對苯二胺對於膀胱造成損害情形之研究

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 對苯二胺對於膀胱造成損害情形之研究 The effects of para-phenylenediamine on urinary bladder dysfunction. 研究生:陳恬文 Tien-Wen Chen. 指導教授:鄭劍廷博士 Chiang-Ting Chien. 中華民國 102 年 7 月.

(2) 目錄縮寫表-------------------------------------------------------------------7 誌謝----------------------------------------------------------------------9 中文摘要--------------------------------------------------------------11 英文摘要--------------------------------------------------------------12 前言一、膀胱基本構造與功能--------------------------------------13 二、神經系統對於排尿反射的控制--------------------------13 三、膀胱過動症(Overactive bladder)之相關症狀與盛行率 -----------------------------------------------------------------15 四、引發膀胱過動之可能成因--------------------------------16 五、對苯二胺(p-phenylenediamine, PPD)的基本特性與其傷害性--------------------------------------------------------18 六、活性氧(Reactive Oxygen Speices, ROS)之生成機制與其損害--------------------------------------------------------19 七、細胞凋亡(apoptosis) 細胞自噬(autophagy) 發炎性細胞死亡(pyroptosis)-----------------------------------------20 八、活性氧所誘使之膀胱過動症-----------------------------21 九、含鎳超氧化歧化酶(Ni-superoxide dismutases,Ni-SOD) 2.

(3) 之特性與其對於受損膀胱的治療效果----------------22 實驗動機與目的-----------------------------------------------------23 材料與方法-----------------------------------------------------------24 一、實驗動物的照護準備--------------------------------------24 二、插管手術-----------------------------------------------------24 三、儀器設備-----------------------------------------------------25 四、實驗藥品與來源--------------------------------------------26 五、實驗流程-----------------------------------------------------27 六、血壓測量-----------------------------------------------------28 七、膀胱收縮壓力值的量測-----------------------------------28 八、血液以及尿液自由基數量的量測----------------------29 九、活體自由基數量測量-------------------------------------29 十、病理切片染色----------------------------------------------30 十一、西方墨點法(Western blot)--------------------------33 十二、資料統計分析------------------------------------------36 實驗結果-----------------------------------------------------------37 一、 PPD 對於排尿頻率以及代謝功能之影響-------------37 二、動物在麻醉情況下之膀胱功能記錄指標--------------37 三、 PPD 所造成的膀胱收縮功能異常----------------------38 3.

(4) 四、抗氧化劑對於 PPD 所誘發之膀胱功能異常的治療效果-----------------------------------------------------------38 五、 PPD 對於動物體內血液以及尿液自由基之影響以及使用抗氧化劑後的效果----------------------------------39 六、 PPD 對於活體自由基的影響以及抗氧化劑的治療效果--------------------------------------------------------------39 七、 PPD 所造成之膀胱構造發炎以及 WCT 003 與 WCT 006 之治癒效果---------------------------------------------40 八、 PPD 造成之膀胱內部肥大細胞數目增加以及 WCT 003 與 WCT 006 之治癒效果----------------------------40 九、 PPD 誘發之膀胱組織內部 ROS 數量上升、細胞自噬與細胞凋亡表現增加--------------------------------------41 十、 PPD 所誘發之細胞自噬途徑與 WCT 003、WCT 006 的治癒效果--------------------------------------------------41 十一、 PPD 所誘發之細胞凋亡與 WCT 003 的治癒效果 -----------------------------------------------------------------42 十二、 PPD 所誘發之發炎性細胞死亡與 WCT 003 的治療效果-----------------------------------------------------------42 討論--------------------------------------------------------------------44 4.

(5) 結論--------------------------------------------------------------------52 參考文獻-------------------------------------------------------------53 圖表-------------------------------------------------------------------65 表一 PPD 對大鼠之排尿次數與代謝生理值----------------65 表二抗氧化物對 PPD 影響膀胱功能之效應----------------66 圖一大鼠在清醒狀態下的排尿情形--------------------------67 圖二 PPD 對排尿次數之影響----------------------------------68 圖三麻醉動物的膀胱功能指標--------------------------------69 圖四施打 PPD 一個月之後對於膀胱收縮功能所造成的影響 -------------------------------------------------------------------------70 圖五抗氧化劑對於 PPD 所誘發之膀胱功能異常的治療效果 --------------------------------------------------------------------------71 圖六 PPD 的血液自由基數量變化以及使用抗氧化劑後的效果-----------------------------------------------------------------------72 圖七 PPD 與正常動物之尿液和血液自由基數量比較-----73 圖八 PPD 對活體膀胱自由基的影響--------------------------74 圖九 PPD 所導致之膀胱構造異常-----------------------------75 圖十 PPD 對於膀胱構造與組織內發炎細胞數目的影響--76 圖十一 PPD 對於膀胱發炎的影響-----------------------------77 5.

(6) 圖十二 PPD 所誘發之膀胱組織中 ROS 數量上升、細胞自噬與細胞凋亡表現增加-----------------------------------------------79 圖十三 PPD 對膀胱組織之細胞自噬相關蛋白之表現------81 圖十四 PPD 對膀胱組織細胞凋亡相關蛋白表現------------82 圖十五 PPD 對膀胱組織之發炎性細胞死亡相關蛋白表現-83. 6.

(7) 縮寫表 A. amplitude. BCD. bladder contraction duration. BP. baseline pressure. BOO. bladder outlet obstruction. DMSO. dimethyl sulfoxide. IC. interstitial cystitis. ICI. intercontraction interval. IL-1 ß. interleukin-1ß. IL-18. interleukin-18. Luminol. 5-amino-2, 3-dihydro-1,4-phthalazinedione. Lucigenin. bis-N-methylacridinium nitrate. MCLA. 2-Methyl-6-(4-methoxyphenyl)-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]-pyrazin- 3-one-hydrochloride. MVP. maximal voiding pressure. NLRs. NOD-like receptors. Ni-SOD. Ni-superoxide dismutases. PT. pressure threshold. PVDF. polyvinylidene fluoride. PPD. para-phenylenediamine. ROS. reactive oxygen species. SOD. superoxide dismutases. TUNEL. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling. VT. voiding threshold 7.

(8) 3-NT. 3-nitrotyrosine. 8.

(9) 誌謝兩年的碩士生涯，終於到今日有了些成果；回顧過去，在這段時間裡，我補足了學士學位取得後依然欠缺的實驗技巧、邏輯思考、論文閱讀能力，以及最多最多，也是最為珍貴的，就是學習到人與人間互相扶持的重要。在研究的旅途中，如果沒有實驗室學長姐的協助、同儕間所提供的建議，以及最重要的--我的指導教授，鄭劍廷教授給予我的實驗方針以及實驗技巧指導，我想，就算過了三年、四年，我依然還是在黑暗中摸索，無法堂堂正正、抬頭挺胸的告訴別人，我在讀研究所的過程中到底比別人多學到甚麼。如今，這一切也該告個段落，然而，這並不是結束；在我的心中，我永遠會記得實驗室夥伴們在我危急的時候為我點了一盞明燈，我的指導教授永遠在我行進的路途中為我引路，還有，當每位研究生都覺得害怕的專題討論來臨時，黃基礎教授以及吳忠信副教授，從旁協助，不覺麻煩的幫我修改講稿，您們的不吝指導，學生永遠銘記於心。另外，台大醫學院余宏政教授所提供的代謝箱設備，也在整個研究計畫中居功厥偉，讓論文內容更加的充實，也讓我十分感激。回首過去，我十分感謝我的人生中有這樣一段經歷，兩年的時間，我收穫的實在太多太多，不是短短一頁的誌謝可以說盡的，僅能以這 9.

(10) 寥寥數語，表達我心中的感激之意。. 10.

(11) 摘要在現今社會，化學物質對苯二胺 (para-phenylenediamine; PPD) 因具有使毛髮氧化脫色之能力，因此常會被添加於一般民眾所使用之永久性染髮劑中。然而，PPD 的使用長期以來被認為對於膀胱功能有所損害以及發生接觸性皮膚炎。為了釐清 PPD 對於膀胱造成的可能損害，我們使用腹腔注射的方式將 PPD 施打進入實驗動物體內為期一個月，以探討 PPD 對於膀胱功能的影響。藉由膀胱頂部插管以固定流速注入生理食鹽水的方式，進行膀胱壓力檢測；除此之外，為了更深入探討 PPD 所引起的傷害性，我們抽取了實驗動物的血液以及尿液樣本進行自由基數量的檢測，以及進行膀胱活體自由基數量檢測，此外也採得實驗動物的檢體進行病理切片觀察與使用西方墨點法進行計劃性細胞死亡之相關蛋白定量。而實驗結果顯示出，PPD 會使膀胱收縮變得頻繁，也會造成血液與膀胱內部的氧化壓力增加。從病理切片發現到，PPD 會使膀胱產生發炎。而西方墨點法結果也顯示：PPD 會誘發兩種計畫性細胞死亡(細胞凋亡與細胞自我吞噬)。綜合上述結果可得知，PPD 不僅會造成膀胱收縮功能的異常，也會促使血液中氧化壓力的上升以及膀胱組織的發炎，更會進一步使膀胱組織產生兩種不同路徑之計畫性細胞死亡。關鍵字:對苯二胺，膀胱壓力值，細胞凋亡，自由基 11.

