 DAB 溶液覆蓋於切片組織上，
5 分鐘後用 ddH2O 輕輕沖洗，便可加上 20 μL 之 Hematoxylin 染細 胞核。將 Hematoxylin 移除後，使用 Tap water 搖盪清洗 5 分鐘。
(5) 封片:先將染色完成的玻片依序置入濃度為 50 %、75 %、95 %、100
%的酒精中二至三分鐘等待玻片脫水，再浸泡入二甲苯 (xylene)，
接著將封片膠滴一滴於蓋玻片上再與浸泡過二甲苯的載玻片黏 合，即完成封片步驟。
十一、西方墨點法 (Western blot) (一)、組織蛋白質樣本的製備
1.準備研缽，將檢體取出置放在研缽裡。
2.倒入液態氮研磨至檢體呈現粉末狀為止。研磨完成後，加入 400～
1000 μL 的蛋白質萃取緩衝液 (protein extraction buffer) (100 mM Tris, pH=8.0;1.50 M NaCl) 。其內含有蛋白水解酵素之抑制劑 (100μlL Pepstain; 26.5μl Aprotinin) ，在冰浴下將組織均質化之後，放置 10-15 分鐘靜待蛋白質萃取緩衝液將蛋白質萃取出。
3.將萃取完蛋白質的樣本放入 eppendrof 離心機內離心 (12000 rpm
× 30 min×4℃) 。 離心完畢之後取上清液至一個新的 eppendorf 內。
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再離心一次(12000 rpm× 30 min×4℃)。離心完畢之後取上清液至一個 新的 eppendorf 內。
(二)、蛋白質總量的測定
根 據 Lowry 方 法 (Lowry et al., 1951) ， 先 配 置 BSA 溶 液 10 mg/ml ，將 BSA 溶液以二次水稀釋，配得最終濃度為 0、0.2、0.4、
0.6、0.8、 1.0 mg/ml 之標準溶液。將檢體以二次水稀釋 10 倍，分 別 取 25 μl BSA 標 準 溶 液 和 已 稀 釋 待 測 蛋 白 檢 體 ， 加 入 盛 有 Coomassie blue dye (Bio-rad) 試劑 200 μl 試管內均勻混合，反應 5 分鐘之後，再以分光光度計在波長 595 nm 下測其吸光度。利用標準 溶液所得之吸光度繪出標準曲線，再依此曲線求得檢體中蛋白質之含 量。
(三)、電泳分離蛋白質
1.根據蛋白質分析所得檢體總蛋白質濃度，取等量蛋白質含量 (25 μg/well) 後再加入二次水將每管 eppendorf 管內體積補至 20 μL，每管 樣品再分別加入 5μL 的 protein dye ，而後置於 100℃的熱水浴加熱 5 分鐘使 protein dye 與蛋白質溶液完整結合。
2.將己煮好的檢體加入各個承載膠 (stacking gel well )內，在電泳槽中 以電壓 150 V 進行電泳，以分離各種分子量大小不一之蛋白質，在 電泳過程中，可於 SDS-PAGE 上見到藍色帶狀逐漸移動至凝膠的底
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端，此時可停止電泳。
( 四 ) 、 將 分 離 的 蛋 白 質 由 SDS-PAGE 轉 移 到 聚 氟 化 二 乙 烯 膜 (polyvinylidene fluoride，PVDF membrane) 上，將電泳完成後的膠 取 下後，覆蓋在已經過甲醇浸泡的 PVDF membrane 上，在其上下各加 一張 3 mm 厚的濾紙，使其成為三明治夾層狀，置於盛有 transfer buffer 之轉移槽中進行轉移，電流設定在 300 mA ，在 4℃的冷房轉 移 2 小時。
(五)、封鎖 (blocking )
1.將 PVDF membrane 取出，加入固定緩衝液(5% BSA )在振盪器上振
1.將 PVDF membrane 取出，加入固定緩衝液(5% BSA )在振盪器上振