運用iTRAQ化學標定分析C型肝炎病毒感染從急性到慢性不同階段之差異蛋白質體研究

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(1)國立臺灣師範大學化學系研究所碩士論文 Department of Chemistry, National Taiwan Normal University Master Thesis. 運用 iTRAQ 化學標定分析 C 型肝炎病毒感染從急性到慢性不同階段之差異蛋白質體研究 Quantitative proteomics analysis from acute to chronic stages of hepatitis C virus infection by iTRAQ technology. 林子鈺撰 Tze-Yu Lin 指導教授：陳頌方博士 Advisor： Sung-Fang Chen, Ph.D. 中華民國一百零六年七月 July, 2017 1.

(2) 謝誌感謝指導教授陳頌方老師，兩年來不僅傳授理論知識，提供於我操作線性離子阱質譜儀的機會，也隨時指正生活中應有的禮貌及態度。共同合作的成大醫技系楊孔嘉老師以及蔡佩汝學姊，提供我所需樣品，協助繁雜的數據分析，不厭其煩回答著我的疑問，且遠從台南北上討論並參加我的口試，令我瞭解即使實驗很艱辛，仍需踏實地面對困難並以嚴謹的態度完成實驗。輔大生科系陳翰民老師擔任我的口試委員，提供見解使論文能更加完善。陳柏睿經理協助機器維護及修理，並傳授面試技巧。曾小姐幫忙察看高效能液相層析儀，及辦理採購耗材相關事務，也感謝曾經幫忙過的廠商及工程師，讓我更明白儀器的操作原理及細部結構。芷葳大學姊在畢業後，仍會以訊息回應我的問題。沛倫學長帶領文獻回顧和軟體的維護，還有總是很認真的廷宇學長、教我管帳的詩潔學姊、共同維護質譜儀及教導我操作的婷婷、怡安學姊，學長姐們的經驗傳承，對於身為懵懂無知碩一時的我獲益良多。謝謝同屆愛運動的你們，生活智慧王義澧、開車游泳都很行的郁樺、常常陪我留守實驗室熱愛羽球的詩涵，與你們討論問題，生活在一起的碩班生活很充實豐富。可愛的學弟妹們，有時說話很逗的秉毅、位子常常被我跨越的琬柔、共同報帳的薇雅、同台質譜儀守護者雅喬，以及對面葉怡均家及其他實驗室的朋友義不容辭的提供藥品和幫助。最後我要感謝我的父母親支持我繼續升學，讓我能拿到碩士學位，還有我的弟弟能陪我談心聊天，感謝有你精神上的支持。我的學生生涯終將進入尾聲，但這兩年來卻不只是知識方面的成長，更多的是生活上的經歷，感謝此時與你們相遇，在我當學生的最終篇章有著最豐富的內容，也終於畫下句點。 2.

(3) 目錄目錄 .....................................................................................................................I 圖目錄 ..............................................................................................................IV 表目錄 ..............................................................................................................VI Abstract .......................................................................................................... VII 中文摘要 ....................................................................................................... VIII 縮寫 ..................................................................................................................IX 第一章序論 ...................................................................................................... 1 第一節 C 型肝炎病毒(Hepatitis C virus) ................................................ 1 壹、急性 C 型肝炎(Acute infection).............................................. 2 貳、慢性 C 型肝炎(Chronic infection) .......................................... 2 第二節液相層析分離技術 ...................................................................... 2 壹、逆相層析法 .............................................................................. 3 貳、液相等電點聚焦法 .................................................................. 6 參、離子交換層析法(Ion exchange chromatography, IEC) .......... 7 第三節蛋白質身分鑑定 .......................................................................... 9 壹、胜肽質量指紋(Peptide mass fingerprinting, PMF) ............... 10 貳、胜肽碎片指紋(Peptide fragment fingerprinting, PFF).......... 11 第四節質譜儀技術 ................................................................................ 11 壹、電噴灑游離法(Electrospray Ionization, ESI) ....................... 13 貳、線性離子阱(Linear ion trap, LIT) ......................................... 13 第五節差異蛋白質體學(Differential proteomics)................................ 15 壹、穩定同位素標定(Stable isotope labeling)............................. 16 第六節西方墨點法(Western blot) ......................................................... 19 I.

(4) 第七節研究動機 .................................................................................... 19 第二章實驗材料與方法 ................................................................................ 23 第一節樣品來源 .................................................................................... 23 第二節樣品純化濃縮 ............................................................................ 24 壹、材料與儀器設備 .................................................................... 24 貳、實驗步驟 ................................................................................ 24 第三節蛋白質濃度測定(Bradford protein assay) ................................ 25 壹、藥品與試劑 ............................................................................ 25 貳、儀器設備 ................................................................................ 25 參、實驗步驟 ................................................................................ 25 第四節蛋白質水解（In-solution digestion）與化學標定 iTRAQTM . 26 壹、藥品與試劑 ............................................................................ 26 貳、儀器設備 ................................................................................ 26 參、實驗步驟 ................................................................................ 27 第五節第一維分離策略 ........................................................................ 27 壹、等電聚焦分級分離儀 (Solution isoelectric focusing, SIEF) .......................................................................................................... 27 貳、強陽離子交換層析法 (Strong cationic exchange chromatography, SCX) ..................................................................... 29 參、鹼性逆相層析法(Basic reverse phase chromatography, bRP) .......................................................................................................... 31 第六節自製碳 18 離心管柱去鹽(C18 spin column) ............................ 32 壹、材料與試劑 ............................................................................ 32 貳、儀器設備 ................................................................................ 33 參、實驗步驟 ................................................................................ 33 II.

(5) 第七節奈米級液相層析電噴灑游離串聯式質譜儀 (nanoLC ESI tandom mass spectrometry) ..................................................................... 34 壹、自製液相層析分析管柱 ........................................................ 34 貳、超高效能液相層析(Ultra-performance liquid chromatography, UPLC,Waters) ...................................................... 35 參、線性離子阱量譜儀(Linear ion trap mass spectrometer, LTQ XL, Thermo Fisher) ......................................................................... 36 第八節資料分析(Data analysis) ............................................................ 38 壹、參數設定 ................................................................................ 38 第三章結果與討論 ........................................................................................ 39 第一節蛋白質樣品濃度測定 ................................................................ 39 第二節利用不同分離策略 iTRAQ 標記胜肽樣品.............................. 41 壹、等電點聚焦分離儀(sIEF) ..................................................... 41 貳、強陽離子交換法(SCX) ......................................................... 43 參、鹼性逆相層析法(bRP) .......................................................... 46 第三節三種分離策略結果比較 ............................................................ 49 第四節蛋白質相關生物途徑 ................................................................ 57 第四章結論與未來展望 ................................................................................ 61 第五章參考文獻 ............................................................................................ 62 附表 .................................................................................................................. 66. III.

(6) 圖目錄圖 1 肝臟受 C 型肝炎感染病變為肝癌之過程 .............................................. 1 圖 2C 型肝炎病毒基因型 ................................................................................ 2 圖 3 逆相層析法 C18 靜相結構 ........................................................................ 4 圖 4 逆相層析實驗原理示意圖 ....................................................................... 5 圖 5 胺基酸在不同 pH 值的解離狀態 ............................................................ 6 圖 6Agilent 3100 OFFGEL Fractionator 簡易操作示意圖 ............................. 7 圖 7 強陽離子交換實驗原理示意圖 ............................................................... 9 圖 8 胜肽離子碎片形式 ................................................................................. 10 圖 9 質譜儀常見的各元件儀器示意圖 ......................................................... 12 圖 10 電噴灑游離過程示意圖 ....................................................................... 13 圖 11 LTQ XL 儀器裝置構造圖 ................................................................... 14 圖 12 同重元素相對與絕對定量 (Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)結構 ............................................................................... 17 圖 13 iTRAQ 分析流程圖 .............................................................................. 18 圖 14 細胞外感染性動態變異圖 ................................................................... 19 圖 15 受 HCV 感染(Infection)及控制組(Mock)細胞株成長速率比較圖 ... 20 圖 16 受 HCV 感染 Huh7.5-SEAP 細胞株不同階段示意圖 ....................... 21 圖 17 運用 iTRAQ 化學標定分析 C 型肝炎病毒感染從急性到慢性不同階段之差異蛋白質體研究實驗流程圖 .............................................................. 22 圖 18 質譜掃描示意圖 ................................................................................... 37 圖 19 牛血清蛋白(BSA)標準溶液校正曲線圖 ............................................ 40 圖 20Agilent 3100 OFFGEL Fractionator 參數變動圖 ................................ 43 圖 21 強陽離子交換層析分離圖 ................................................................... 46 IV.

(7) 圖 22 鹼性逆相層析分離圖 ........................................................................... 49 圖 23 三種分離策略不重複胜肽在各管分布長條圖 ................................... 50 圖 24 三種分離策略下鑑定到的蛋白質與不重複胜肽 ............................... 51 圖 25 五組相鄰兩天數 iTRAQ 標記蛋白質分布圖 ..................................... 54 圖 26 相同天數不同組間 iTRAQ 標記蛋白質分布圖 ................................. 56 圖 27 第三組 iTRAQ 標記第 30 天(Declined stage) GO 分析路徑圖及圓餅圖 ...................................................................................................................... 58 圖 28 第三組 iTRAQ 標記第 81 天(Silencing stage) GO 分析路徑圖、圓餅圖及橫條圖 ...................................................................................................... 59. V.

(8) 表目錄表 1iTRAQ 標記不同天數的 Huh7.5-SEAP 細胞株 .................................... 21 表 2 強陽離交換層析梯度表 ......................................................................... 30 表 3 鹼性逆相層析梯度表 ............................................................................. 32 表 4 超高效能液相層析梯度表 ..................................................................... 35 表 5 Bradford Protein Assay 定量蛋白質結果 .............................................. 41 表 6 五組相鄰兩天數 iTRAQ 標記鑑定到蛋白質與胜肽總數目............... 52 表 7 第三組(Day30,81)iTRAQ 標記定量蛋白質結果 ................................. 66. VI.