(12) Abstract. Para-phenylenediamine (PPD) is a chemical substance that is widely used as a permanent hair dye. PPD via its toxic metabolites may induce some urinary bladder lesions and allergic contact dermatitis. To determine the occurrence and severity of urinary bladder dysfunction possibly caused by PPD, we used intraperitoneal injection of PPD for 4 weeks for induction of chronic bladder injury in the female Wistar rats. I measured bladder cystometrogram by saline infusion from the bladder dome in urethane anesthetized rats. I also measured the reactive oxygen species (ROS) in vitro and in vivo for oxidative stress and observed pathological changes in the formalin-fixed bladder sections. In addition, We explored the protein expression of apoptosis、autophagy and pyroptosis by western blot. The results showed that PPD treatment increased the frequency of micturition. PPD treatment also increased the level of ROS in blood and urinary bladder (H2O2 related oxidative stress). We also found that PPD induced the number of leukocyte infiltration including neutrophils and mast cells in the damaged bladder sections. In addition, the result of western blot indicated that PPD treatment. markedly induced autophagy,. apoptosis and but not caspase-1 mediated pyroptosis. Our study results indicate that PPD induces oxidative stress and inflammatory leukocytosis in the urinary bladder, which subsequent causes bladder dysfunction, possibly involving autophagy and apoptosis menchanism.. Key word: para-phenylenedimine, bladder pressure, apoptosis, ROS 12.

(13) 前言一、膀胱基本構造與功能膀胱(urinary bladder)為哺乳動物之排尿器官，隸屬於泌尿系統，其外型為一囊狀構造，功能則為儲存與排泄尿液；為哺乳動物體內負責排除含氮廢物之重要器官之一。而哺乳動物體內尿液形成途徑則為水份經由腎臟並由其負責過濾含氮廢物與多餘水份以及再吸收離子的過程之後形成尿液；尿液隨後流經輸尿管進入膀胱儲存，當儲存量到達定值時則產生排尿反射 (micturition reflex)；在人體的膀胱最大容積為 400 mL，一般情況下儲存到 200 mL 即會引起排尿反射，產生尿意。在解剖構造上，膀胱的型態為一中空囊狀器官，其肌肉層具有極佳的彈性可脹大數倍以符合儲存尿液之需求；膀胱壁本身則由三層組織組成，由內至外分別為黏膜層，肌肉層和外膜層，而膀胱壁上的肌肉層由平滑肌纖維組成，稱為逼尿肌(detrusor)；當膀胱逼尿肌收縮時，造成膀胱內部壓力值升高，導致尿液受到壓迫而由尿道口排出。而在膀胱底部與尿道口交接處，有一較厚之環形肌構造，稱為尿道括約肌(external sphincter)；平時尿道括約肌呈現收縮情形以維持尿道口關閉狀態進而防止尿液滲漏，而排尿時，尿道括約肌舒張使尿道口開啟進而能讓尿液通過。 13.

(14) 二、神經系統對於排尿反射的控制膀胱的排尿反射 (micturition reflex)，主要是源自於自律神經系統 (Autonomic nervous system) 中交感神經 (sympathetic nerve) 以及副交感神經 (parasympathetic nerve) 的協同調控以及陰部神經 (pudendal nerve) 的意識調控 (voluntarily control) 所致。在膀胱蓄積尿液的過程中，為了避免產生任意排尿行為，位於腦幹中的排尿中樞會驅使交感神經 (sympathetic nerve) 對於主宰排尿行為之膀胱逼尿肌 (detrusor) 產生抑制其收縮的作用；而後當膀胱內所填充之尿液量逐步增加至超越膀胱最大容積時，此時換成副交感神經 (parasympathetic nerve) 興奮進而促使膀胱逼尿肌 (detrusor) 收縮，使之排尿。另外，除了隸屬於自律神經系統之交感神經 (sympathetic nerve) 以及副交感神經 (parasympathetic nerve) 對於膀胱排尿反射參與調控之外，屬於意識控制範圍的陰部神經 (pudendal nerve) 也在排尿反射中扮演了重要的角色，當動物體所屬的時間地點不適宜進行排尿的動作時，大腦皮層 (cortex) 會刺激陰部神經 (pudendal nerve) 使其興奮，當陰部神經 (pudendal nerve) 興奮時，對於外尿道括約肌 (external urethral sphincter) 會產生抑制其舒張的效果，促使外尿道括約肌(external urethral sphincter) 保持在收縮的狀態避免尿液漏出；而 14.

(15) 後隨著尿液的蓄積到達膀胱最大容積的上限時，陰部神經 (pudendal nerve) 對於尿道括約肌 (external sphincter) 舒張的抑制能力隨即下降，此時尿道括約肌 (external sphincter) 開始舒張，與之同時亦有上述由副交感神經 (parasympathetic nerve) 所引發之膀胱逼尿肌 (detrusor)收縮情形，從而產生排尿反射 (micturition reflex) (Fowler et al., 2008)。. 三、膀胱過動症(Overactive bladder)之相關症狀與盛行率膀胱過動症乃現今社會中十分常見之文明病，而患有膀胱過動症之患者生活品質會因此而受到極大的影響；當有如下列症狀產生時，即被定義為患有膀胱過動症：包括頻尿(frequency,每天解尿次 15.

(16) 數大於八次)、解尿急迫感 (urgency)、急迫性尿失禁 (urinary urge incontinence)，以及夜尿 (nocturia，於睡眠時因尿急被迫中斷睡眠起床解尿二次及以上者稱之)。除此之外，根據統計結果顯示 (Milsom et al., 2001)，在歐洲，膀胱過動症於男性間之盛行率為 15.6%，而在女性間則高達 17.4%；而以美國為例，在美國，男性罹患膀胱過動的比例為 16.0%，而女性則是 16.9% ( Stewart et al., 2003)。在這其中，頻尿以及解尿急迫感的症狀比例最高；然而，膀胱過動症的盛行率，由於在不同地區間有不同的定義以及不同的調查方法，甚至是病患在就診時羞於啟齒而造就膀胱過動症盛行率難以估算，甚至常有被低估的情形發生。而隨著年齡逐漸增高，罹患膀胱過動症之機率也會隨之增高；又，女性罹患之機率又較男性為高。. 四、引發膀胱過動之可能成因而導致膀胱過動的產生原因十分複雜，牽涉到包括大腦皮質、腦幹、以及膀胱之運動與感覺神經的傳遞途徑以及下泌尿道周圍的構造病變等，都有可能導致膀胱過動症之產生；由於產生膀胱過動症之病因過多，概分為下列數種以便於釐清患者之病因: 16.

(17) (1). 控制排尿反射之神經系統異常 (de Groat, 1997)。. (2). 膀胱逼尿肌 (detrusor) 在結構上發生病變或者功能上的異常，會導致膀胱的不正常收縮，女性患者通常屬於此類 (Elbadawi and Yalla et al., 1993)。. (3). 精神異常所導致的膀胱過動症，許多研究顯示：患有焦慮症或者憂鬱症之患者比正常人更容易產生解尿急迫性或者尿失禁的情形。估計與血清素(serotonin)分泌減少相關 (Franco, 2007)。. (4). 在男性患者而言，前列腺肥大症等疾病所引發尿道出口阻塞也會導致膀胱過動的情形 ( Kaplan and Roehrborn, 2006)。. (5). 先天性神經系統發育障礙亦會導致膀胱過動產生，如某些神經系統發育較遲緩之幼童常會有夜尿的情況發生 (Franco, 2007)。. (6). 骨盆腔或者尿道異常所導致的膀胱過動：大約有 30%之應力性尿失禁患者會合併產生膀胱過動症，大多數此種病患可藉由手術治癒 (Shafikand and Shafik et al., 2003)。. (7). 老化所導致之膀胱過動：隨著年紀的增長，膀胱逼尿肌收縮無力無法一次排空儲尿進而產生頻尿、或者是神經系統退化而產生無法控制膀胱收縮進而產生尿失禁之情形皆有可能發 17.

