微生物 R. eutropha 金離子感測器改良

4.5.1 質體 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp-cupC 和 R. eutropha 宿主之組合 透過前面的實驗，比較了兩組微生物金離子感測器，整體來說，C.

metallidurans 感測器螢光強度為較佳，但其他如線性關係、再現性的 R 平 方值和檢測的範圍都是 R. eutropha 感測器較佳，所以希望能夠提高 R.

eutropha 感測器整體的螢光強度。

前面 1.2.3 的章節有提到 MerR 家族的調節基因組 cup 系統，其中 cupC 基因 可製造運輸並排解重金屬的蛋白 CupC，其可以幫助 CupR 和 CupA 兩個蛋白質對金離子的結合，故我們在設計好的質體下游再加入 cupC 基 因 (Fig. 4-27(A))，然後透過劑量回饋的實驗與含有原本質體的 R. eutropha 感測器相互比較：

分別加入金離子 0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、5、10、

25、50、60、75、90、100、150、200M 的濃度，並用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值，並將兩值相除後作一個劑量反 應 曲 線 並 比 較 原 先 質 體 的 R. eutropha 的感 測 器 劑 量反 應 曲線 (Fig.

4-27(B))。

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Fig. 4-27 R. eutropha 和 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp-cupC 的質體基因組 感測器。

(A)在原本的質體基因組下游，加入一段 cupC 的基因組。 (B)與原本的感 測器在檢測金離子濃度中比較，含有 cupC 基因組的感測器整體呈線性上 升，相較於原本的質體感測器則是在 1M 時已經趨近於飽和狀態，此外 兩者的耐受性都達到 150M。¹¹

透過比較可以明顯的看見，含有 cupC 基因組的 R. eutropha 感測器明 顯的整體螢光上升，且還呈線性的上升到金離子濃度 100M，相較於原本 的感測器螢光在 1M 時已經趨近於飽和狀態，因此我們達到了我們當初

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所設定的目標。接著，我們要來檢視其線性回歸的關係。

Fig. 4-28 R. eutropha 和 cupR(rev)-PcupA/R-PcupC-rfp-cupC 的質體基因組 感測器高低濃度檢量線。

(A) 金 離 子 於 低 濃 度 100~1000nM 的 線 性 回 歸 。 (B) 金 離 子 於 高 濃 度 25~100M 的線性回歸。¹¹

在金離子濃度的低濃度 0.1~1M 可以得到一段線性回歸，且 R 平方值 在 0.9878；此外，在金離子濃度的高濃度 25~100M 也有一段線性回歸，

且 R 平方值在 0.9823。含有 cupC 基因組的質體 R. eutropha 感測器，不只 是提升了整體每單位的螢光強度，更是在定量分析上可以同時定量低濃度 和高濃度的範圍。

在得到每單位的螢光強度提升之後，接下來希望能夠提升微生物金離 子感測器的耐受性，可以超過 100M 並且觀察除了能突破原本 R. eutropha 感測器的耐受性之外，還能否有不錯的線性關係。

4.5.2 質體加入 cupA 和 cupC 的不同組合並與 R. eutropha 宿主組成感測器 在前面比較了原本的質體還有加了 cupC 基因組的質體，雖然整體每 單位的螢光強度有所提升，但是其抵抗重金屬金離子的濃度都只能到 100M 左右，所以希望能夠提高 R. eutropha 感測器的耐受性。前面 1.2.3

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的章節提到的 MerR 家族的調節基因組 cup 系統，除了 cupR 和 cupC 之外，

還有一個 cupA 基因組，其可製造輸送重金屬的膜上蛋白 CupA，可以幫助 微生物體內的金離子排出以減少金離子對微生物造成的毒害。在設計質體 方面，我們將設計兩組不同的質體 (Fig. 4-29)並與之前的質體和加入了 cupC 基因組的質體相互比較。

Fig. 4-29 不同的質體設計。

(A)在原本的質體基因組下游加入了 cupA 的基因。 (B) 在原本的質體基因 組下游依序加入了 cupA 和 cupC 的基因。

這兩組質體都是使用 R. eutropha 當作宿主的感測器，我們分別在質體 基因組的下游加入了 cupA 和 cupA-cupC，接著我們只測試在高濃度的金離 子溶液，觀察者兩組的耐受度會不會突破 100M 到更高的濃度：

分別加入金離子 0、90、100、150、200、300、400、500、1000M 的 濃度，並用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值，最後與前面原本的質體和加了 cupC 的質體作比較。

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Fig. 4-30 不同質體的 R. eutropha 的感測器比較。

(A)四組不同質體表現的 OD 值。 (B)四組不同質體表現的螢光強度。

透過結果 Fig. 4-30 可以發現，改良後的質體並沒有使 R. eutropha 感測 器對重金屬金離子的耐受度增加，且螢光強度也沒有提升，反而是質體含 有 cupC 的效果最佳。我們接著將兩個數值相除後，檢視每單位螢光強度 的結果：

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Fig. 4-31 比較四組不同質體的 R. eutropha 感測器，其每單位螢光強度及 針對高濃度的金離子耐受性。

最後用每單位螢光強度來比較之後，可以更清楚的看到含有 cupC 的 質體是裡面螢光最佳的，而且耐受性四組質體都一樣，另外新的質體 cupA 和 cupA-cupC 並沒有特別提高 R. eutropha 感測器的耐受度或是螢光。

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