(9) Abstract Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most prevalent and mortal cancer in the world, and 20% to 30% of patients with chronically hepatitis C virus (HCV) lead to liver cirrhosis and liver cancer. Most infected acute HCV people develop chronic HCV easily. Due to genetic variability of HCV, the development of antiviral drugs and vaccines becomes a real challenge. In this study, naïve Huh7.5-SEAP cells were established and infected by hepatitis C virus, then isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) was applied to investigate protein profiles in acute and chronic infections. The iTRAQ labeled peptides were fractionated by solution isoelectric focusing (sIEF), strong cationic exchange chromatography (SCX) and basic reverse phase chromatography (bRP) column, followed by nano-LC tandem mass spectrometric analysis. Two-dimensional liquid chromatography technique that employed on iTRAQ labeled peptides provided results with excellent complementarity and orthogonality. In the study, the differentially expressed proteins were found to be associated with RNA binding, extracellular exosome, melanosome and ribonucleoprotein complex binding. Besides, selected correlated proteins will be confirmed and validated by Western blot in the future, they could serve as novel diagnostic biomarkers for hepatitis C virus infection. Keywords, hepatitis C virus (HCV), proteomics, iTRAQ, LC-MS/MS. VII.

(10) 中文摘要肝癌屬於世界上較為普及且致命的癌症之一，約 20-30%的慢性 C 型肝炎(HCV)患者容易病變為肝硬化或肝癌。大多數急性 C 型患者容易轉變成慢性 C 型肝炎，長期存在於肝臟中，且無明顯病徵。C 型肝炎雖然有藥物治療可以醫治，但因存在較大的遺傳變異性，目前仍無疫苗可以防範。本實驗中使用 Huh7.5-SEAP 細胞株作為樣品，比較急性到慢性不同天數受到 C 型肝炎病毒感染的蛋白質和未受到感染的控制組，進行同重元素相對與絕對定量(iTRAQ)搭配串聯式質譜儀進行分析。藉由二維液相分離，等電點聚焦法(sIEF)，強陽離子交換層析法(SCX)和鹼性逆相層析法(bRP) 分離已被 iTRAQ 標記的胜肽，降低樣品的複雜性，也可藉由不同分離方法提供互補性和正交性，鑑定到更多的蛋白質。利用 Gene Ontology (GO) 軟體分析從急性到慢性差異蛋白質的生物路徑及功能，在本次實驗中發現的差異蛋白與 RNA 結合、胞外外切體、黑素體和核糖核蛋白複合物結合形成生物路徑有關，未來通過西方墨點法進行方法驗證，尋找能辨別從急性到慢性 C 型肝炎病毒的標記蛋白質。關鍵字: C 型肝炎病毒、蛋白質體學、同重元素相對與絕對定量、串聯式液相層析質譜儀. VIII.

(11) 縮寫 Hepatitis C virus, HCV Multidimentional protein identification technology, MudPIT Reverse phase, RP Immobiline™dry strip, IPG strips Isoelectric point, pI。 Electrospray ionization, ESI High performance liquid chromatography, HPLC Peptide mass fingerprinting, PMF Peptide fragment fingerprinting, PFF Mass-to-charge ratio, m/z Chemical ionization, CI Electron ionization, EI Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI Collision-induced dissociation, CID Pulsed Q collision induced dissociation, PQD Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC Isotope-coded affinity tags, ICAT Tandem mass tags, TMT™ Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ Secreted alkaline phosphatase, SEAP. IX.

(12) 第一章序論第一節 C 型肝炎病毒(Hepatitis C virus) 依據世界衛生組織(World health organization, WHO)於 2016 年的資料顯示，全球目前有 1.3 到 1.5 億人受到慢性 C 型肝炎病毒的感染，占全世界人口數 2%，每年約有 70 萬人死於與 C 型肝炎相關的疾病[1]。C 型肝炎感染者從急性到慢性感染期間表現病徵並不明顯，時常在病變後才被發現早已成為感染者，慢性患者容易誘發病變成肝硬化、肝癌，容易致死的疾病圖. 1 肝臟受 C 型肝炎感染病變為肝癌之過程。. 圖 1 肝臟受 C 型肝炎感染病變為肝癌之過程. 目前治療方法使用索非布韋（Sovaldi）或是司美匹韋（Olysio）藥物治療，大約有 90%可被治癒[2]，然而價格昂貴，且目前仍無疫苗預防 [3, 4]。 HCV 屬於黃熱病毒科擁有脂質外套的單股 RNA 病毒，直徑約 30-50 nm，基因體長約 9600 個核醣核酸。C 型肝炎病毒基因容易突變，造成基因型態的上有很大的差異，主要可分為 6 種基因型態（genotypes 1-6），每種基因型態還可區分成數十種亞型（subtype）。於宿主細胞內病毒基因經由轉譯後形成一段蛋白，此段蛋白在宿主及病毒本身不同蛋白質水解酶作用下裂解為結構性蛋白 core protein、E1、E2 和非結構性蛋白 NS1、 NS2 、 NS3、NS4A、NS4B、NS5A 以及 NS5B[5]，如圖 2 所示。. 1.

(13) 圖 2C 型肝炎病毒基因型. HCV 可能引發急性和慢性感染，通常以感染後病毒存在於體內的時間長度做為區分。. 壹、急性 C 型肝炎(Acute infection) 在 HCV 急性感染者中，感染初期通常沒有症狀，或是只出現像是發燒、疲倦和噁心等較輕微的症狀[6]，少數情況才會導致危急生命的猛爆性肝炎，因此診察不易，難以在第一時間發現，約有 15-45%急性感染者會自行痊癒，大多數 55-85%的感染者會演變為慢性 C 型肝炎，並長時間寄宿在於人體肝臟中[7]。. 貳、慢性 C 型肝炎(Chronic infection) 慢性 C 型肝炎感染者中，定義為受到感染後至少六個月的時間內仍被檢驗到有病毒複製存在於體內的情況[8]。這段期間可能沒有或只有輕微症狀，但病毒仍持續損害肝臟，肝臟處於長期發炎的狀態，經年累月下演變為肝纖維化，最後容易病變形成肝硬化及肝癌[9]。. 第二節液相層析分離技術串聯式質譜儀在解析度及數據採集速度上近年來有明顯的進步，儼然 2.

(14) 成為蛋白質體學主力的研究工具之一。由於生物樣品擁有高度複雜性，且蛋白質之間濃度差距甚大，像是血液、體液、細胞液等相關生物樣品，蛋白質經過酵素酶水解形成胜肽之後，更加複雜，會使在生物樣品中的低含量胜肽被高含量的胜肽所遮蔽，減少低含量胜肽被質譜儀鑑定到的機會，若只有一維的液相層析分離，無法有效降低生物樣品的複雜性，被偵測到的蛋白質數量有限，無法觀測到低含量的蛋白質，然而這些低含量蛋白質往往在生物體內扮演不容忽視的角色。因此開發出多維蛋白質鑑定技術 (Multidimentional protein identification technology, MudPIT)[10, 11]大幅提升胜肽解析度，依照蛋白質不同特性，例如，極性、帶電電荷、電荷大小、親疏水性、等電點等，利用不同分離特性的層析管柱，進行有效的分離，增加蛋白質被鑑定到的機會。液相層析系統連接質譜儀可分為在線(On-line) 和離線(Off-line)裝置[12, 13]，在進行第一維的液相層析分離分析時，在線裝置會直接送到下一個維度分離，而離線裝置則是依照第一個維度分離特性已經初步分離的胜肽各別蒐集起來後，經過濃縮乾燥、去鹽、回溶前處理，再進入第二個維度分離，兩者皆可增加分離胜肽的效果，提升解析度，降低生物樣品的複雜性。在線裝置比起離線裝置來說，需要兩台液相層析系統儀器，但能縮短分離時間，需要樣品量可以較少，分析穩定性較差；離線裝置有較廣泛的分離方法可供選擇，可依照分離管柱的不同更換合適的動相溶液，蒐集的分管數目不受限制，只需要一台液相層析系統，但在分管過程中會有樣品受到損耗及汙染的可能。. 壹、逆相層析法相較於正相層析為低極性溶液不易溶解水溶性樣品，現今逆相層析法更被廣泛運用於分離生物樣品[14]，常應用在樣品純化、去除小分子雜質鹽類、分析樣品。一般而言，使用層析管柱進行分離，管柱內層含有固定 3.

(15) 的靜相，用於吸附待測物，之後改變移動相增加非極性緩衝液比例，使非極性緩衝液與樣品競爭，將樣品沖提出來。靜相使用二氧化矽作為基底，帶有矽醇基團(Si-OH)的官能基，可與長碳鏈烷基 C8 或者 C18 形成鍵結，取代-OH 上的氫，成為非極性的靜相，然而仍然有未經修飾反應的矽醇基，帶有負電，會與胜肽上的正電胺基反應，造成層析圖譜中見到訊號峰脫尾 (tailing)的情況，改善方法為加入小分子的三甲基矽烷(-Si(CH3)3)，與未反應的矽醇基作用，形成 end-capped[15]，如圖 3 逆相層析法 C18 靜相結構，不只可以減少矽醇基與胜肽反應，也可以延長層析管柱的使用期限。此次實驗中運用到逆相層析管柱為胜肽樣品進行分離與純化去鹽。. 圖 3 逆相層析法 C18 靜相結構. 4.

