液相層析分離技術

圖 2C 型肝炎病毒基因型

HCV 可能引發急性和慢性感染，通常以感染後病毒存在於體內的時間 長度做為區分。

壹、 急性 C 型肝炎(Acute infection)

在 HCV 急性感染者中，感染初期通常沒有症狀，或是只出現像是 發燒、疲倦和噁心等較輕微的症狀[6]，少數情況才會導致危急生命的 猛爆性肝炎，因此診察不易，難以在第一時間發現，約有 15-45%急性 感染者會自行痊癒，大多數 55-85%的感染者會演變為慢性 C 型肝炎，

並長時間寄宿在於人體肝臟中[7]。

貳、 慢性 C 型肝炎(Chronic infection)

慢性 C 型肝炎感染者中，定義為受到感染後至少六個月的時間內仍被 檢驗到有病毒複製存在於體內的情況[8]。這段期間可能沒有或只有輕微症 狀，但病毒仍持續損害肝臟，肝臟處於長期發炎的狀態，經年累月下演變 為肝纖維化，最後容易病變形成肝硬化及肝癌[9]。

第二節 液相層析分離技術

串聯式質譜儀在解析度及數據採集速度上近年來有明顯的進步，儼然

3 (Multidimentional protein identification technology, MudPIT)[10, 11]大幅提升 胜肽解析度，依照蛋白質不同特性，例如，極性、帶電電荷、電荷大小、

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的靜相，用於吸附待測物，之後改變移動相增加非極性緩衝液比例，使非 極性緩衝液與樣品競爭，將樣品沖提出來。靜相使用二氧化矽作為基底，

帶有矽醇基團(Si-OH)的官能基，可與長碳鏈烷基 C8或者 C18形成鍵結，取 代-OH 上的氫，成為非極性的靜相，然而仍然有未經修飾反應的矽醇基，

帶有負電，會與胜肽上的正電胺基反應，造成層析圖譜中見到訊號峰脫尾 (tailing)的情況，改善方法為加入小分子的三甲基矽烷(-Si(CH3)3)，與未反 應的矽醇基作用，形成 end-capped[15]，如圖 3 逆相層析法 C18靜相結構，

不只可以減少矽醇基與胜肽反應，也可以延長層析管柱的使用期限。此次 實驗中運用到逆相層析管柱為胜肽樣品進行分離與純化去鹽。

圖 3 逆相層析法 C18靜相結構

5 圖 4 逆相層析實驗原理示意圖

圖 4 逆相層析實驗原理示意圖 (a)將需純化的胜肽樣品進樣至含有 C18靜 相的管柱中 (b)C18 靜相開始分離鹽類與雜質及抓取純化樣品 (c)胜肽屬於 較低極性的物質，會與低極性的靜相產生作用力，黏附在靜相上，較具極 性的鹽類和其他雜質則會隨著較高極性的水相流出管柱，被抓住的胜肽則 依然留在靜相 (d)之後增加低極性溶液在動相的比例，使低極性樣品能隨 著高極性動相溶液一起被沖提出來。

一、 鹼性逆相層析法

此方法原理與一般逆相層析管柱相同，但為了得到更好的分離效果，

選擇優化二維層析管柱的動相 pH 值，運用離線裝置(Off-line)在第一維度 中提高移動相溶液的 pH 值，使鹼性胺基酸在鹼性移動相溶液呈中性，增 加與靜相管柱的吸附力，再進入第二維度擁有較低或較中性的 pH 值完成

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樣品分離，運用 pH 值的差異，可以提高樣品的分離效率，而在過去的文 獻中，二維逆相層析管柱(RP-RP)都展現出良好的正交性[16-18]。因此選用 此方法作為本次實驗三種分離方法之一，用來分離高複雜性的 HCV 樣品。

貳、 液相等電點聚焦法

蛋白質由各類不同的胺基酸組成，有許多帶電荷的基團，它是兩性分 子，胺基酸上的殘基、羧基和胺基會帶有電荷，所帶的淨電荷，會隨著 環境的 pH 值改變而跟著變化，如圖 5 所示。