(18) 生，因此在診斷老年患者時較難順利找出病因 (Haferkamp and Elbadawi , 2004)。 (8). 抽菸所導致的膀胱過動症:據一項針對女性的調查 (Dallosso and MeGrother, 2003) 顯示: 抽菸會增加膀胱過動症發生的風險。. (9). 飲食習慣導致的膀胱過動症 : 根據研究指出 (Dallosso and MeGrother, 2003): 肥胖以及常飲用碳酸飲料者亦會增高膀胱過動症的風險。. (10) 藥物所導致的膀胱過動症:曾有文獻 (Juszczak and krolczyk, 2007) 指出，使用環磷醯胺 (cyclophosphamide) 的患者易發生出血性膀胱炎，進而導致膀胱過動的情形；同樣的情形在動物實驗上亦有出現。. 五、對苯二胺 (p-phenylenediamine, PPD) 的基本特性與其傷害性 PPD 為硝基苯胺 (paranitroaniline) 的衍生物；為一常使用於染髮劑、刺青染料的化學物質，其氧化能力能使毛髮脫色以利染劑附著於毛髮上；此外，也可用在光化學實驗以及催化硫化反應上 (Singla and Miglani, 2005)。然而，儘管對苯二胺的使用為生活帶來了些許便利性，其毒性對 18.

(19) 於人體的傷害卻不小，接觸對苯二胺的使用者常出現接觸性皮膚炎、結膜水腫、流淚、更甚者，當接觸到眼球時會產生永久性失明。若不慎誤食到對苯二胺時，會引發嚴重的喉部、臉部、咽部、舌頭浮腫，並進而引發呼吸道窘迫，嚴重者須以氣管插管術治療之。除此之外，某些流行病學報告(Thun et al., 1994)亦指出:對苯二胺的使用會促使膀胱組織受損 (Sontag, 1981)；足以證明對苯二胺對於膀胱的危害性不容小覷。然而，對苯二胺對於膀胱基本排尿功能的損傷機制仍未釐清，有待進一步深入探究。. 六、活性氧(Reactive Oxygen Speices，簡稱 ROS)之生成機制與其損害地表上的生物體大部分都需要氧賴以維生，而當氧代謝後即產生活性氧。活性氧為眾多含氧化學物質的統稱，為生物體內代謝氧後所產生的衍生物，與細胞的訊息傳遞以及維持生物體內的恆定有密切關係；其種類包含有: 生命週期短的可擴散性物質如: 羥類 (-OH)，烷氧類 (RO-) 或者是過氧化基 (ROO-) 等自由基生命週期中等的自由基如:超氧化物 (O-2) 或者是硝基 (NO-) 等自由基。 19.

(20) 不屬於自由基類別者如:過氧化氫 (H2O2)、有機過氧化氫類 (ROOH)、以及次氯酸類 (HOCl) 等。. 而在生物體內，發炎反應相關細胞會產生活性氧 (Simon and Haj-Yehia, 2000)，而活性氧本身具有破壞 DNA 以及蛋白質的能力，也因此，當活性氧的濃度正常時，活性氧具有抵禦入侵細菌的能力。然而，當活性氧濃度因為外在環境因素(如紫外線、高溫) 而變的過高時，會進而導致不正常的訊息傳遞、細胞失去正常功能、發炎相關細胞(例:單核球或巨噬細胞)進入組織甚至誘發細胞凋亡 (apoptosis) 、細胞自噬 (autophagy) 或者發炎性細胞死亡 (pyroptosis)等途徑而對生物體造成損害。. 七、細胞凋亡 (apoptosis) 細胞自噬 (autophagy) 發炎性細胞死亡 (pyroptosis) 當粒線體中或者其他胞器中的 ROS 含量過高時，會藉由啟動凋亡蛋白酶 (caspases)、溶體蛋白水解酶 (lysosomal proteases) 或者是核酸內切酶 (endonucleases) 之功能而誘發三種類型的計畫性細胞死亡:細胞凋亡，細胞自噬或者發炎性細胞死亡。從受損的粒線體中釋放出的 ROS (如: O2-. 以及 H2O2) 經由將粒線體中的 cytochrome C 釋放至細胞質從而增加 caspase 3 之活性以 20.

(21) 及截切 Poly ADP-ribose polymerase (簡稱 PARP) 使其作用以誘發細胞凋亡進行 (Yeh and Chiang, 2011) ；另一方面，過量之 ROS 亦會活化 Beclin-1, LC3-II 以及 ATG5-ATG12 等蛋白之表現進而誘發細胞自噬作用(Chien and Shyue, 2007)。而另一種不同於細胞凋亡之計劃性細胞死亡-發炎性細胞死亡則是會在氧化壓力升高以及發炎之時藉由活化發炎相關之介白素 (如: IL-1ß 或者 IL-18) 產生，並進一步使組織受損 (Miao and Rajan, 2011)。. 八、活性氧所誘使之膀胱過動症數種膀胱疾病如膀胱出口梗阻 (Bladder outlet obstruction, BOO) 、缺血、發炎，皆可能肇因於 ROS 的形成所導致 (Parekh and Lobel, 2001; Lin et al., 2005)；近年來亦有許多研究顯示:發炎性細胞所釋放之 ROS 會導致膀胱壓力過高的情況，有些證據更進一步指出:過多 ROS 的釋放會影響膀胱逼尿肌上的蕈鹼受器 (muscarinic receptor) 訊息傳遞途徑，並使膀胱逼尿肌的收縮產生異常，此發現也代表著膀胱逼尿肌上的平滑肌構造對於 ROS 的產生相當敏感。為了探查 ROS 誘發逼尿肌過動情形之詳細機制，前人進行研究得到結果顯示:當將 H2O2 施打入動物體內時，H2O2 所產生的氧化壓力會活化辣椒素 (capsaicin) 敏感性之 C 纖維傳入途徑，從而引發 21.

(22) 膀胱逼尿肌產生過動症狀(Masuda and Kihara, 2007)。. 九、含鎳超氧化歧化酶 (Ni-superoxide dismutases,Ni-SOD) 之特性與其對於受損膀胱的治療效果為了保護生物體免於遭受活性氧的傷害，細胞本身具有超氧化歧化酶 (SOD)；歧化作用本身即代表著在分開的兩個分子上，產生相同卻反應方向相反之兩個反應，而 SOD 可抓住兩個超氧化物陰離子 (superoxide anion)，將其中一個超氧化物的多餘電子剝離並交給另一個超氧化物，因此，SOD 可將毒性高的含氧自由基催化反應成毒性較低的過氧化氫 (H2O2) 以及氧 (O2)；通常，SOD 多存在於粒線體與細胞質中，已知有以金屬銅 (Cu)、錳 (Mn)、鐵 (Fe) 以及鋅 (Zn) 作為輔酶 (coenzyme) 等不同種類的 SOD。而近年來，新發現的是與鎳 (Ni) 結合出現的 Ni-SOD ( Goodsell et al., 2007) 。. ( Goodsell et al.,2007) 各種 SOD 結構比較示意圖 22.

(23) 實驗動機與目的 PPD 的使用在現今社會十分廣泛，而美髮從業人員以及染髮的廣大民眾皆有可能受到 PPD 的影響。但截至目前，尚無相關文獻報導有關 PPD 造成膀胱功能失調之資料與動物模式。因此，本研究希望能夠釐清 1)PPD 的使用對於誘發膀胱過動症以及膀胱發炎的病理生理機轉，並 2)評估新開發藥 Ni-SOD 對於治療膀胱過動症與發炎的可能性。. 23.

(24) 材料與方法一、實驗動物的照護準備在實驗動物的選擇上，本人所使用的實驗動物乃是購自樂斯科生技股份有限公司 (BioLasco Taiwan Co.,Ltd) 週齡九至十二週，體重介於 250 至 300 公克重、飼養於溫度濕度穩定以及光週期固定環境 (上午六點至下午六點供應光源)之 Wistar 品系雌鼠。雌鼠的選用，可以避免雄性生殖器官在實驗進行中對於膀胱的觀察造成干擾。此外，所有實驗動物之飼養照護條件均遵照國立台灣師範大學實驗動物倫理委員會之法規。. 二、插管手術在實驗進行初期，本人選用胺基鉀酸酯 (urethane, Sigma, St. Louis, MO, USA) 作為麻醉實驗動物之麻醉劑，urethane 之劑量為 1.2 g/kg。首先，我們將 urethane 分三次施打於腹腔，大腿肌肉，頸部皮下等處，以避免過快的麻醉劑注射對於動物體造成負擔以及影響膀胱正常收縮功能。在麻醉完成後，使用大小為 240 之 PE 管進行氣管插管，以利麻醉狀態下的動物保持順暢呼吸。在氣管插管完成後，我們利用大小為 50 的 PE 管插入股動脈或者頸動脈進行血壓量測，PE 管會先以肝素 (heparin,Sigma, St. Louis, MO, USA) 沖洗過以避免血液凝集造 24.