(16) 圖 4 逆相層析實驗原理示意圖. 圖 4 逆相層析實驗原理示意圖 (a)將需純化的胜肽樣品進樣至含有 C18 靜相的管柱中 (b)C18 靜相開始分離鹽類與雜質及抓取純化樣品 (c)胜肽屬於較低極性的物質，會與低極性的靜相產生作用力，黏附在靜相上，較具極性的鹽類和其他雜質則會隨著較高極性的水相流出管柱，被抓住的胜肽則依然留在靜相 (d)之後增加低極性溶液在動相的比例，使低極性樣品能隨著高極性動相溶液一起被沖提出來。. 一、鹼性逆相層析法此方法原理與一般逆相層析管柱相同，但為了得到更好的分離效果，選擇優化二維層析管柱的動相 pH 值，運用離線裝置(Off-line)在第一維度中提高移動相溶液的 pH 值，使鹼性胺基酸在鹼性移動相溶液呈中性，增加與靜相管柱的吸附力，再進入第二維度擁有較低或較中性的 pH 值完成 5.

(17) 樣品分離，運用 pH 值的差異，可以提高樣品的分離效率，而在過去的文獻中，二維逆相層析管柱(RP-RP)都展現出良好的正交性[16-18]。因此選用此方法作為本次實驗三種分離方法之一，用來分離高複雜性的 HCV 樣品。. 貳、液相等電點聚焦法蛋白質由各類不同的胺基酸組成，有許多帶電荷的基團，它是兩性分子，胺基酸上的殘基、羧基和胺基會帶有電荷，所帶的淨電荷，會隨著環境的 pH 值改變而跟著變化，如圖 5 所示。. 圖 5 胺基酸在不同 pH 值的解離狀態. 兩性離子(Zwitterion)在適當 pH 值環境下，會產生胺基酸表面總電荷為零的情況，此時則達到等電點(Isoelectric point, pI)，因此利用不同種蛋白質或胜肽的等電點(Isoelectric point, pI)會有所不同去進行分離。此方法可運用到具有 pH 值梯度的膠條，它可將特定範圍 pH 值固定在膠條上，當膠條兩端加上正負電極，通入直流電流後，胜肽或者蛋白質就會因靜電荷不平衡受電流影響而開始移動，直到移動到特定 pH 值，也就是胜肽靜電荷為零到達等電點，就會聚焦停留在特定的位置[19]。此次實驗使用 Agilent 3100 OFFGEL Fractionator，能夠在液態情況進行等電點分離，且可回收液態樣品，方便進入後續 LC-MS/MS 偵測，圖 6 為 Agilent 3100 OFFGEL Fractionator 簡易操作示意圖. 6.

(18) 圖 6Agilent 3100 OFFGEL Fractionator 簡易操作示意圖. (a)先將格子固定後，並用溶液均勻填入格子(Well)使 IPG gel strips 活化。 (b)調配好的樣品均勻注入所有的樣品格子，蓋上密封條(Cover seal)於樣品槽上，防止水份的揮發。(c)通電後，蛋白質或胜肽分子會在 IPG gel strips 上移動，直到停止在各自等電點的位置。(d)分離後的蛋白質或胜肽分子溶液，蒐集於膠條上方樣品格內，液態樣品可方便取出並用於下游的實驗應用[20]。. 參、離子交換層析法(Ion exchange chromatography, IEC) 依據待測物不同的電性、電荷大小和電荷數目與靜相正負電荷相互吸引形成離子鍵，達到分離的一種方法。藉由移動相緩衝溶液，改變胺基酸周圍的環境，使胺基酸小於或大於等電點，讓胺基酸帶電，被帶有相異電 7.

(19) 荷的靜相吸引住，就能有效分離待測物。蛋白質樣品通常以離子鍵吸附，因此要沖提出樣品時，必須提高鹽濃度以破壞離子鍵結或者改變動相緩衝液的 pH 值，使得蛋白質的電荷改變而溶離出來，一般多使用前者[21]。離子交換層析法通常依電性分為兩類：陽離子交換層析法和陰離子交換層析法，陽離子交換層析法使用經解離後帶有負電的官能基團(－R－SO3H, －PO2H2, －COOH, －OH)作為交換樹脂，與帶有正電荷的胜肽形成鍵結，而後者則使用會帶有正電的官能基團([－N+(CH3)3], [－N(CH3)2], [－NH2]) 作為交換樹脂與帶有負電荷的胜肽結合，通常依照樣品需求，選用適合的離子交換樹脂。. 一、強陽離子交換層析法如圖 7 強陽離子交換實驗原理示意圖: (a)如果被純化的物質是大分子胜肽，分子上的淨電荷就會和胺基酸的等電點和溶液的 pH 值有關，當緩衝溶液的 pH 值較小，會使大部分胺基酸分子帶正電荷(b)帶正電的胜肽分子就會鍵結在強酸性的陽離子交換樹脂上(c)由於鹽類是強電解質，增加移動相鹽類濃度即可破壞胜肽與強離子交換樹脂之間的離子鍵結，胜肽分子就會依照與交換樹脂結合力強弱，由電荷弱到強胜肽依序被洗出。. 8.

(20) 圖 7 強陽離子交換實驗原理示意圖. 二維液相層析中，強陽離子交換層析法是很常被使用到的一種方式[22, 23]，藉由兩種不同原理分離，先電荷強弱再由極性高低，可以得到良好的分離效果，鑑定到更多蛋白質。本次實驗中，選用此方法作為第一維度分離方法之一。. 第三節蛋白質身分鑑定蛋白質經由水解後形成胜肽，進入質譜儀產生帶電前驅離子，前驅離子碎裂後形成產物碎片離子，並形成質量碎片圖譜，碎片離子後命名如圖 8 所示。. 9.

(21) 圖 8 胜肽離子碎片形式. 以胺端(N-terminal)開始算起為 a、b、c 系列離子，以羧端(C-terminal)開始算起為 x、y、z 系列離子，數字代表碎片離子上胺基酸支鏈的數目。胜肽樣品容易斷裂在鑑結較弱的胜肽鍵也就是醯胺鍵(Amide bond)上，所以通常是斷在 b, y 的位子。剛開始蛋白質鑑定使用 Edman degradation[24]，使用化學試劑與胺基酸的胺基進行反應，但是若碰到胺基上有修飾其他化學基團或者有半胱胺酸(Cysteine)，則試劑無法修飾於胺基上，需移除修飾才可使用試劑，另外，此法又稱為起始定序法(de novo Sequencing)[25]，藉由碎片數據，組合出胜肽序列，偵測到的胺基酸長度有限。因此現今多用其他方法，搭配電腦資料庫定序[26]，經由理論計算比對出最合乎真實的蛋白質序列，而目前主要演算法有兩種，胜肽質量指紋(Peptide mass fingerprinting, PMF)與胜肽碎片指紋(Peptide fragment fingerprinting, PFF). 壹、胜肽質量指紋(Peptide mass fingerprinting, PMF) 蛋白質經由特定水解酶像是(Trypsin)水解後，會斷裂在胜肽序列特定 10.

(22) 的位置上，切點在 Arginine、Lysine 的羧基端，水解後的胜肽會因為胺基酸的組合不同產生質量上的差異，這些質量上的差異好比人類指紋般，都是獨一無二的，藉由搜尋引擎及資料庫的對比，以統計的方法找出最有可能為此段胜肽序列的蛋白質[27]。. 貳、胜肽碎片指紋(Peptide fragment fingerprinting, PFF) 當在面對高複雜性樣品時，PFF 比起 PMF 有更好的準確性，通常搭配串聯式質譜儀，經由惰性氣體撞碎後得胜肽離子碎片圖譜，通常離子碎片具有一定的規則質量，故經由電腦資料庫的比對，可以鑑定到對應的蛋白質。此方法，PFF 資料庫中的蛋白質序列由基因序列轉譯而來，相較於起始定序法(de novo Sequencing)藉由胺基酸排列組合得到胜肽序列，更為準確，因為自然界中真實存在的蛋白質序列只占全部胺基酸排列組合的一小部份，大部份的胺基酸排列組合序列並不會存在於真實樣品中，因此 PFF 提高了準確性，現今大部份都使用此方法[28]。. 第四節質譜儀技術質譜儀主要有五個元件組成，分別為進樣區(Sample inlet)、游離源(Ion source)、質量分析器(Mass analyzer)、偵測器(Detector)、資料處理系統(Data analysis)。圖 9 質譜儀常見的各元件儀器示意圖箭頭為樣品依序進入各元件順序，進入儀器內部偵測器皆需於真空環境下操作，下方各項目標示為常見的例子，由於本實驗目的在於分析胜肽樣品，軟體部分為使用生物相關資訊軟體搜尋蛋白質。. 11.

(23) 圖 9 質譜儀常見的各元件儀器示意圖. 為了不讓樣品被外界雜質干擾，離開進樣區後進入儀器內需保持真空，之後利用電場導引將樣品導入至質譜儀，游離源開始將樣品游離化，轉換成有不同電荷大小和質量的質荷比(Mass-to-charge ratio, m/z)帶電離子，利用電位差的不同將帶電離子吸引到質量分析器中，由於電場和磁場作用力的影響下，將帶有不同質荷比的離子於空間或時間上進行分離，將分離的離子送到偵測器偵測，得到圖譜，經由電腦統計資料處理系統比對，便可知道其鑑定結果。對於蛋白質、胜肽大分子樣品，若接收高能量或高溫下游離，容易造成生物樣品降解損壞，通常分子量大沸點高樣品較不適用傳統電子游離法 (Electron ionization, EI)[29]和化學游離法(Chemical ionization, CI)[30]。在 2002 年諾貝爾化學獎頒給發展軟式游離法的兩位專家，一位是 Koichi Tanaka ，發明的基質輔助雷射脫附游離法 (Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)[31]，在樣品中加入基質，可輔助大分子能夠被完整游離出來，保持完整結構進入儀器內分析，另一位學者是 John Bennett Fenn 發明的電噴灑游離法(Electrospray ionization, ESI)[32]，此次實驗中使用 ESI 的方法，優點是同為液態溶液與 HPLC 結合使用便利，奈米級液相層析儀因管徑較小，較不易擴散以利提升靈敏度，此兩項游離法使 12.