圖 5 胺基酸在不同 pH 值的解離狀態

兩性離子(Zwitterion)在適當 pH 值環境下，會產生胺基酸表面總電荷為零 的情況，此時則達到等電點(Isoelectric point, pI)，因此利用不同種蛋白質 或胜肽的等電點(Isoelectric point, pI)會有所不同去進行分離。此方法可運 用到具有 pH 值梯度的膠條，它可將特定範圍 pH 值固定在膠條上，當膠 條兩端加上正負電極，通入直流電流後，胜肽或者蛋白質就會因靜電荷 不平衡受電流影響而開始移動，直到移動到特定 pH 值，也就是胜肽靜電 荷為零到達等電點，就會聚焦停留在特定的位置[19]。此次實驗使用 Agilent 3100 OFFGEL Fractionator，能夠在液態情況進行等電點分離，且 可回收液態樣品，方便進入後續 LC-MS/MS 偵測，圖 6 為 Agilent 3100 OFFGEL Fractionator 簡易操作示意圖

7 圖 6Agilent 3100 OFFGEL Fractionator 簡易操作示意圖

(a)先將格子固定後，並用溶液均勻填入格子(Well)使 IPG gel strips 活化。

(b)調配好的樣品均勻注入所有的樣品格子，蓋上密封條(Cover seal)於樣 品槽上，防止水份的揮發。(c)通電後，蛋白質或胜肽分子會在 IPG gel strips 上移動，直到停止在各自等電點的位置。(d)分離後的蛋白質或胜肽 分子溶液，蒐集於膠條上方樣品格內，液態樣品可方便取出並用於下游 的實驗應用[20]。

參、 離子交換層析法(Ion exchange chromatography, IEC)

依據待測物不同的電性、電荷大小和電荷數目與靜相正負電荷相互吸 引形成離子鍵，達到分離的一種方法。藉由移動相緩衝溶液，改變胺基酸 周圍的環境，使胺基酸小於或大於等電點，讓胺基酸帶電，被帶有相異電

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荷的靜相吸引住，就能有效分離待測物。蛋白質樣品通常以離子鍵吸附，

因此要沖提出樣品時，必須提高鹽濃度以破壞離子鍵結或者改變動相緩衝 液的 pH 值，使得蛋白質的電荷改變而溶離出來，一般多使用前者[21]。

離子交換層析法通常依電性分為兩類：陽離子交換層析法和陰離子交換層 析法，陽離子交換層析法使用經解離後帶有負電的官能基團(－R－SO3H,

－PO2H2, －COOH, －OH)作為交換樹脂，與帶有正電荷的胜肽形成鍵結，

而後者則使用會帶有正電的官能基團([－N⁺(CH3)3], [－N(CH3)2], [－NH2]) 作為交換樹脂與帶有負電荷的胜肽結合，通常依照樣品需求，選用適合的 離子交換樹脂。

一、 強陽離子交換層析法

如圖 7 強陽離子交換實驗原理示意圖: (a)如果被純化的物質是大分子胜肽，

分子上的淨電荷就會和胺基酸的等電點和溶液的 pH 值有關，當緩衝溶液 的 pH 值較小，會使大部分胺基酸分子帶正電荷(b)帶正電的胜肽分子就會 鍵結在強酸性的陽離子交換樹脂上(c)由於鹽類是強電解質，增加移動相鹽 類濃度即可破壞胜肽與強離子交換樹脂之間的離子鍵結，胜肽分子就會依 照與交換樹脂結合力強弱，由電荷弱到強胜肽依序被洗出。

9 圖 7 強陽離子交換實驗原理示意圖

二維液相層析中，強陽離子交換層析法是很常被使用到的一種方式[22, 23]，藉由兩種不同原理分離，先電荷強弱再由極性高低，可以得到良好的 分離效果，鑑定到更多蛋白質。本次實驗中，選用此方法作為第一維度分 離方法之一。