(25) 成血壓量測不準確；在動靜脈的插管完成之後，則會進行開腹腔手術；膀胱露出之後，將頂端剪開一小開口插入大小為 50 的 PE 管再以棉繩綁縛避免漏水，而 PE 管則銜接上自動打水器 (infusion pump)；以每分鐘 0.04 mL 的固定流速施打生理食鹽水進入膀胱；再使用三向閥接上壓力轉換器 (pressure transducer) 以量得膀胱壓力值。. 膀胱頂部插管示意圖 (Sutherland et al., 1997). 三、儀器設備 1.微量天平 (Mettler, PJ100C-T, Greifiensee-Zurich, Switzerland):實驗 25.

(26) 中用以秤量藥物、試劑之重量，可精確至公克以下小數點四位。 2.分光光度計 (Spectrophotometer, V-630, JASCO, USA):實驗中用來測定檢體中蛋白質之濃度及酵素活性測定。 3.生理記錄儀 (MacLab/PowerLab, ADInstruments, USA):將多項記錄器中之數據轉移到電腦上。 4. 化學冷光分析儀 (Chemiluminescence. analyzing. system,. CLD-110&CLA-ID3, Tohoku Electronic Industrial Co., Sendai, Japan) : 實驗中用來測定活體及離體自由基的含量。 5.離心機 (Centrifuge, 5804R, Eppendorf, German) :實驗中用來分離組織研磨後的檢體及血液。 7.石蠟切片機 (Paraffin microtome, RM 2125 RTS, LEICA, German) : 將已包埋好的蠟塊檢體切成所需的厚度，供後續染色以進行研究觀察。 8.顯微鏡(microscope, DM 750, LEICA, German):透過目鏡與物鏡的高倍率將組織的表現情況放大觀察 9.照相系統(camera system, SG-130, SHENG-CHUAN, Taiwan):將從顯微鏡中看到的影像拍攝下來並後製加上尺規. 四、實驗藥品與來源 1. 胺基鉀酸酯 (urethane, Sigma, St. Louis, MO, USA):為麻醉劑，使用 26.

(27) 劑量為每公斤 1.2 公克。 2. 肝素 (heparin;Sigma, St. Louis, MO, USA):用於動脈插管時預防血液凝固而阻塞血管。 3. 0.9% NaCl (0.9% 生理食鹽水) 用以配置藥品與補充動物體液。 4. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate ; Sigma, St. Louis, MO, USA ):實驗中用以偵測血液及尿液離體自由基的冷光劑。 5. Luminol. (5-amino-2, 3-dihydro-1,4-phthalazinedione ; Sigma, St.. Louis, MO, USA ) :實驗中用以偵測血液及尿液離體自由基的冷光劑。 6. 對苯二胺(p-Phenylenediamine, Sigma, St. Louis, MO, USA):作為染髮劑中的脫色劑，於本文中被施用於實驗動物體內以觀察膀胱受損程度。. 五、實驗流程實驗動物分組:本次實驗將 Wistar rats 分為四組，每組各為五隻，分別是:(一) 控制組， (二) 腹腔注射 PPD 一個月，(三) 腹腔注射 PPD 一個月後使用抗氧化劑 WCT 003 (1.5 mg/kg) 腹腔注射兩週，以及 (四) 腹腔注射 PPD 一個月後使用抗氧化劑 WCT 006 (1.5 mg/kg)腹腔注射兩週. 27.

(28) 使用 urethane. 進行氣管插管以利呼吸. (1.2 g/kg)進行麻醉. 使用 PE50 進行股動靜. 使用 PE 50 進行膀胱頂. 脈的插管. 部插管. 收取尿液和血液樣本測. 紀錄膀胱活性以及膀胱. 量其自由基含量. 自由基含量. 犧牲動物收取膀胱. 檢體供做後續切片染色與西方墨點法. 六、血壓測量先以肝素(heparin)沖洗過 PE 管，再將 PE 管插入股動脈或者頸動脈中，其後端同樣接上壓力感測器(transducer, ADInstruments, USA)；而整個管柱則是充滿生理食鹽水，並排除氣泡之狀態以避免氣泡堵塞造成血壓值不準確。. 七、膀胱收縮壓力值的量測在動靜脈的插管手術之後，將腹腔剪開露出膀胱，再於膀胱頂端剪一細微開口，插入管徑大小為 50 之 PE 管，再以棉繩綁縛直至無水滲漏；PE 管後端則銜接三向閥，再分別銜接自動打水器 (infusion pump) 28.

(29) 以及壓力感測器 (transducer)。自動打水器以 0.04 mL/min 的固定流速將生理食鹽水注射入膀胱中，再以 PowerLab 觀測膀胱壓力值。. 八、血液以及尿液自由基數量的量測為了更進一步確認對苯二胺 (p-Phenylenediamine, Sigma, St. Louis, MO, USA) 對於動物體內代謝造成的影響，我們會抽取動物體內的血液以及收取尿液並利用化學冷光分析儀 (Chemiluminescence analyzing system, CLD-110, Tohoku Electronic Industrial Co., Sendai, Japan)偵測血液以及尿液中自由基的含量；於每次試驗中，將 200 μL 之樣本加入冷光分析儀之孔盤後，先施測 60 秒以取得基準線，而基準線之 CL counts 通常落於 500~700；取得基準線後，在第 60 秒時滴加入 500 μL 之 luminol(5-amino-2, 3-dihydro-1,4-phthalazinedione ; Sigma,. St.. Louis,. MO,. USA. ) 或者. 500. μL. 之. lucigenin(bis-N-methylacridinium nitrate ; Sigma, St. Louis, MO, USA )；lucigenin 可作為專門偵測超氧陰離子氧化物的化學冷光指示劑 ( Pascual et al., 2006)；而 luminol 又名發光氨，可作為偵測 H2O2 以及 HOCl 等物質在樣本中數量的化學冷光指示劑，以上兩種試劑可作為判定樣本中自由基含量之用。. 九、活體自由基數量測量動物如前述插完膀胱插管以及動靜脈插管之後，將整隻動物置入化學冷光分析儀 (Chemiluminescence analyzing system, CLA-ID3 , Tohoku 29.

(30) Electronic Industrial Co., Sendai, Japan) 中進行整隻活體動物之自由基含量量測。而在自由基含量降至穩定數值之後，即從膀胱插管之 PE. 管. 以. 固. 定. 流. 2-Methyl-6-(4-methoxyphenyl)-3,7-dihydroimidazo-. 速. 施. 打. [1,2-a]-pyrazin-. 3-one-hydrochloride (MCLA) (0.02 mL/min)，做為偵測動物體內超陰離子氧化物自由基含量之用 (Lin et al., 2009)。. 十、病理切片染色在實驗動物完成紀錄之後，施打過量之 urethane 進入心臟進行犧牲，於犧牲後收取動物之膀胱檢體進行後續實驗觀察。取下的膀胱會截切四分之一塊送交台北病理中心 (Taipei Institute of Pathology, Taipei, Taiwan) 進行石蠟包埋以供切片染色觀察之用，剩餘之四分之三部分冰存入攝氏零下八十度以供後續作西方墨點法。交回之臘塊會先以石臘切片機 (RM 2125 RTS, LEICA, German) 切成 0.2 μm 之厚度並貼於透明玻片上風乾一日以利後續染色作業。染色初步會先將玻片置於烘箱並設定攝氏六十度烘烤十五分鐘以利溶臘；烘片完成後，再將玻片浸泡於二甲苯 (xylene) 中十分鐘共兩次以進行完全脫蠟；脫蠟完成後，將玻片浸泡於酒精中以完成漸次脫水，首先將玻片浸泡於濃度為 100 % 的酒精，接著再置換到濃度為 95 % 的酒精，接著換成濃度為 75 % 的酒精，最後是濃度為 50 % 30.

(31) 的酒精，以上的浸泡時間皆各為兩分鐘。脫水完成後，將玻片浸泡於二次水中三至五分鐘進行覆水，避免檢體因脫水過度而皺縮。以上步驟完成後，再因不同染色法之需求進行不同的步驟。本文中所用到的染色法有: (1) 肥大細胞 (mast cell) 染色:覆水後滴入甲苯胺藍 (toluidine blue)，再以流動的自來水洗淨。甲苯胺藍為鹼性染料，當遇到肥大細胞中含量甚多的糖氨多糖時，會因為異染性 (metachromasia) 而呈現出紫紅色，因此可藉此斷定組織的發炎情況。 (2) H&E 染色:覆水後使用蘇木素 (Hematoxylin) 染五分鐘，再以自來水沖洗乾淨，而後以二次水浸潤數秒，於 PBS 溶液中使組織呈現藍色即可，接著再浸泡於 95 %之酒精中。接著使用伊紅 (eosin) 染約三十秒即完成 H&E 染色，以待後續封片。蘇木素本身為鹼性，主要使細胞核內的染色質以及細胞質中的核醣體呈現紫藍色；而伊紅為酸性染料，主要可使細胞質以及胞外基質呈現出紅色。 (3) 免疫組織化學染色 (Immunohistochemistry stain) :覆水後使用抗原恢復劑以攝氏 95 度加熱 10 分鐘，加熱完成後使用濃度 3 %的 H2O2 浸潤玻片 15 分鐘，再以 PBS 溶液清洗兩次，每次五分鐘。接著以濃度為 2%的小牛血清蛋白(BSA) 在室溫下封鎖 (blocking) 三十分鐘，完成後再使用 PBS 清洗兩次各五分鐘，清洗完成後即可使 31.