(24) 生化大分子能夠藉由質譜儀被鑑定出來。. 壹、電噴灑游離法(Electrospray Ionization, ESI) 溶液分析物於 HPLC 毛細管內，經由毛細管噴灑的那一端施加高電壓，與外界產生電位差，溶液內部因電場產生電荷分離，電荷之間的排斥力抵消液體的表面張力，使得液滴拉長達成平衡，形成泰勒錐(Taylor cone)[33]，當電荷斥力大於表面張力時，就會噴灑出帶電的為小液滴，這些小液滴會在飛行過程中揮發，過程中部份脫附出小液滴，分裂為更小的液滴，又或者體積變小但內部電荷不變，電荷斥力越來越大，當電荷斥力大於液滴表面張力時就會生成庫倫爆炸(Coulomb explosion)[34]，它會不斷重複上述的原理最終成為帶有多價電的氣體分子離子利用壓力及電場不同進入質量分析器中，圖 10 電噴灑游離過程示意圖。. 圖 10 電噴灑游離過程示意圖. 貳、線性離子阱(Linear ion trap, LIT) 傳統三維離子阱為了有較好的解析度，會限制捕捉離子的數量，只能抓到百萬個離子，只為了突破此限制，在四極柱水平方向 Q1 和 Q3 加入電場將離子束縛起來，增加離子被捕捉的機會可捉到千萬個離子，不僅維持住解 13.

(25) 析能力，還大大的提升效率[35]。但此離子阱無法與三段四極桿柱相連接， Hager 等人改良原本的離子阱，將三段四極桿柱原理和融入到離子阱中，二維線性離子阱誕生[36]。本次實驗用到是時間上串聯式質譜儀 LTQ XL (Thermo Fisher, San Jose, CA) 利用在同一空間中不同時間點進行全掃描、前驅離子篩選、誘導解離和產物離子掃描，由於離子阱可以累積特定質荷比的前驅離子數量，儲存在離子阱內進行碰撞解離，上述步驟不斷重覆動作即為 MSn。圖 11 LTQ XL 儀器裝置構造圖如下所示，. 圖 11 LTQ XL 儀器裝置構造圖. 首先經過游離源游離化的帶電樣品由離子轉移管進入到儀器內部，來到四極桿柱 Q0 與八極桿柱 Q1 離子導管去除中性物質和雜質，將帶電離子導入到離子阱，離子阱主要結構由一對蓋電極(End cap electrode)和一對環電極 (Ring electrode)組成，兩電極相互垂直於 X、Y 軸，分別施加射頻電壓(RP) 和直流電壓(DC)，形成交互作用的電場，延著 Z 軸方向，離子阱又分為三個區塊，主要由第二個區塊進行分析，經由兩垂直的電壓形成的電場被束縛在離子阱內，調控 RF 值大小，產生特定頻率的振動軌跡，捕捉特定質荷比的前驅離子(Precursor ions)與惰性氣體氦氣進行碰撞生成產物離子 (Product ions)，最後調控射頻電壓與交流電壓(AC)，使產物離子經由電壓 14.

(26) 影響，質荷比由小到大由兩側分離出來，兩端偵測器接收離子得到訊號。線性離子阱相較於三維離子阱能捕捉到更多的帶電離子，內部儲存到的離子數目更多且有兩個偵測器可幫忙同步分析，不僅可以提升訊號強度還可以增加靈敏度。此次實驗用到兩種撞碎方法一種為碰撞誘導解離 (Collision-induced dissociation, CID)[37] 和脈衝碰撞誘導解離 (Pulsed Q collision induced dissociation, PQD)[38]前者為了使前驅離子能有更大的動能與離子阱內的氦氣發生碰撞，給予前驅離子施加交流電壓，誘導解離碎裂成產物離子。然而在使用 CID 進行撞碎後，所有前驅離子小於三分之一分子量所產生的產物離子(1/3 low mass cut-off)，無法穩定的儲存在離子阱中，也就無法被偵測到，為了補足此限制，而開發出後者 PQD。PQD 可分為三個步驟: (1) 施加比 CID 多 6 倍的能量值，使前驅離子被共振激發(2)短時間內(0.3 ms) 與惰性離子發生碰撞，將動能轉位能，卻不發生解離(3)降低 Q 值，可讓小分子量離子能被穩定儲存於內部空間，更能被偵測到，此法常用於 iTRAQ 標記的樣品分析，為了要偵測到帶有低分子量的報導基團，得到定量資訊，缺點是由於碰撞解離能量較低，無法碎裂完全，若是用於蛋白質鑑定，效果沒有 CID 來的好。. 第五節差異蛋白質體學(Differential proteomics) 隨著 2003 年人類基因定序計劃完成，發現人類基因序列中的基因數量並沒有想像中的多，只有三到四萬基因數目而已，因此許多生物功能是由基因轉錄為 mRNA，之後在轉譯成蛋白質，有些蛋白質會額外修飾官能基團後，才可表現出功能及特性。質譜儀分析蛋白質技術不斷的開發與進步再加上電腦整合運算能力的大幅提升，高效能鑑定蛋白質成為使得蛋白質體學能夠蓬勃與快速發展。蛋白質體(Proteome)於 1994 年澳洲遺傳學家 Marc 15.

(27) Wikins 提出[39]，是相對於基因體(Genome)的定義是某種生物中所有的基因總稱，蛋白質體則是生物依據基因體表現出來的所有蛋白質的集合總稱，而蛋白質體學(Proteomics)[40]泛指所有蛋白質相關大規模的研究，像是蛋白質的身份鑑定、修飾位點鑑定、表現含量測定、分布位置和蛋白質之間的交互作用等等。研究蛋白質的表現含量，定量分析可獲得蛋白質在不同生理條件或者不同環境下是否因含量的差異而影響生物體反應機制，了解到特定蛋白質在生物系統中是否扮演著重要的功能及反應機制。. 壹、穩定同位素標定(Stable isotope labeling) 近代憑藉著奈米級液相層析技術搭配質譜儀 (Nanoflow liquid chromatography mass spectrometry, nano-LC MS)，大幅提升蛋白質的分析上的靈敏度及高通量，雖然無法用肉眼直接判斷出含量多寡，但卻增加了蛋白質定量的準確性，蛋白質定量標定常運用酵素或同位素化學試劑標記於樣品中，藉由進入質譜儀進行比較分析。. 一、代謝物標定(Metabolic labeling) 細胞培養胺基酸穩定同位素標記(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC)[40]在活體細胞內(in vivo)加入含同位素的培養液或胺基酸，經過數代培養後吸收代謝，產生含有同位素的標定蛋白質，與實驗控制組沒有標記樣品混合，同一段胜肽中因不同樣品被標記同位素，在質譜圖中會形成差異，質譜訊號強度呈現胜肽表現含量，因此可比較出相對含量，然而此方法只適用於細胞標定，無法用於組織或體液上。. 二、酵素標定(Enzymatic labeling) 蛋白質水解降解成胜肽時需要酵素酶進行反應，也可以同時進行標定， 16.

(28) 利用含有 16O 或 18O 的水分子，分別加入需要比較的兩種不同樣品中，蛋白質水解時會將溶液中的 16O 或 18O 置換至水解的胜肽羧基上，混和樣品後進入質譜進行分析比對，因為羧基上有兩個氧原子，在質譜圖上會造成 4 Da 的差異，十分便利方便，缺點是只適用高解析質譜儀，當胜肽帶有二或三價電荷時 4 Da 的差距會被縮小為 2 和 1.3 Da，差異太小會與樣品本身的同位素難以區分，另一個缺點是. 16. O 和. 18. O 會產生逆交換(Back-. Exchange)，結構會影響交換速率，造成質譜圖分析更加困難[41, 42]。. 三、化學標定(Chemical labeling) 目前最常使用的定量方法之一，將帶有不同同位素的化學試劑與胜肽樣品進行標記反應，就好像用不同標籤般標記的每個樣品，市面上常看見的市售化學試劑有同位素編碼親和標籤 (Isotope-coded affinity tags, ICAT)[43]、串聯質譜標籤(Tandem mass tags, TMT™)[44]和同重元素相對與絕對定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)[45]等等。本次實驗中使用的是 iTRAQ 4-plex 試劑，主要結構由三部份的基團組成如圖 12，. 圖 12 同重元素相對與絕對定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)結構 17.

(29) 第一部份 114-117 m/z 報導基團(Reporter group)依不同種同位素組合，產生質量差異於質譜圖中可辨別不同種樣品，經由 MS/MS 掃描後利用報導基團訊號強度大小進行定量；第二部份為平衡基團(Balance group)相對分子質量為 31-28 m/z 用於當胜肽樣品與 iTRAQ 試劑結合時，各標記樣品擁有同段的胜肽序列並獲得等重質量 145 m/z，優點是進入質譜做第一次 MS 掃描時，可加強訊號強度，使質譜儀能偵測到已標記的胜肽片段前驅離子訊號：第三部分為胜肽反應基團(Peptide reactive group)會與胜肽的胺端(Nterminal)和離胺酸(Lysine)做結合。實驗過程如下，先將水解過的胜肽樣品分別加入不同同位素的 iTRAQ 試劑，進入質譜儀中，剛開始的 MS 掃描由於同重標記，只會看到相同前驅離子不同同位素的樣品因平衡基團只會顯示出一個特定的強大訊號，質譜會選定較強大的訊號進行撞碎，此時報導基團與中性平衡基團斷裂，因平衡基團不帶電不會被偵測到，而之後得到的 MS/MS 圖譜會包含某段胜肽序列的產物離子訊號及不同樣品中的報導基團，就可以得到每個樣品間的含量差異進行比較分析，經由電腦資料庫的比對鑑定到所屬蛋白質，如圖 13 所示。. 圖 13 iTRAQ 分析流程圖. 18.

