第一章 序論
第五節 差異蛋白質體學(Differential proteomics)
隨著 2003 年人類基因定序計劃完成，發現人類基因序列中的基因數量並 沒有想像中的多，只有三到四萬基因數目而已，因此許多生物功能是由基 因轉錄為 mRNA，之後在轉譯成蛋白質，有些蛋白質會額外修飾官能基團 後，才可表現出功能及特性。質譜儀分析蛋白質技術不斷的開發與進步再 加上電腦整合運算能力的大幅提升，高效能鑑定蛋白質成為使得蛋白質體 學能夠蓬勃與快速發展。蛋白質體(Proteome)於 1994 年澳洲遺傳學家 Marc
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壹、 穩定同位素標定(Stable isotope labeling)
近 代 憑 藉 著 奈 米 級 液 相 層 析 技 術 搭 配 質 譜 儀 (Nanoflow liquid chromatography mass spectrometry, nano-LC MS)，大幅提升蛋白質的分析上 的靈敏度及高通量，雖然無法用肉眼直接判斷出含量多寡，但卻增加了蛋 白質定量的準確性，蛋白質定量標定常運用酵素或同位素化學試劑標記於 樣品中，藉由進入質譜儀進行比較分析。
一、 代謝物標定(Metabolic labeling)
細胞培養胺基酸穩定同位素標記(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC)[40]在活體細胞內(in vivo)加入含同位素的培養液或 胺基酸，經過數代培養後吸收代謝，產生含有同位素的標定蛋白質，與實 驗控制組沒有標記樣品混合，同一段胜肽中因不同樣品被標記同位素，在 質譜圖中會形成差異，質譜訊號強度呈現胜肽表現含量，因此可比較出相 對含量，然而此方法只適用於細胞標定，無法用於組織或體液上。
二、 酵素標定(Enzymatic labeling)
蛋白質水解降解成胜肽時需要酵素酶進行反應，也可以同時進行標定，
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利用含有 16O 或 18O 的水分子，分別加入需要比較的兩種不同樣品中，蛋 白質水解時會將溶液中的 16O 或 18O 置換至水解的胜肽羧基上，混和樣品 後進入質譜進行分析比對，因為羧基上有兩個氧原子，在質譜圖上會造成 4 Da 的差異，十分便利方便，缺點是只適用高解析質譜儀，當胜肽帶有二 或三價電荷時 4 Da 的差距會被縮小為 2 和 1.3 Da，差異太小會與樣品本 身的同位素難以區分，另一個缺點是 16O 和 18O 會產生逆交換(Back-Exchange)，結構會影響交換速率，造成質譜圖分析更加困難[41, 42]。
三、 化學標定(Chemical labeling)
目前最常使用的定量方法之一，將帶有不同同位素的化學試劑與胜肽 樣品進行標記反應，就好像用不同標籤般標記的每個樣品，市面上常看見 的 市 售 化 學 試 劑 有 同 位 素 編 碼 親 和 標 籤 (Isotope-coded affinity tags, ICAT)[43]、串聯質譜標籤(Tandem mass tags, TMT™)[44]和同重元素相對與 絕對定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)[45]等等。
本次實驗中使用的是 iTRAQ 4-plex 試劑，主要結構由三部份的基團組成如 圖 12，
圖 12 同重元素相對與絕對定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)結構
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第一部份 114-117 m/z 報導基團(Reporter group)依不同種同位素組合，產生 質量差異於質譜圖中可辨別不同種樣品，經由 MS/MS 掃描後利用報導基 團訊號強度大小進行定量；第二部份為平衡基團(Balance group)相對分子 質量為 31-28 m/z 用於當胜肽樣品與 iTRAQ 試劑結合時，各標記樣品擁有 同段的胜肽序列並獲得等重質量 145 m/z，優點是進入質譜做第一次 MS 掃 描時，可加強訊號強度，使質譜儀能偵測到已標記的胜肽片段前驅離子訊 號：第三部分為胜肽反應基團(Peptide reactive group)會與胜肽的胺端(N-terminal)和離胺酸(Lysine)做結合。實驗過程如下，先將水解過的胜肽樣品 分別加入不同同位素的 iTRAQ 試劑，進入質譜儀中，剛開始的 MS 掃描由 於同重標記，只會看到相同前驅離子不同同位素的樣品因平衡基團只會顯 示出一個特定的強大訊號，質譜會選定較強大的訊號進行撞碎，此時報導 基團與中性平衡基團斷裂，因平衡基團不帶電不會被偵測到，而之後得到 的 MS/MS 圖譜會包含某段胜肽序列的產物離子訊號及不同樣品中的報導 基團，就可以得到每個樣品間的含量差異進行比較分析，經由電腦資料庫 的比對鑑定到所屬蛋白質，如圖 13 所示。
圖 13 iTRAQ 分析流程圖
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