(32) 用一級抗體染特定蛋白至少一小時以上，一級抗體染完後再用 PBS 清洗兩次各五分鐘，接著以二級抗體染色置於攝氏 37 度三十分鐘。二級抗體染好之後，再使用 PBS 清洗兩次各五分鐘將抗體充分移除避免染色太久造成背景值髒亂。最後，使用 DAB 呈色法將 DAB 滴加上玻片，有變橙色即可將液體移除蔭乾。蔭乾之後的玻片先使用二次水沖洗再用蘇木素 (Hematoxylin) 染細胞核三至五分鐘；接著再以 PBS 清洗，清洗完後的玻片將其浸泡於氨水中直至蘇木素脫乾，最後即可以自來水沖洗乾淨等待封片。 (4) TUNEL stain. (Terminal deoxynucleotidyl. transferase-mediated. dUTP nick-end-labeling): 脫臘完成後用 pH8.0 之 Tris/HCl 稀釋 100 倍的 proteinase K 至 20 μg/mL；再以稀釋好的 proteinase K 與組織於室溫作用 20 分鐘，接著用 1X TBS 浸洗，完成組織穿透步驟。利用 methanol 將 30％的 H2O2 稀釋 10 倍，並加到組織上於室溫作用 10 分鐘，再以 1X TBS 浸洗以抑制內生性酵素。將 5X TdT equilibration buffer 用二次水稀釋五倍，而後加到組織上於室溫作用 10 分鐘；接著移除 equilibration buffer，隨後加入 TdT 酵素混和液，於 37℃作用 1.5 個小時完成 TdT 酵素標定反應。標定反應完成後以 1X TBS 浸洗，再加入 Stop solution 停止 TdT 酵素反應，而後再以 1X TBS 浸洗。酵素反應完成後，加入 blocking buffer， 32.

(33) 室溫下反應 10 分鐘，接著移除 blocking buffer，再加上用 blocking buffer 稀釋 50 倍的 50X 的 Conjugate buffer，室溫下反應 30 分鐘。反應完成後用 1X TBS 浸洗。接著將 DAB 溶液覆蓋於切片組織上， 5 分鐘後用 ddH2O 輕輕沖洗，便可加上 20 μL 之 Hematoxylin 染細胞核。將 Hematoxylin 移除後，使用 Tap water 搖盪清洗 5 分鐘。 (5) 封片:先將染色完成的玻片依序置入濃度為 50 %、75 %、95 %、100 %的酒精中二至三分鐘等待玻片脫水，再浸泡入二甲苯 (xylene)，接著將封片膠滴一滴於蓋玻片上再與浸泡過二甲苯的載玻片黏合，即完成封片步驟。. 十一、西方墨點法 (Western blot) (一)、組織蛋白質樣本的製備 1.準備研缽，將檢體取出置放在研缽裡。 2.倒入液態氮研磨至檢體呈現粉末狀為止。研磨完成後，加入 400～ 1000 μL 的蛋白質萃取緩衝液 (protein extraction buffer) (100 mM Tris, pH=8.0;1.50 M NaCl) 。其內含有蛋白水解酵素之抑制劑 (100μlL Pepstain; 26.5μl Aprotinin) ，在冰浴下將組織均質化之後，放置 10-15 分鐘靜待蛋白質萃取緩衝液將蛋白質萃取出。 3.將萃取完蛋白質的樣本放入 eppendrof 離心機內離心 (12000 rpm × 30 min×4℃) 。離心完畢之後取上清液至一個新的 eppendorf 內。 33.

(34) 再離心一次(12000 rpm× 30 min×4℃)。離心完畢之後取上清液至一個新的 eppendorf 內。 (二)、蛋白質總量的測定根據 Lowry 方法 (Lowry et al., 1951) ，先配置 BSA 溶液 10 mg/ml ，將 BSA 溶液以二次水稀釋，配得最終濃度為 0、0.2、0.4、 0.6、0.8、 1.0 mg/ml 之標準溶液。將檢體以二次水稀釋 10 倍，分別取 25 μl BSA 標準溶液和已稀釋待測蛋白檢體，加入盛有 Coomassie blue dye (Bio-rad) 試劑 200 μl 試管內均勻混合，反應 5 分鐘之後，再以分光光度計在波長 595 nm 下測其吸光度。利用標準溶液所得之吸光度繪出標準曲線，再依此曲線求得檢體中蛋白質之含量。 (三)、電泳分離蛋白質 1.根據蛋白質分析所得檢體總蛋白質濃度，取等量蛋白質含量 (25 μg/well) 後再加入二次水將每管 eppendorf 管內體積補至 20 μL，每管樣品再分別加入 5μL 的 protein dye ，而後置於 100℃的熱水浴加熱 5 分鐘使 protein dye 與蛋白質溶液完整結合。 2.將己煮好的檢體加入各個承載膠 (stacking gel well )內，在電泳槽中以電壓 150 V 進行電泳，以分離各種分子量大小不一之蛋白質，在電泳過程中，可於 SDS-PAGE 上見到藍色帶狀逐漸移動至凝膠的底 34.

(35) 端，此時可停止電泳。 ( 四 ) 、將分離的蛋白質由 SDS-PAGE 轉移到聚氟化二乙烯膜 (polyvinylidene fluoride，PVDF membrane) 上，將電泳完成後的膠取下後，覆蓋在已經過甲醇浸泡的 PVDF membrane 上，在其上下各加一張 3 mm 厚的濾紙，使其成為三明治夾層狀，置於盛有. transfer. buffer 之轉移槽中進行轉移，電流設定在 300 mA ，在 4℃的冷房轉移 2 小時。 (五)、封鎖 (blocking ) 1.將 PVDF membrane 取出，加入固定緩衝液(5% BSA )在振盪器上振盪 1 小時，將膜上非抗體專一鍵結部位封鎖住。 2.將封鎖緩衝液移除後，以 TTBS (TBS + 750μl tween-20) 在上潤濕三次，每次 10 分鐘。 (六)、加入一級與二級抗體 1.用封鎖緩衝液分別將一級 anti-IL1ß (Epitomics, abcam, Cambridge, England) 、 anti-LC3II (Epitomics, abcam, Cambridge, England) 、 anti-caspase1 (Epitomics, abcam, Cambridge, England) 及 anti-Beclin1 (Epitomics, abcam, Cambridge, England) 用 BSA 做稀釋，再與 PVDF membrane 於室溫下反應 3 小時。 2.將一級抗體移除後，加入 TTBS 清洗三次，每次 10 分鐘。 35.

(36) 3.將二級 anti-mouse 或 anti-rabbit 抗體 (Chemicon, CA, USA )用 BSA 稀釋 10000 倍後，與 PVDF membrane 在室溫下反應三小時。 4.反應後，分別再以 TTBS 及蒸餾水清洗 PVDF membrane 三次。 (七) 、染色呈像 1.使用 ECL 偵測試劑放上 PVDF membrane。 2.將 PVDF membrane 置入照像系統中。 3.將已呈色的 PVDF membrane 拍照 (ImageQuant LAS 4000 Mini, GE Healthcare Life Sciences, USA)。. 十二、資料統計分析本文使用 paired t-test 進行數據統計，並使用 sigma plot (10.0 版) 構圖. 36.

(37) 結果一、 PPD 對於排尿頻率以及代謝功能之影響經過一個月施打 PPD 之後，從表 (一) 以及圖 (一)、圖 (二) 顯示出：PPD 會造成動物在日常情況下的代謝功能與控制組產生差距；將動物置於代謝箱中並置入固定 50 克重的飼料、100 毫升的飲用水之後即開始記錄動物排尿情況(Labscribe software, iworx)；於 24 小時後再行採取剩餘飼料、飲用水以及排泄之尿液、糞便並記錄之；由圖(一)以及圖(二)可看出：施打 PPD 一個月之動物組別其尿液較重；而從曲線上也可看出 PPD 較諸於控制組之排尿波形多出甚多微小梯形波，表示 PPD 處理後的動物其膀胱容易產生無效收縮，也代表著 PPD 的組別其膀胱收縮較為頻繁。而在進食方面，PPD 組別之進食情況與控制組相較無明確增長情況，然而其不論是飲水量或者是排便量等都比控制組多，足可證明 PPD 有影響正常代謝功能之能力。. 二、動物在麻醉情況下之膀胱功能記錄指標圖 (三) 所顯示的是麻醉手術狀態下之各項膀胱功能指標，如圖所示: MVP: maximal voiding pressure，代表最大膀胱壓力 37.