(30) 第六節西方墨點法(Western blot). 第七節研究動機於 1989 年 Qui-Lim Choo 與 George Kuo 等人從血清中分離出非 A 非 B 型肝炎病毒，確認 C 型肝炎病毒的存在[46, 47]，研究至今已開發多款藥物可進行治療，然而治療藥物價格昂貴，C 型肝炎病毒基因變異性較大，尚未開發出可有效防範之疫苗，未能確切瞭解 C 型肝炎從急性到慢性期間實際運作情況，形成目前研究上的阻礙。本實驗使用已發表於期刊中成功大學楊孔嘉老師實驗室基醫所學生蔡佩汝培養擁有高靈敏可偵測報導 HCV 活性的 Huh7.5-SEAP 細胞株，此細胞株可模擬 HCV 感染患者，演繹從急性到慢性這段期間感染過程，得知病毒活性差異、不同階段成長速率及受感染後病毒含量的變化[48]，圖 14 圖 15 皆為成功大學楊孔嘉老師實驗室基醫所學生蔡佩汝所作。圖 14 細胞外感染性動態變異圖，可見在 Exponential(E)階段下動態範圍為最高， Plateau(P)階段有較平穩的感染性，最後在 Silencing(S)階段下，感染性不明顯且數值較低，在最後 Chronic(C) 階段只有微幅被偵測到。. 圖 14 細胞外感染性動態變異圖 19.

(31) 圖 15 受 HCV 感染(Infection)及控制組(Mock)細胞株成長速率比較圖，此圖顯示不同階段下有不相同的成長速率，初始 Exponential(E)及 Plateau(P) 受 HCV 感染階段比起未受感染控制組慢將近三分之一倍的生長速率；在 Declined(D)階段於第四週時受感染細胞株成長速率最為緩慢；Silencing(S) 階段受感染細胞株成等速率成長，但對於控制組而言，成長速域仍是比較慢；Chronic(C)階段不論是受感染或未受感染的細胞株皆呈現相同速率成長。. 圖 15 受 HCV 感染(Infection)及控制組(Mock)細胞株成長速率比較圖. 再搭配 iTRAQ 技術，能定量比較相同細胞株在不同時期蛋白質含量變化，藉由同位素標記受感染的生物樣品及未受感染的控制組，使樣品間能相互定量比較，找出於不同時期中表現較明顯的差異蛋白及生物途徑。為了能更深入研究 C 型肝炎的機制及蛋白質的運作和從急性到慢性這段期間受 HCV 感染的細胞蛋白質含量變化差異，因此選擇分別培養至第 8 天(Exponential)、第 16 天(Plateau)、第 30 天(Declined)、第 81 天(Silencing)、第 112 天(Chronic)，從急性到慢性這段期間五種階段細胞株萃取樣品，如圖 16 所示:. 20.

(32) 圖 16 受 HCV 感染 Huh7.5-SEAP 細胞株不同階段示意圖. 使用 iTRAQ 4-plex 試劑與鄰近兩天數樣品分為五組定量相互比較，以及受到 C 型肝炎病毒感染的樣品標記為(IN)和相同天數培養下無感染 C 型肝炎病毒的控制組細胞株標記為(HS)進行比較，如表格中所示: 表 1iTRAQ 標記不同天數的 Huh7.5-SEAP 細胞株. 由於最近幾年期刊報導 iTRAQ 4-plex 比起 iTRAQ 8-plex 與 TMT 有更好的再現性與蛋白質涵蓋率(Coverage)[49, 50]，且有較小的偏差值，因此選用 4-plex 此試劑作為標記，搭配奈米級液相層析串聯質譜儀技術，分析 HuH7.5-SEAP 細胞株，模擬受到 C 型肝炎感染的細胞，為了降低樣品複雜性，在第一維度分離時選用 SCX、sIEF 和 bRP 三種不同分離策略分離，進入 LC-MS/MS 得到圖譜數據，在運用生物軟體進行分析，期望尋找出急性和慢性感染間的差異蛋白質，作為生物標記蛋白質 (Biomarker proteins)，圖 17 運用 iTRAQ 化學標定分析 C 型肝炎病毒感染從急性到慢性不同階段之差異蛋白質體研究實驗流程圖。. 21.

(33) 圖 17 運用 iTRAQ 化學標定分析 C 型肝炎病毒感染從急性到慢性不同階段之差異蛋白質體研究實驗流程圖. 22.

(34) 第二章實驗材料與方法第一節樣品來源為即時偵測病毒在細胞中的活性，實驗細胞株使用外源性報導蛋白系統－分泌性鹼性磷酸酶 (Secreted alkaline phosphatase, SEAP)為基礎設計一段 HCV 專一性 SEAP 報導蛋白 (EGFP-△4AB-SEAP protein)。故我們將 Huh7.5 細胞株的染色體中外加 HCV 專一性 SEAP 報導蛋白基因，在抗生素 2 ug/mL BSD 長期篩選下留下的細胞，最後定名為 Huh7.5-SEAP 細胞株。 SEAP 報導蛋白的偵測機制是：SEAP 報導蛋白中的Δ4AB 胜肽序列來源是 HCV polyprotein 連結 NS4A 和 NS4B 蛋白的片段。實驗設計Δ4AB 胜肽序列兩端連接 SEAP 與綠螢光蛋白(Enhancement green fluorescence protein, EGFP)。當細胞受 HCV 感染後，HCV 會產生能切割Δ4AB 胜肽序列的 NS3/4 蛋白酶。SEAP 報導蛋白經由 NS3/4 蛋白酶切割，分泌性鹼性磷酸酶 (Secreted alkaline phosphatase, SEAP)片段將分泌至胞外。故藉偵測胞外的分泌性鹼性磷酸酶片段活性，可得知 HCV NS3/4 蛋白酶的活性，間接得知 HCV 於細胞內的表現。肝臟中也會產生鹼性磷酸酶，為了避免與實驗中的報導蛋白產生混淆，導致假陽性的結果，實驗中使用之分泌性鹼性磷酸酶是取自胎盤細胞的鹼性磷酸酶的部分片段。由於胎盤細胞的鹼性磷酸酶比肝臟來源的更能耐高溫 (65°C)，因此可以利用加熱法移除來自肝臟的鹼性磷酸酶，僅留下實驗用之報導分泌性鹼性磷酸酶以偵測活性。 23.

(35) 本次實驗樣品提供來自國立成功大學醫學檢驗生物技術學系楊孔嘉老師實驗室，總共 10 種樣品，分別為：受到 HCV 感染的 Huh7.5-SEAP 細胞株第 8、16、30、81、112 天的樣品以及各天數未受感染的控制組，所有組別的細胞都經由 Lysis buffer (0.5 M TEAB, 0.05% SDS, and protease/phosphatase inhibitors) 溶解，取得的蛋白質溶液再由蛋白質定量法 (Bradford Protein assay) 測定總蛋白質濃度，保存於-80°C 冰箱中。. 第二節樣品純化濃縮壹、材料與儀器設備 1.. Amicon® Ultra-0.5 Centrifugal Filter, 3kDa（Millipore）. 2.. 微量分析天平(METTLER TOLEDO, EL20). 3.. 桌上型離心機(FOCUSBIO, pc-200). 4.. 超純水系統(Millipore Direct-Q3). 5.. 超高速低溫離心機(Hitachi, CT15RE). 貳、實驗步驟 1. 先用 400 μL Milli-Q H2O 開膜潤洗 Amicon® Ultra-0.5 Centrifugal Filter, 3kDa（Millipore），用高速低溫離心機於 4°C，1,000 xg 離心約 2 分鐘，移除所有 H2O 置旁備用。 2. 先將初始的蛋白質樣品直接高速低溫離心機 4°C，14,000 xg 離心約 10 分鐘，取足夠量的上清液至 Amicon® Ultra-0.5 再補足 Milli-Q H2O 至體積 400 μL。 3. 秤重離心 4°C，14,000 xg 離心約 20 分鐘，丟棄下層濾液。 4. 秤重離心 4°C，14,000 xg 離心約 20 分鐘，丟棄下層濾液。 24.

(36) 5. 重覆步驟 3-4 全部總共 3 次，之後更換新的離心管將 Amicon® Ultra0.5 以 4°C，1,000 xg 離心約 6 分鐘。 6. 得到純化濃縮的樣品，取部份進行蛋白質濃度測定並推算回收率。. 第三節蛋白質濃度測定(Bradford protein assay) 壹、藥品與試劑 1.. Bovine serum albumin(Sigma-Aldrich). 2.. Coomassive Brilliant Blue G-250(Bio-Rad Laboratories Inc.). 貳、儀器設備 1.. 微量分析天平(METTLER TOLEDO, EL20). 2.. 桌上型離心機(FOCUSBIO, pc-200). 3.. 超純水系統(Millipore Direct-Q3). 4.. 多功能試管震盪器 (Scientific Industries, G-560). 5.. 可見光譜盤式分析儀 (Thermo Scientific, Multiskan FC). 參、實驗步驟 1. 配製牛血清蛋白標準液，取牛血清蛋白固體溶於 Milli-Q H2O 濃度為 10 mg/mL 作為母液，配製其下列濃度 100 μg/mL、80 μg/mL、50 μg/mL、 40 μg/mL、25 μg/mL、20 μg/mL、12.5 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、0 μg/mL，之後各取 160 μL 準備於試管中。 2. 在初始樣品中，稀釋 500 倍後取 160 μL 準備於試管中。 3. 在經過純化濃縮的樣品中，取 2 μL 加 milli-Q H2O 至 160 μL 準備於試管中。 25.

