研究動機

於 1989 年 Qui-Lim Choo 與 George Kuo 等人從血清中分離出非 A 非 B 型肝炎病毒，確認 C 型肝炎病毒的存在[46, 47]，研究至今已開發多款藥 物可進行治療，然而治療藥物價格昂貴，C 型肝炎病毒基因變異性較大，

尚未開發出可有效防範之疫苗，未能確切瞭解 C 型肝炎從急性到慢性期間 實際運作情況，形成目前研究上的阻礙。

本實驗使用已發表於期刊中成功大學楊孔嘉老師實驗室基醫所學生蔡 佩汝培養擁有高靈敏可偵測報導 HCV 活性的 Huh7.5-SEAP 細胞株，此細 胞株可模擬 HCV 感染患者，演繹從急性到慢性這段期間感染過程，得知 病毒活性差異、不同階段成長速率及受感染後病毒含量的變化[48]，圖 14 圖 15 皆為成功大學楊孔嘉老師實驗室基醫所學生蔡佩汝所作。圖 14 細 胞外感染性動態變異圖，可見在 Exponential(E)階段下動態範圍為最高，

Plateau(P)階段有較平穩的感染性，最後在 Silencing(S)階段下，感染性不明 顯 且 數 值 較 低 ， 在 最 後 Chronic(C) 階 段 只 有 微 幅 被 偵 測 到 。

圖 14 細胞外感染性動態變異圖

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圖 15 受 HCV 感染(Infection)及控制組(Mock)細胞株成長速率比較圖，此 圖顯示不同階段下有不相同的成長速率，初始 Exponential(E)及 Plateau(P) 受 HCV 感染階段比起未受感染控制組慢將近三分之一倍的生長速率；在 Declined(D)階段於第四週時受感染細胞株成長速率最為緩慢；Silencing(S) 階段受感染細胞株成等速率成長，但對於控制組而言，成長速域仍是比較 慢；Chronic(C)階段不論是受感染或未受感染的細胞株皆呈現相同速率成 長。

圖 15 受 HCV 感染(Infection)及控制組(Mock)細胞株成長速率比較圖

再搭配 iTRAQ 技術，能定量比較相同細胞株在不同時期蛋白質含量變化，

藉由同位素標記受感染的生物樣品及未受感染的控制組，使樣品間能相互 定量比較，找出於不同時期中表現較明顯的差異蛋白及生物途徑。

為了能更深入研究 C 型肝炎的機制及蛋白質的運作和從急性到慢性這 段期間受 HCV 感染的細胞蛋白質含量變化差異，因此選擇分別培養至第 8 天(Exponential)、第 16 天(Plateau)、第 30 天(Declined)、第 81 天(Silencing)、

第 112 天(Chronic)，從急性到慢性這段期間五種階段細胞株萃取樣品，如 圖 16 所示:

21 圖 16 受 HCV 感染 Huh7.5-SEAP 細胞株不同階段示意圖

使用 iTRAQ 4-plex 試劑與鄰近兩天數樣品分為五組定量相互比較，以 及受到 C 型肝炎病毒感染的樣品標記為(IN)和相同天數培養下無感染 C 型 肝炎病毒的控制組細胞株標記為(HS)進行比較，如表格中所示:

表 1iTRAQ 標記不同天數的 Huh7.5-SEAP 細胞株

由於最近幾年期刊報導 iTRAQ 4-plex 比起 iTRAQ 8-plex 與 TMT 有 更好的再現性與蛋白質涵蓋率(Coverage)[49, 50]，且有較小的偏差值，因 此選用 4-plex 此試劑作為標記，搭配奈米級液相層析串聯質譜儀技術，分 析 HuH7.5-SEAP 細胞株，模擬受到 C 型肝炎感染的細胞，為了降低樣品 複雜性，在第一維度分離時選用 SCX、sIEF 和 bRP 三種不同分離策略分 離，進入 LC-MS/MS 得到圖譜數據，在運用生物軟體進行分析，期望尋找 出急性 和慢 性感 染 間 的差 異蛋 白質 ， 作為生 物標 記蛋 白 質 (Biomarker proteins)，圖 17 運用 iTRAQ 化學標定分析 C 型肝炎病毒感染從急性到慢 性不同階段之差異蛋白質體研究實驗流程圖。

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圖 17 運用 iTRAQ 化學標定分析 C 型肝炎病毒感染從急性到慢性不同階段之差異蛋白質體研究

實驗流程圖

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