(38) 值，亦即膀胱產生收縮波之最大值；BP: baseline pressure，基礎膀胱壓力值，可視作為基準線； BCD: bladder contraction duration，膀胱收縮期，由 BCD 可看出膀胱整個收縮過程所歷時的時間；A: amplitude，膀胱收縮的振幅，為 MVP 扣除 BP 所得之數值；PT: pressure threshold，引發膀胱收縮之閾值，過此閾值始能產生膀胱收縮，ICI: intercontraction interval，收縮波間期，ICI 愈短代表排尿頻率越頻繁，可能伴隨著頻尿症狀的產生。. 三、PPD 所造成的膀胱收縮功能異常 PPD 施打一個月之後的膀胱壓力值如圖 (四) 所示: 圖 (A) 組別的膀胱功能與控制組相比出現異常，其壓力波形較為頻繁而且波形十分不規律，其 MVP 值與控制組相較略小，其症狀較類似於臨床上所謂的尿失禁、頻尿、排空障礙等情形。而圖 (B) 以及圖 (C) 所顯示的結果可見:施打 PPD 的組別其收縮頻率較諸控制組要快上許多，膀胱收縮波間期較短，然而其波形卻十分規律。綜合上述結果顯示: PPD 的施打對於膀胱收縮功能確實會產生如上述頻尿以及減少膀胱 MVP 值之影響，導致排尿功能出現障礙。. 四、抗氧化劑對於 PPD 所誘發之膀胱功能異常的治療效果為治療 PPD 所誘發之膀胱功能異常，本人使用編號為 WCT 003 以 38.

(39) 及 WCT 006 之抗氧化劑；在使用 PPD 誘發膀胱功能異常大鼠之紀錄過程中，使用 WCT 003 以及 WCT 006 滴於膀胱表面使其滲透進入膀胱內部；結果顯示：WCT 003 以及 WCT 006 皆可使 PPD 所導致之膀胱頻繁收縮症狀趨於緩解。. 五、PPD 對於動物體內血液以及尿液自由基之影響以及使用抗氧化劑後的效果如圖(六)與圖(七)所示: PPD 會使血液中自由基含量大幅增加，而尿液中的自由基含量與控制組相較之下則未看出有顯著增加之情形；而血液中之自由基含量則是使用 Luminol 偵測之組別有較明顯之增加現象，代表 PPD 所增加的自由基類型主要為 H2O2、HOCl，並非是 Lucigenin 所偵測之超陰離子氧化物 (superoxide anion) 等。然而，在使用抗氧化物 WCT 003 以及 WCT 006 之後，可使 PPD 所誘發之含氫離子自由基數量下降並伴隨著超氧陰離子自由基數量無明顯差異的結果產生。. 六、 PPD 對於活體自由基的影響以及抗氧化劑的治療效果如圖 (八) 所示：當使用 MCLA 自膀胱頂部插管以定流速進入膀胱用以偵測膀胱內部超陰離子氧化物自由基數量時，可發現到使用 PPD 處理一個月之組別其自由基含量較諸於控制組的數值(平均值約莫 3000 至 4000) 要多出許多 (60000 至 80000) ，代表 PPD 的使用 39.

(40) 除帶來膀胱收縮異常外，亦會造成膀胱內部自由基增加之結果；而在使用編號為 WCT 003 以及 WCT 006 處理之後，可見到 WCT 003 以及 WCT 006 確實能達到清除體內自由基含量之功效，並保護膀胱組織免於受 PPD 之傷害。. 七、 PPD 所造成之膀胱構造發炎以及 WCT 003 與 WCT 006 之治癒效果從圖 (九) 以及圖 (十) 之 H&E 染色可清楚見到，在使用 PPD 處理之組別中，其細胞核含量較控制組多，並伴隨著膀胱構造不完整之結果，代表著以 PPD 誘發組別之膀胱組織可能出現發炎性細胞浸潤之現象，而嗜中性球 (Neutrophil) 數目亦可看出呈現增加趨勢，也代表著 PPD 的使用會導致膀胱發炎；而使用 WCT 003 以及 WCT 006 的組別，能看出膀胱壁局部構造之嗜中性球數目與 PPD 相較之下有略為下降之現象，亦足以說明 WCT 003 以及 WCT 006 具有部分減緩發炎之功效。. 八、 PPD 造成之膀胱內部肥大細胞數目增加以及 WCT 003 與 WCT 006 之治癒效果如圖 (十一) 所示: 使用甲苯胺藍染色後，所呈現之紫色顆粒數目在 PPD 處理的組別中比控制組要多出甚多，做為發炎反應中最先啟動之細胞種類，此結果代表著 PPD 的使用會造成膀胱發炎的結果； 40.

(41) 而在使用 WCT 003 以及 WCT 006 進入膀胱內部之後，其染色結果所呈現的肥大細胞數目有下降趨勢，代表 WCT 003 以及 WCT 006 具有抑制發炎反應之特性。. 九、PPD 誘發之膀胱組織內部 ROS 數量上升、細胞自噬與細胞凋亡表現增加如圖 (十二) 的免疫組織化學染色結果所示: 由上至下分別是：代表有 ROS 存在指標的 3-nitrotyrosine (3-NT) 染色、細胞自噬途徑相關蛋白的 LC3II 染色，以及代表有細胞凋亡現象的 TUNEL 染色，若細胞核附近出現褐色區域，則代表組織有細胞凋亡之現象。左圖為控制組，右圖為以 PPD 誘發膀胱功能異常與組織損害之 PPD 組別。從右上圖的染色結果可見其出現若干褐色斑塊，證實 PPD 誘發膀胱組織中的 ROS 數量與控制組相較之下大增。右中圖則可看出，膀胱組織內的 LC3II 表現與左中圖的控制組相比要多出許多，代表 PPD 誘發膀胱組織產生細胞自噬，損害膀胱組織。右下圖的 TUNEL 染色結果則可看出比左下圖的控制組多出若干褐色區域，且多位於細胞核附近，代表 PPD 誘發膀胱內部產生細胞凋亡。. 十、 PPD 所誘發之細胞自噬途徑與 WCT 003、WCT 006 的治癒效果從圖 (十三) 之西方墨點法結果顯示 : 使用 PPD 處理之組別其 41.

(42) Beclin1 以及 LC3II 之表現量都會比控制組多，做為引發細胞自噬途徑之重要蛋白，代表著 PPD 的使用造成 ROS 數量上升並因此誘發細胞自噬途徑，造成組織損害；而使用 WCT 003 以及 WCT 006 治療之後，可見到無論是 Beclin1 或者是 LC3II 的表現量都會有下降情形，此一發現代表 WCT 003 以及 WCT 006 因為具有清除體內過多 ROS 的能力也同時代表著其具有減緩 PPD 所誘發細胞自噬反應之功效。. 十一、 PPD 所誘發之細胞凋亡與 WCT 003 的治癒效果如圖 (十四)所示 : 被 caspase 裁切的 PARP (分子量大小 89 KDa) 表現量通常被視做為攸關能否誘發細胞凋亡反應之一重要指標。從圖可見使用 PPD 處理之組別其 PARP 表現量較控制組來的多，代表 PPD 可能會藉由增加體內 ROS 數量以誘發膀胱內部產生細胞凋亡，造成膀胱組織損傷；而在使用 WCT 003 治療之後，其 PARP 之表現量下降，代表 WCT 003 的使用可以抑制細胞凋亡途徑使得組織受損程度趨緩。. 十二、PPD 所誘發之發炎性細胞死亡與 WCT 003 的治療效果如圖 (十五) 所示: 使用 PPD 處理之組別其 Caspase 1 之表現量與控制組相較並未看到明顯增加之情形；因為 Caspase 1 本身所具有的活化發炎性細胞死亡之能力，因此選擇 Caspase1 定量做為發炎性細 42.

(43) 胞死亡指標；然而，從圖 (十五) 之結果無法明確指出 PPD 是否會誘發發炎性細胞死亡途徑進而導致組織受損；儘管如此，在使用 WCT 003 治療之後，其 Caspase 1 表現量跟使用 PPD 處理之組別以及與控制組相比皆呈現下降趨勢，代表 WCT 003 確實有部分抑制發炎性細胞死亡之效用。. 43.