(37) 4. 將各濃度牛血清蛋白標準液及各個樣品皆為 160 μL，分別加入 40 μL Coomassive Brilliant Blue G-250，均勻震盪充分反應後靜置於桌面，總共時間約 10 分鐘。 5. 將可見光譜盤式分析儀設定 O.D.值 595 nm，將樣品及標準液各別注入 96 孔盤中，進入儀器進行偵測。 6. 用 Microsoft Excel 軟體繪製出牛血清蛋白的校正曲線，藉由吸收值與校正曲線算出樣品的濃度和回收率。. 第四節蛋白質水解（In-solution digestion）與化學標定 iTRAQTM 壹、藥品與試劑 1. iTRAQ® Reagent Multi-plex Kit (AB Sciex) Dissolution buffer: 0.5 M triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) Denaturant: 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) Reducing reagent: 50 mM tris- (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) Cysteine blocking reagent: 200 mM methyl methanethiosulfonate (MMTS) in isopropanol (IPA) 2. Sequencing grade modified trypsin (V5111) (Promega). 貳、儀器設備 1.. 多功能試管震盪器 (Scientific Industries, G-560). 2.. 桌上型離心機(FOCUSBIO, pc-200). 3.. 真空離心濃縮機 (miVAC, DUC-12060-C00). 4.. 數字型恆溫乾浴槽(Major Science, MD-02N-110) 26.

(38) 參、實驗步驟 1.. 將樣品取 100 μg 於新的試管中，使用真空離心濃縮機抽乾後，加入. 20 μL Dissolution buffer 震盪回溶。 2.. 加入 1 μL Denaturant，震盪混合均勻，使蛋白質變性為長鏈狀結構。. 3.. 加入 2 μL Reducing Reagent，震盪混合，培養在 60°C 下 1 個小時，讓. 雙硫鍵能充分反應還原。 4.. 用離心機使液體置於底部，加入 1 μL Cysteine blocking reagent，於. 37°C 反應 10 分鐘。 5.. 依據蛋白質與 trypsin 的重量比(50:1)，加入 2 μL trypsin 於樣品中，放. 在溫水浴 37°C 反應 16 小時進行水解。 6.. 取出 iTRAQ® Reagent 退冰於室溫下震盪離心，加入 70 μL Ethanol 回. 溶試劑震盪離心混合。 7.. 各別將 4 種 iTRAQ® Reagent114~117 分別加入已水解的胜肽樣品中，. 混合均勻後於室溫下 2 小時進行反應。 8.. 將已標定好的樣品均勻混合成一管，再分成三等份真空乾燥以便於後. 續實驗分析，抽乾後的樣品儲存於-20°C 冰箱。在樣品中加入 200 μL 2M TFA，在 110°C 反應 2 小時。. 第五節第一維分離策略壹、等電聚焦分級分離儀 (Solution isoelectric focusing,. 27.

(39) SIEF) 一、藥品與試劑 1.. 3100 OFFGEL Starter Kit(Agilent Technologies) OFFGEL ampholyte buffer 3-10 (GE Healthcare Bioscience AB,IPG buffer): 依據膠條選用 Glycerol solution. 2.. Cover fluid (mineral oil). 二、儀器設備 1.. 真空離心濃縮機 (miVAC, DUC-12060-C00). 2.. Agilent 3100 OFFGEL Fractionator (Agilent Technologies). 3.. Immobiline™dry strip pH 3-10, 24 cm (GE Healthcare, IPG strips). 三、實驗步驟 1. 取 5% Glycerol solution 和 IPG buffer 以 1:50 比例混合配製成 OFFGEL stock solution。 2. 調製 IPG Rehydration solution：將 0.96 mL OFFGEL stock solution 和 0.24 mL milli-Q H2O 均勻混合備用。 3. 將樣品以 0.72 mL milli-Q H2O 回溶，再加入 2.88 mL OFFGEL stock solution，確保樣品濃度大於 50 mM，總體鹽類濃度小於 10 mM。 4. 將膠條保護膠片撕下，IPG strips 朝上靠左固定於盤中。 5. 將 Frame 均勻壓於 IPG strips 上。 6. 在每一格中加入 40 μL IPG Rehydration solution 靜置等待約 15 分鐘， 28.

(40) 使膠條活化膨脹。 7. 於每一格中均勻加入 150 μL 樣品溶液，壓上密封蓋子。 8. 在 Frame 兩端各放上兩片墊片，並在墊片上加入 10 μL milli-Q H2O 9. 分別在正極端加 200 μL 和負極 400 μL 的 Cover fluid 避免樣品蒸發散失，靜止一分鐘。 10. 再加 200 μL Cover fluid 於兩端，三分鐘後，正極在補充 200 mL Cover fluid。 11. 裝上正負電極後，平穩放入儀器內，設定好實驗分析方法，即可開始分離。 12. 超過 24 小時，需更換兩端墊片並補充兩端 Cover fluid。 13. 樣品分析完成後，從 24 個格子中分別吸取出樣品，並在每一個格子中加入 150 mL 的甲醇：水：甲酸(50:49:1)溶液，回溶 15 分鐘，吸取並分別與各自樣品混合，減少樣品流失。 14. 將樣品放入真空離心濃縮機抽乾，放入-20°C 冷凍保存，以便後續實驗分析。. 貳、強陽離子交換層析法 (Strong cationic exchange chromatography, SCX) 一、材料與試劑 PolySULFOETHYL A column(2.1 x 200 mm, 5μm,300 Å ,PolyLC INC) Moblie phase A: 10 mM KH2PO4 in 25% ACN, pH3.02 Moblie phase B: 10 mM KH2PO4 in 25% ACN with 350 mM KCl, pH3.02. 29.

(41) 二、儀器設備 1.. 管柱恆溫器(Torrey Pines Sicentific, Echotherm™Co20)). 2.. 高效能液相層析系統(Agilent Technologies, Agilent series 1100). 3.. 二元幫浦(Agilent Technologies, Agilent series 1100). 4.. UV 偵測器(Hewlett Packard, G1314A). 5.. 分液收集器(Amersham Biosciences, FRAC-100™). 6.. 真空離心濃縮機(miVAC, DUC-12060-C00). 三、實驗步驟 1. 先將已用逆相層析管柱去鹽的乾燥樣品用 195 μL Moblie phase A 回溶。 2. 恆溫管柱於 37°C，設定流速 0.2 mL/min，除氣完後，依序用 100% Moblie phase A、100% Moblie phase B、100% Moblie phase A 平衡管柱，各 30 分鐘。 3. 設定濃度梯度如表 2 方法後，開啟 UV 偵測器選擇波長 214nm，設定分液蒐集器每一分鐘收一管，共 80 分鐘。表 2 強陽離交換層析梯度表. Time(min). Mobile phase A (%). Mobile phase B (%). Flow rate(mL/min). 0. 98. 2. 0.2. 15. 98. 2. 0.2. 53. 60. 40. 0.2. 60. 2. 98. 0.2. 65. 2. 98. 0.2. 66. 98. 2. 0.2. 80. 98. 2. 0.2. 30.

(42) 4. 實驗完成後，將樣品匯集成 24 管，用真空離心濃縮機抽乾，於-20°C 冷凍保存。. 參、鹼性逆相層析法(Basic reverse phase chromatography, bRP) 一、材料與試劑 Biobasic C18 column(2.1 x 150 mm, 5μm, 300 Å) Moblie phase A: 50 mM Tris-HCl in 2% ACN, pH8.52 Moblie phase B: 50 mM Tris-HCl in 80% ACN, pH8.52. 二、儀器設備 1.. 管柱恆溫器(Torrey Pines Sicentific, Echotherm™Co20)). 2.. 高效能液相層析系統(Agilent Technologies, Agilent series 1100). 3.. 二元幫浦(Agilent Technologies, Agilent series 1100). 4.. UV 偵測器(Hewlett Packard, G1314A). 5.. 分液收集器(Amersham Biosciences, FRAC-100™). 6.. 真空離心濃縮機(miVAC, DUC-12060-C00). 三、實驗步驟 1.. 先將已用逆相層析管柱去鹽的乾燥樣品用 195 μL Moblie phase A 回. 溶。. 31.

(43) 2.. 恆溫管柱於 37°C，設定流速 0.2 mL/min，除氣完後，依序用 100 %. Moblie phase A、100% Moblie phase B、100% Moblie phase A 平衡管柱，各 30 分鐘。 3.. 設定濃度梯度如下表 3 方法，開啟 UV 偵測器選擇波長 214nm，設定. 分液蒐集器每一分鐘收一管，共 80 分鐘。表 3 鹼性逆相層析梯度表. 4.. 實驗完成後，將樣品匯集成 24 管，用真空離心濃縮機抽乾，保存於-. 20°C 冷凍保存。. 第六節自製碳 18 離心管柱去鹽(C18 spin column) 壹、材料與試劑 1.. Empty macro spin column™, 20 μm filter(Hoefer). 2.. POLYGOPREP 60-50 C18(40-63 μm, 60Å , Macherey-Nagel). 3.. Activation solution:50% ACN. 4.. Equilibration/Wash solution:1% ACN with 0.1% FA 32.

(44) 5.. Elution solution:70% ACN. 貳、儀器設備 1.. 桌上型離心機(FOCUSBIO, pc-200). 2.. 超純水系統(Millipore Direct-Q3). 3.. 真空離心濃縮機(miVAC, DUC-12060-C00). 4.. 電磁加熱攪拌器(IKA, C-MAG HS7). 參、實驗步驟 1.. 預先備製 C18 管柱。用 70% ACN 溶液加上攪拌石，使 C18 beads 均勻分散溶液其中。. 2.. 吸取等體積溶液至各離心管柱中，使各管柱間 C18 beads 等量。. 3.. 用離心機讓 C18 beads 於管柱底部，濾液去除，即填充管柱完成。. 4.. 將凍乾的固體樣品用 150 μL Equilibration/Wash solution 回溶，等待約 10 分鐘。. 5.. 每管加 200 μL Activation solution 活化管柱，離心 1500 xg，重覆活化三次。. 6.. 各加 200 μL Equilibration/Wash solution 平衡管柱，離心 1500 xg，重覆離心五次。. 7.. 回溶樣品 150 μL 加到管柱中，離心 1500 xg，為了確保樣品能被 C18 beads 抓住，將濾液重覆過濾總共三次。. 8.. 用 200 μL Equilibration/Wash solution 洗去鹽類，離心 1500 xg，重複清洗五次。. 9.. 更換新的試管，沖提出樣品以 20 μL Elution solution，離心 1500 xg，重複五次。 33.