(44) 討論綜合本實驗所得重要結果，可發現結果有: (一) PPD 的使用會導致動物日常排尿頻率增加。(二) PPD 的使用對於動物的膀胱最大壓力值會造成下降但可經由 WCT 003 以及 WCT 006 的使用產生部分治療效果。(三) PPD 的使用會造成動物體內的血液含氫種類自由基數量上升但可藉由抗氧化劑之使用稍微回復。(四) PPD 的使用會造成膀胱內部超氧陰離子自由基數量上升，但使用 WCT 003 以及 WCT 006 之後可使自由基數量些微下降。(五) PPD 的使用會使膀胱組織發炎，然而此現象可被 WCT 003 以及 WCT 006 部分抑制。(六) PPD 的使用會造成膀胱組織產生細胞自噬、細胞凋亡等，造成膀胱構造與功能一併受損；然而在使用 WCT 003 之後，上述兩種計劃性細胞死亡途徑可被部分抑制，而發炎性細胞死亡相關蛋白表現在 WCT 003 的使用下也呈現下降趨勢，代表 WCT 003 亦能抑制發炎性細胞死亡途徑，對膀胱形成保護作用。而根據圖 (四) 的結果可見，PPD 誘發之膀胱收縮波異常可分為 (A) 尿失禁、頻尿、排空障礙與 (B) 排尿間期頻繁卻規律兩大類；(A) 組別與 (B) 之最大差別為，(A) 類型的收縮異常通常其 MVP 值較小，代表這類的膀胱出現許多無效收縮 (類似情況亦可參考圖 (二)) ，至於為何 PPD 誘發出的膀胱功能異常會有如 44.

(45) 上述之變異性? 個人推測其可能原因為，當 PPD 進入體內並引發炎性細胞釋放 ROS 時，ROS 可能影響膀胱之收縮強度，進而使大鼠於排尿時較難產生有效收縮，因此容易有類似於尿失禁之症狀產生，然而，ROS 對於膀胱收縮之影響能力尚不明確，因此仍須進一步探究其成因與解決方法。此外，從結果可發現血液中之 ROS 種類多屬 H2O2 以及 HOCl 等含氫種類活性氧，然而，從膀胱活體 ROS 偵測結果顯示，膀胱內部之超氧陰離子自由基數量呈現上升趨勢；綜合上述結果，可得知:超氧陰離子自由基較易出現於膀胱內部而非血液中，並因而影響膀胱組織使膀胱排尿功能受損。究其原因，推測為: 膀胱組織本身缺乏清除自由基之酵素，無法將毒性較強之超氧陰離子自由基代謝為毒性較小之 H2O2 與 O2 (Kong et al., 1981)，因此造成超氧陰離子自由基長時間滯留於膀胱組織，並因而對膀胱功能產生影響。而 Masuda 以及 Kihara 等人在 2007 年的研究也證實: 膀胱組織對於 ROS 的存在異常敏感，因此 PPD 造成之膀胱超氧陰離子自由基數量增加進而導致膀胱收縮異常的結果為符合預期。至於血液中 H2O2 以及 HOCl 等含氫種類活性氧之來源為何? 經推測其原由應該是: 在以 PPD 誘發膀胱功能異常時，是經由腹 45.

(46) 腔注射之方式進入全身血液循環，因此造成血液中自由基數量上升，並在誘發結束之後，仍能藉由 luminol 測得，代表 PPD 誘發之血液自由基數量難以藉由抗氧化酵素徹底清除，因而形成自由基滯留於體內之現象。然而，透過實驗結果亦發現，尿液中的自由基數量未有明顯上升情況，此一結果與膀胱內部自由基數量上升之結果相悖；按常理而言，受損膀胱中的發炎性細胞會釋放 ROS 至尿液中，造成尿液 ROS 數量上升；經推測造成此一現象之原因可能為：尿液中的自由基由於排尿作用較易被排出體外，或者是由於某些原因使尿液中自由基可以較快的被代謝，因此尿液自由基數量無上升現象。而由於膀胱內部自由基測得結果多為超氧陰離子自由基，因此選用 Ni-SOD 做為治療受損膀胱之抗氧化劑，以求其能發揮清除超氧陰離子自由基之功效；結果顯示：在膀胱內部自由基數量方面，確實因為 Ni-SOD 的添加而下降，然而，血液中以 lucigenin 偵測之數據卻顯示: 不論是使用 WCT 003 或者是 WCT 006 都未發現 ROS 數量有降低之現象。推測其原因可能為: PPD 誘發組別之血液中的超氧陰離子自由基數量原先即與控制組無顯著差異，因此，在這樣的情況下，無法使 Ni-SOD 妥善發揮其清除超 46.

(47) 氧陰離子自由基功效。從實驗結果 (圖(六)至圖(八)) 可看出，Ni-SOD 確實有減少 ROS 之效用，然而，於實驗過程中可發現，Ni-SOD 所降低之 ROS 數值不等，從數千至數萬皆曾經被觀測到，推測其可能原因為: Ni-SOD 的抗氧化能力有賴於動物體本身自由基種類、自由基數量多寡以及動物體內本身之抗氧化酵素活性，使得 Ni-SOD 所降低之 ROS 數值不盡相同；或者是，Ni-SOD 的劑量 (1.5 mg/kg) 並非是最適宜之劑量，因此，有賴進一步搜尋最適宜的投藥方式以及劑量以期發揮 Ni-SOD 之最大功效。於配製 WCT 003 以及 WCT 006 時，為求高溶解性以及高滲透性使 Ni-SOD 能發揮最大功效，於是選用二甲基亞碸 (dimethyl sulfoxide, DMSO)做為溶劑，用以溶解 WCT 003 以及 WCT 006；而經前人研究 (Parkin et al., 1997) 顯示：DMSO 具有治療間質性膀胱炎 (interstitial cystitis, 簡稱 IC) 之療效，於臨床使用已行之有年，因此，Ni-SOD 對於受損膀胱的治療能力，也可能伴隨著 DMSO 本身所具有之療效，因此對於 Ni-SOD 的治療能力有輔助效果。而 Ni-SOD 所催化的反應式為: . Ni3+ - SOD + O2− → Ni2+ -SOD + O2 47.

(48) . Ni2+- SOD + O2− + 2H+ → Ni3+ - SOD + H2O2.( Fridovich, 1975) 可看出 Ni-SOD 主要是透過金屬 Ni 的氧化數變化使 SOD 藉由氧化還原反應清除超氧陰離子自由基，以達到保護細胞的目的。透過反應式可發現，Ni-SOD 的作用旨在清除超氧陰離子自由基，於反應完成後理應會降低 O2−數量並增加 H2O2 數量；然而，從圖 (六) 使用 luminol 偵測 ROS 數量之結果卻可看見， WCT 003 以及 WCT 006 具有降低血液中含氫種類活性氧數量之效果，與預期的結果產生衝突，造就此一現象之詳細機制仍有待進一步探究。圖 (十一) 可明確見到，PPD 組別的膀胱組織比控制組多出許多肥大細胞，肥大細胞除會釋放組織胺 (histamine) 引發免疫反應之外，前人研究 (Sant and Kempuraj, 2007) 亦顯示出: 肥大細胞在間質性膀胱炎中扮演重要角色；臨床上治療間質性膀胱炎主要也是透過抑制肥大細胞的活化與增生兩方面著手；而膀胱壁內部的肥大細胞活化機制十分複雜，例如尿路上皮的通透性增加會導致肥大細胞的活化而引發間質性膀胱炎，由此可知肥大細胞與膀胱發炎以及引發膀胱疼痛的關聯密不可分；因此，為了探究 PPD 對於膀胱組織的損害程度，個人選用肥大細胞染色做為膀胱發炎指標，結果顯示肥大細胞的數量大增，代表 PPD 的使用確實會誘發膀胱炎 (圖 (九) 至圖 (十一))。 48.

(49) 而在膀胱壓力記錄過程中，可發現，以 PPD 誘發之組別其引發排尿反射之閾值 (voiding threshold, VT) 約為 0.52 mL，而第一次排出的尿液體積約為 0.08 mL (數據未顯示)；與控制組的 VT 值大於 1 mL (Herrera et al., 2010)相較，代表 PPD 會導致膀胱最大容積 (Maximum Cystometric Capacity) 變小，經推測，造成此現象之可能原因為：PPD 促使膀胱組織發炎，而炎性細胞導致膀胱組織的 ROS 數量上升並進一步誘發細胞死凋亡與細胞自噬，因此造成膀胱組織產生更嚴重的病變，導致膀胱最大容積變小。綜合圖 (十二) 與圖 (十三) 之結果，可以確知 PPD 會導致細胞自噬與細胞凋亡；細胞自噬通常是在遭遇到逆境時，為了節省能量而選擇犧牲某些老舊胞器所引發的吞噬作用，從結果可推測，PPD 所誘發的細胞自噬是源自於炎性細胞所釋放的 ROS，因此，Ni-SOD 才可藉由清除 ROS 進一步的減緩細胞自噬現象。為了最有效率的利用體內有限的能量，細胞自噬與細胞凋亡間彼此又有著巧妙平衡的關係，當細胞自噬途徑啟動後，被吞噬的老舊胞器通常是被回收再利用或者是走向死亡的結果。細胞凋亡為一種耗能性的計畫性細胞死亡，旨在清除發育不善之細胞以求為生物體節省能量，細胞凋亡本身在生物體發育以及代謝過程中也扮演著不可或缺之角色；因此，當遇到不利於細 49.

(50) 胞生存之因素時(例:體內 ROS 數量大增)即會啟動之(Simon et al., 2000)。儘管細胞凋亡途徑在正常狀態下有保護生物體之能，然而，當細胞進行不該啟動的細胞凋亡作用時，生物體的平衡狀態即會失控，造成生物體損害。根據本實驗結果顯示，PPD 所造成之膀胱發炎可能就是誘發膀胱不正常細胞凋亡之主因，此種情況下所誘發之細胞凋亡不僅無法達到保護組織、節省能量之效用，甚至還進一步對膀胱組織造成損害，以致影響正常排尿功能，因此， PPD 的使用所造成之傷害性不應加以輕忽。Ni-SOD 因具有清除動物體內 ROS 之功效，可抑制 PPD 所誘發之細胞凋亡途徑，達到保護膀胱的目的。而本研究關注的另一項重點: 發炎性細胞死亡，則是在先天性免疫反應中扮演重要角色，當組織發炎時會引致細胞內聚合相關受器 (NOD-like receptors, NLRs) 的活化，並因此促成發炎小體 (inflammasomes) 的形成，發炎小體的形成則會進一步活化 caspase 1，將其截切為大的 subunit (20 KDa) 與小的 subunit (10 KDa) (Schroder et al., 2010)，活化後之 caspase 1 則會活化細胞素 (cytokine) 中的 interleukin-1ß (IL-1ß) 與 interleukin-18 (IL-18)，進而引發發炎性細胞死亡途徑。 50.

(51) 而根據圖 (九) 至圖 (十一) 的結果顯示，已可確認 PPD 確實會誘發膀胱發炎，然而，做為誘發發炎性細胞死亡與否的重要指標: caspase 1，其表現與控制組相較之下卻未發生如預期中明顯上升；對於此一情況，可能的原因為：動物隻數的數量仍未大到足以明顯看出差異、在西方墨點法中所使用的抗體品質、PPD 所誘發的劑量與時程是否不足等；因此，有關 PPD 是否會誘發發炎性細胞死亡仍須進一步探究。儘管未能明顯看出 PPD 會誘發發炎性細胞死亡，然而，WCT 003 的添加仍可看見 caspase 1 之表現下降，因此，Ni-SOD 本身或許具有預防發炎性細胞死亡之潛力。而在 PPD 誘發之後，儘管實驗進行日程具有若干差異，然而，在膀胱壓記錄當下以及後續西方墨點與病理切片之結果，仍然可見其具有膀胱收縮異常、組織發炎與細胞死亡相關性蛋白表現量增多之現象，代表一個月的誘發時程足以造成永久且不可恢復性之膀胱損害。. 51.

(52) 結論 PPD 的施打足以造成膀胱過動之結果，並且伴隨著血液中含氫種類活性氧增加以及膀胱自由基數量的上升；除此之外，PPD 亦會造成膀胱構造發炎現象以至於使膀胱受損。而 PPD 所導致之自由基上升結果會進一步的促使膀胱產生細胞凋亡、細胞自噬等計畫性細胞死亡途徑，對於膀胱構造以及機能皆造成損害。然而，在使用編號 WCT 003 以及 WCT 006 治療之後，由於其本身之清除自由基能力，能減緩施打 PPD 後所造成之膀胱組織受損情況，進一步使膀胱收縮功能趨於正常。. 52.

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(65) 表一 PPD 對大鼠排尿次數與代謝生理值之影響. N=7 each 表一大鼠在清醒狀態下為期 24 小時的代謝情況在實驗進行初時會給予 50 克重的飼料，100 mL 的飲用水。於歷經 24 小時之後，紀錄飼料餘重、剩餘水量、尿量、糞便量等並繪製成圖表。由表中可見，於 24 小時內，施打 PPD 的組別排尿頻率要比控制組多出甚多；而飲水量、尿量、排便量也有略為增加的現象；其餘食物量、體重等則無明顯增加之情形。. 65.

(66) 表二抗氧化物對 PPD 影響膀胱功能之效應. N=3 each 表二、麻醉動物的膀胱功能指標統計表(ICI、MVP、A) 表(二)所代表的是控制組與施以 PPD 一個月的動物組別、施打 PPD 一個月以後加上 WCT 003 治療之組別以及施打 PPD 一個月之後加上 WCT 006 治療之組別四個組別的膀胱收縮功能指標統計表。由表(二) 可見:PPD 組別的 ICI 值比控制組要多出許多，代表出現收縮頻繁亦即近似於膀胱過動之症狀；而在施以 WCT 003 以及 WCT 006 治療之後，可見到 ICI 數值下降，亦即 WCT 003 以及 WCT 006 有趨緩膀胱過動之功能。而膀胱壓力最大值 MVP，施打 PPD 之組別未能顯現出與控制組之明確差異，而使用 WCT 003 以及 WCT 006 治療之後也未有明確下降或增高之情況。而振幅(A)值同樣是在施打 PPD 的組別以及控制組間為能看出明確差異，而使用 WCT 003 以及 WCT 006 治療之組別亦然。. 66.

(67) (B). 100. 100. 80. 80. Urine weight (g). Urine weight (g). (A). 60 40 20. 60 40 20. 0. 0. 0. 2. 4. 6. 8. 10 12 14 16 18 20 22 24. 0. 2. 4. Time (hr). 6. 8. 10 12 14 16 18 20 22 24. Time (hr). N=5 each 圖一、大鼠在清醒狀態下的排尿情形本圖為將大鼠放置於代謝箱裝置中 24 小時所記錄到的排尿結果。由圖(A)可見，施打 PPD 一個月的組別在 24 小時內的排尿重會比控制組(圖(B))要來的多。代表著 PPD 的使用促使大鼠出現尿多的症狀。. 67.

(68) (A). Urine weight (g). 32. 0. 0. 24. Time (hr). (B). Urine weight (g). 32. 0 0. 24. Time (hr). N=1 each 圖二、 PPD 對排尿次數之影響本圖為代謝箱記錄過程之原始圖，X 軸為時間(單位:小時)，Y 軸為尿重(單位:克重)；是代謝箱紀錄器所感受到的尿重所構成之曲線圖；上圖為控制組的記錄結果，下圖為使用 PPD 誘發之結果，可發現到，控制組以及 PPD 之尿重皆落在 32 克重左右，並無明確差異，然而， PPD 組別相較之下，比控制組出現許多微小且密集之梯形波，代表使用 PPD 誘發之大鼠在代謝過程中屢次產生無效收縮，類似尿失禁之症狀。 68.

(69) Artery blood pressure (mm Hg). 150. MVP. 0. ICI ICI. 40. Bladder pressure (mm Hg). A A. BCDBCD 11 min min. PT PT BP. 0. 圖三、麻醉動物的膀胱功能指標 MVP: maximal voiding pressure，最大排尿壓力值； BP: baseline pressure，基礎膀胱壓力值； BCD: bladder contraction duration，膀胱收縮期； A: amplitude，膀胱收縮的振幅，為 MVP 扣除 BP 所得之數值； PT: pressure threshold，引發膀胱收縮之閾值； ICI: intercontraction interval，收縮波間期。. 69.

(70) 圖四、施打 PPD 一個月之後對於膀胱收縮功能所造成的影響圖(A)組別的膀胱功能異常類似臨床上所謂的尿失禁、頻尿、排空障礙等無效收縮的症狀產生。而圖(B)則近似於膀胱過動症的症狀，可看見施打 PPD 的組別收縮頻率較諸控制組要快上許多。. 70.

(71) (C). Bladder pressure ( mm Hg ) Bladder pressure ( mm Hg ). (B). Bladder pressure ( mm Hg ). (A). 40. 0. Bladder pressure ( mm Hg ). 7. 14. 21. 28. 0. 7. 14. 21. 28. 0. 7. 14. 21. 28. 0. 7. 21. 28. 40. 0 40. 0. (D). 0. 40. 0. 14 Time ( min ). 圖五、抗氧化劑對於 PPD 誘發膀胱功能異常的治療效果經證實 PPD 的使用足以誘發膀胱功能異常 (圖(B)) 之後，使用編號 WCT 003 (圖(C)) 以及編號 WCT 006 (圖(D)) 的抗氧化劑 Ni-SOD (1.5 mg/kg) 治療 PPD 所造成之膀胱功能異常；結果發現，在使用抗氧化劑治療之後，無論是編號為 WCT 003 或者是 WCT 006 之抗氧化劑，都有使膀胱過度頻繁收縮症狀趨緩的效果，證實此一抗氧化劑有治療膀胱功能異常的結果。. 71.