(45) 10. 沖提出的樣品放入真空離心機乾燥，保存於-20°C。. 第七節奈米級液相層析電噴灑游離串聯式質譜儀 (nanoLC ESI tandom mass spectrometry) 壹、自製液相層析分析管柱一、材料 NUCLEOSIL 100-3 C18, 3 μm, 100 Å (Macherey-Nagel) Flexible fused silica capillary tubing, O.D. 375 mm, I.D. 75 mm(Polymicro Technologies). 二、實驗設備電磁加熱攪拌機(Thermo Scientific, Cimarec®2) Pressure chamber. 三、實驗步驟 1.. 拿最小藥勺取 1/2 匙的 100-3 C18 beads 於小玻璃瓶中，加入約 8 分滿甲醇並放入攪拌石，放入 pressure bomber 中，確定溶液中 100-3 C18 beads 分布均勻。. 2.. 開啟氮氣鋼瓶將壓力閥調至 75-100 bar 之間，鎖緊 Pressure chamber，確定沒有漏氣。. 3.. 裁 200 mm 毛細管，前端填充些許 SiO2 鍛燒，使 SiO2 微熔於毛細管，避免填充的 100-3 C18 beads 流失。 34.

(46) 4.. 將毛細管尾端插入至溶液的液面中，開啟氣體微調閥門，進行管柱靜相填充。. 5.. 填充至 100 mm 後，將毛細管管柱拉起 50-60 mm 遠離液面，關掉氮氣鋼瓶，利用剩餘氣體乾吹毛細管，以利保存。. 6.. 吹乾 20 分鐘後，抽取出毛細管，即可完成分析層析管柱。. 貳、超高效能液相層析 (Ultra-performance liquid chromatography, UPLC,Waters) 一、材料與試劑 Analytical column: Lab-made 100 mm x 75 μm I.D., 3 μm 100 Å C18 Moblie phase A: 0.1% FA in milli-Q H20 Moblie phase B: 0.1% FA in ACN. 二、實驗步驟由自動進樣系統吸取樣品，經由內部幫浦推入主要分析的層析管柱中，流速設定為 400 nL/min，濃度梯度為表 4，總共進樣時間為 140 分鐘。表 4 超高效能液相層析梯度表 Time(min). Mobile phase A (%). Mobile phase B (%). Flow rate(nL/min). 0. 98. 2. 0.4. 5. 98. 2. 0.4. 99. 60. 40. 0.4. 100. 20. 80. 0.4. 105. 20. 80. 0.4. 106. 98. 2. 0.4. 140. 98. 2. 0.4. 35.

(47) 參、線性離子阱量譜儀(Linear ion trap mass spectrometer, LTQ XL, Thermo Fisher) 一、質譜參數設定 IonSpray voltage (IS): 2.0 kV (through liquid junction) Capillary temperature: 200°C Scan range: 350 - 2000 (m/z) 《Data dependent triple play》 (Scan Event 1) MS1: survey scan Min. signal required: 100,000 (Scan Event 2, 5, 8): zoom scan (Scan Event 3, 6, 9): MS2 for CID: 離子撞碎進行二次質譜掃描 Min. signal required: 10 Isolation width: 2.0 Da Normalized collision energy: 35% Activation Q: 0.25 Activation time (ms): 30 (Scan Event 4, 7, 10) : MS2 for PQD: 離子撞碎進行二次質譜掃描 Min. signal required: 10 Isolation width: 2.0 Da Normalized collision energy: 29% Activation Q: 0.55 Activation time (ms): 0.3 利用電噴灑游離(electrospray ionization, ESI)將胜肽樣品離子化，以 36.

(48) LTQ 串聯式質譜儀進行分析。質譜控制軟體為 Xcalibur version 2.1 以數據相關擷取模式(data dependent acquisition, DDA)搭配動態排除功能(dynamic exclusion)，依據設定條件進行質譜分析。質譜儀的掃描模式為 data dependent triple play，第一個檢視質譜掃描(survey scan)掃描先驅離子，掃描範圍在 350-2,000 m/z，接著三個 zoom scan 針對檢視質譜掃描中，離子強度(ion count)前三名且超過 100,000 的先驅離子確定價數，最後是三個脈衝碰撞誘導解離(PQD)和三個碰撞誘導解離(CID)離子撞碎後，再進行二次離子掃描，針對 zoom scan 中 ion count 超過 10 且不為一價的電荷離子進行碰撞，圖 18 質譜掃描示意圖。. 圖 18 質譜掃描示意圖. 動態排除功能設定為在進行 MS/MS 分析時，當相同 m/z 值的前驅離子在 30 秒內被選取 2 次，則被送至排除清單(exclusion list)裡不會再進行 MS/MS 分析，3 分鐘後將從排除列表內移除，如果再次偵測到相同 m/z 值之訊號， 37.

(49) 則會依據數據相關擷取模式的條件繼續分析。此種方法設定可以避免高含量的離子重複做 MS/MS 分析，以確保低含量的離子被鑑定到的機會。. 第八節資料分析(Data analysis) 壹、參數設定 1.. Proteome Discoverer version 1.1.0.263(Thermo Fisher Scientific Inc.). 《Proteome Discoverer 參數設定》 2.. Database: Swiss-Port Release 2016_10 of 02-Nov-2016. 3.. Taxonomy: Homo sapiens (human). 4.. Enzyme: Trypsin. 5.. Mass scan: 350-2000 m/z. 6.. Peptide charge: 2+, 3+ and 4+. 7.. Fixed modifications: Methylthio (C), iTRAQ 4-plex (N-term), iTRAQ 4plex (K). 8.. Variable modifications: Oxidation (M), iTRAQ 4-plex (Y). 9.. Peptide mass tolerance: ± 1.5 Da (# 13C=1). 10. Fragment mass tolerance: ± 0.6 Da 11. Max. missed cleavages: 1 12. Instrument type: ESI-TRAP 為了避免各樣品間起始的總含量不同導致偏差，使兩者不同樣品的蛋白質分布不一致，選用軟體功能使用比值的中位數(median)去調整兩種樣品之間的分布，使他們有一致的標準，之所以選用中位數原因是大多數的蛋白質受感染與位受感染的比值，不會有變化，比值則趨近於 1，因此以中位數為基準進行校正。 38.

(50) 第三章結果與討論第一節蛋白質樣品濃度測定實驗中一共為五組樣品，每一組樣品包含有兩種天數與控制組四個樣品相互比較，在經過 Amicon® Ultra-0.5(3kDa)蛋白質純化濃縮後，進行 Bradford protein assay 蛋白質含量測定，原理是利用 Coomassie® Brilliant Blue G-250 染劑與蛋白質中的鹼性胺基酸結合，染劑未結合前在酸性條件下為褐色，與蛋白質結合後則會產生藍色複合物，蛋白質含量越高時藍色則會越深，顏色與蛋白質含量成正比，在可見光波長 595 nm 有最高的吸收質，以此波長測定吸收質。以牛血清蛋白(BSA)標準溶液使用 Microsoft Excel 軟體繪製出校正曲線，本實驗中牛血清蛋白(BSA)標準溶液校正曲線 R2 皆有在 0.995 以上，圖 19，推算出樣品中的蛋白質含量，並計算回收率，之後每一組實驗各取 100 μg 蛋白質進行胰蛋白酶水解及 iTRAQ 試劑標定，如表 5。. 39.

(51) 圖 19 牛血清蛋白(BSA)標準溶液校正曲線圖. 40.

(52) 表 5 Bradford Protein Assay 定量蛋白質結果第1組 Sample IN08 HS08 IN16 HS16 第2組 Sample IN16 HS16 IN30 HS30 第3組 Sample IN30 HS30 IN81 HS81 第4組 Sample IN81 HS81 IN112 HS112 第5組 Sample IN08 HS08 IN112 HS112. Before Amicon μg/μL μg 8.8 439.78 13.58 679.03 8.58 429.03 9.71 310.71 Before Amicon μg/μL μg 8.58 429.03 9.71 310.71 17.61 440.32 15.62 312.47 Before Amicon μg/μL μg 14.20 355.10 19.20 384.08 12.07 301.70 10.76 376.50 Before Amicon μg/μL μg 15.82 395.47 11.16 390.66 18.22 419.07 15.03 375.86 Before Amicon μg/μL μg 4.75 180.64 9.1 391.36 8.16 187.67 8.88 222.1. After Amicon μg/μL μg 3.94 383.01 5.45 527.59 5.89 412.23 4.25 305.71 After Amicon μg/μL μg 5.89 412.23 4.25 305.71 3.66 362.45 3.09 275.31 After Amicon μg/μL μg 3.00 297.27 2.70 318.58 2.02 253.01 2.21 305.05 After Amicon μg/μL μg 3.88 257.63 3.87 275.7 3.5 250.03 3.78 294.69 After Amicon μg/μL μg 2.67 178.86 5.34 373.54 2.43 167.68 2.75 198.34. Recovery 87% 78% 96% 98% Recovery 96% 98% 82% 88% Recovery 84% 83% 84% 81% Recovery 65% 71% 60% 78% Recovery 99% 95% 89% 89%. 第二節利用不同分離策略 iTRAQ 標記胜肽樣品壹、等電點聚焦分離儀(sIEF) 此分離方法需用到 Agilent 3100 OFFGEL Fractionator 儀器，利用固定電流(50 μA)改變電壓(最大值為 4500 V)，將帶電的胜肽逐漸分離，當 Volt Hours 達到 50 k V h，儀器則會停止表示分離完成，使用功率(200mW)，過程中會紀錄參數質的變化，啟用 Microsoft Excel 中的 Agilent 3100 OFFGEL fractionator plotter 巨集程式匯整出參數變動圖表，如圖 20。. 41.

(53) 42.

(54) 圖 20Agilent 3100 OFFGEL Fractionator 參數變動圖. 每次實驗樣品量約 133 μg，樣品分離時間約 30-40 小時，五張圖代表五組樣品分別為(a) 第 8 天與第 16 天 (b) 第 16 天與第 30 天 (c) 第 30 天與第 81 天 (d) 第 81 天與第 112 天 (e) 第 8 天與第 112 天，受 HCV 感染的細胞株與相同天數控制組。圖中紅點表示開蓋記錄，實驗進行若超過 24 小時需更換墊片及補充礦物油避免水分流失無法通電。Follow Up Start 為實驗結束時間記錄，其中 (c) 第 30 天與第 81 天在實驗接近結束時遇到停電，但在最後鑑定蛋白質時不影響實驗結果如圖 20. 貳、強陽離子交換法(SCX) 在第一維度分離時選用 SCX 分離藉由改變鹽類的濃度，拉鹽類梯度分離胜肽樣品，偵測胜肽鍵吸收波長為 214 nm，使用分液收集器每分鐘收集一管，總共分析時間為 80 分鐘，在依據吸收峰強度與滯留時間 (retention time, RT)將相鄰的管柱匯集成 24 管，各組樣品分管層析圖與移動相梯度如下，圖 21 強陽離子交換層析分離圖。層析圖中 X 軸為時間 (min)，Y 軸為 UV 吸收強度(mAU)，紅線為移動相 B 比例梯度。五張層析圖分別為(a) 第 8 天與第 16 天 (b) 第 16 天與第 30 天 (c) 第 30 天與第 81 天 (d) 第 81 天與第 112 天 (e) 第 8 天與第 112 天，受 HCV 感染與控制組樣品。. 43.

(55) 44.

(56) 45.

(57) 圖 21 強陽離子交換層析分離圖. 參、鹼性逆相層析法(bRP) 在較高 pH 值的逆相層析移動相溶液中，將帶有鹼性殘基的胺基酸變為中性，使胺基酸與管柱的作用力增強，之後增加非極性移動相溶液比例拉梯度，將胜肽樣品沖提出來。偵測胜肽鍵吸收波長為 214 nm，使用分液收集器每分鐘收集一管，總共分析時間為 80 分鐘，在依據吸收峰強度與滯留時間(retention time, RT)將相鄰的管柱匯集成 24 管，各組樣品分管層析圖與移動相梯度如下圖 22 鹼性逆相層析分離圖，X 軸為時間(min)，Y 軸為 UV 吸收強度(mAU)，紅線為移動相 B 比例梯度。五張層析圖分別表示為(a) 第 8 天與第 16 天 (b) 第 16 天與第 30 天 (c) 第 30 天與第 81 天 (d) 第 81 天與第 112 天 (e) 第 8 天與第 112 天，受 HCV 感染與控制組樣品。. 46.

(58) 47.

(59) 48.

(60) 圖 22 鹼性逆相層析分離圖. 第三節三種分離策略結果比較利用 Proteome Discoverer™ 軟體進行蛋白質分析，資料庫版本為 Swiss-Port Release 2016_10 of 02-Nov-2016，藉由資訊軟體鑑定到的蛋白質總數目和未重複胜肽(Unique peptides)的胜肽總數目，比較三種不同維度分離方法，將不同天數五組間鑑定到的不重複胜肽(Unique peptides)繪製成長條圖進行比較，如圖 23。. 49.

(61) 圖 23 三種分離策略不重複胜肽在各管分布長條圖. 可發現到三種分離策略分布情況皆不同，sIEF 的不重複胜肽因 pI 值特定集中在某些區域，先前文獻已有記載此現象，主因是不同胜肽 pI 值分布不同，並不一定是均勻分布於各等電點上[51]。SCX 大部分胜肽於拉梯度前面管數就被沖提出來，少部分因鹽類濃度梯度緩慢升高而被沖出，推測此次樣品大多含單一價正電胜肽，因此在沖提時一併被沖出。bRP 與另外兩種分離策略比較下明顯胜肽分布較均勻，分離效果比較好。. 50.

(62) 圖 24 三種分離策略下鑑定到的蛋白質與不重複胜肽. 使用五組 iTRAQ 試劑定量受到不同階段 HCV 感染的細胞株，分析依照三種不同分離策略，將鑑定到的所有 (a) 蛋白質 (b) 不重複胜肽，各別繪製成 Venn Diagram，如圖 24 所示。圖中可發現到，在 sIEF、SCX 及 bRP 三種分離策略下，每一種分離策略都可以鑑定到樣品中大部分的蛋白質，分別占全數 2020 個蛋白質的 65.9%、57.3%及 79.3%，若比較三種分離策略定鑑到的蛋白質，也看出 bRP 分離策略能鑑定到最多數量的蛋白質。接著比較三種不同分離策略下鑑定到的不重複胜肽，基於 iTRAQ 試劑是在生物樣品於胜肽狀態下進行標記，將得到的胜肽序列經由資料庫比對進行分析得到相對應的蛋白質，因此當鑑定到的胜肽數目越多不只有機會能鑑定到更多的蛋白質，還可以提升相對應蛋白質的序列覆蓋率 (sequence coverage)，因而提高蛋白質的可信度(confidence)，藉由搭配三種不同的分離策略，可大幅增加不重複胜肽的數量，提高每種蛋白質的覆蓋率，使鑑定到的蛋白質更為正確。在 Proteome Discoverer™ 蛋白質軟體分析下，可以得到下列資訊: (1) 鑑定到的蛋白質總數目(2)未重複胜肽(unique peptides)的胜肽總數目(3)蛋 51.

(63) 白質序列覆蓋率 (sequence coverage)(4)MS/MS. 圖譜總數. (spectrum)(5)iTRAQ 標記相對比值(ratio)，詳細內容附於論文最後方的附表中，依據五組不同鑑定結果，將主要五組間數據包含總圖譜數、蛋白質及胜肽所有資訊彙整統計得到下列表格表 6. 表 6 五組相鄰兩天數 iTRAQ 標記鑑定到蛋白質與胜肽總數目 1. 2. 3. 4. 5. Total. Day. 8,16. 16,30. 30,81. 81,112. 8,112. # Queries. 85030. 81423. 142864. 83766. 109204. 477711. # Identified proteins. 964. 1188. 1800. 1417. 1802. 2020. # Identified peptides. 10593. 11527. 26680. 16526. 21223. 87051. # Quantified proteins. 542. 717. 1158. 918. 1161. 1645. # Quantified peptides. 4399. 4941. 12750. 7299. 9408. 44373. # Unique peptides. 2343. 2805. 5833. 3545. 4868. 8953. 將定量到的蛋白質定義為有被 iTRAQ 標記到的胜肽序列片段，並且去除過於冗長及非未重複胜肽(unique peptides)，得到具有意義價值的胜肽序列，在資料庫搜尋比對下得到定量蛋白質，其中差異蛋白質需滿足上調 1.5 下調 0.667 倍。將各組定量到的蛋白質總數目利用分布圖進行分析，可以發現到同天數與未感染的控制組相比下，大多數的蛋白質含量差異變化不大，只有在分布圖的兩端少部分蛋白質會有明顯的差異，為了找出不同階段五組 iTRAQ 定量下的差異蛋白質，我們定義相同天數下感染與未感染的細胞株比值相差需大於 1.25 倍或者小於 0.8 倍，如圖 25 五組相鄰兩天數 iTRAQ 標記蛋白質分布圖。. 52.

(64) 53.

(65) 圖 25 五組相鄰兩天數 iTRAQ 標記蛋白質分布圖. 相鄰兩組間會有相同天數的樣品，為了比較在現性是否良好，我們用分布圖，圖 26 看到結果差異不大。. 54.

(66) 55.

(67) 圖 26 相同天數不同組間 iTRAQ 標記蛋白質分布圖. 56.

(68) 第四節蛋白質相關生物途徑運用 Clue go 2.3.3 軟體進行 Gene Ontology (GO)分析，分別比較不同天數感染與未感染蛋白質之間是否有差異，以及含量變化是否有所不同，分析探討差異蛋白質所屬生物路徑，功能及相對應影響。國立成功大學基醫所蔡佩汝博士論文(預計 108 年 1 月出版). 在每組 iTRAQ 定量，會將受到 HCV 感染不同的兩階段樣品進行比較，分析第三組第 30 天與第 81 天 iTRAQ 標記所得到的結果，在第 30 天 (Declined stage)的分析中圖 27，生物路徑圖如下所示(a) 為所有路徑，依照顏色區分不同的路徑，(b) 上下調蛋白路徑分布示意圖，紅色代表上調蛋白及路徑，綠色則是表示下調蛋白及其路徑，此階段路徑顯示主要由下調差異蛋白調控，再將上下調差異蛋白分別製成圓餅圖進行分析各別探討其中的路徑如(c) (d) ，(c) 圓餅圖中. 上調路徑主要與脂質的代謝與運輸. (lipid metabolisms and transport)有關，(d) 下調路徑較複雜，然而依照圓餅圖表示占約一半比例的是多聚腺苷酸與信使 RNA 結合的相關路徑(Poly. 57.

(69) (A) RNA binding). 圖 27 第三組 iTRAQ 標記第 30 天(Declined stage) GO 分析路徑圖及圓餅圖. 在第 81 天(Silencing stage)路徑圖中，可以見到主要由紅色上調蛋白主導著生物路徑，將其繪製成圓餅圖，看不同生物路徑之間在此階段下各占的比例，最後由橫條圖分析主要途徑中鑑定到的差異蛋白於路徑中所占的比例，依序為葡萄糖代謝(Glucose metabolisms)、轉譯起始(Translation initiation)、胞飲再循環過程(Endocytic recycling processes)以及剪接體形成. 58.

(70) (Spliceosome formation)相關路徑. 圖 28 第三組 iTRAQ 標記第 81 天(Silencing stage) GO 分析路徑圖、圓餅圖及橫條圖. 59.

(71) 60.