質體基因工程 (cloning)

首先，將設計好的質體開始以基因工程的方式，將每個部份的基因組 合起來，其過程會經過選育、篩選、定序最後儲存。

A. 選育

1. 引子 (primer)

透過網路尋找要 cloning 的目標物基因，並將其基因序列取前端 (5 端)和後端 (3 端)設計成 20~30 bp 長的引子 (primer)後，再委外以人工 方式合成。

16 以下 Table 3-1 為本實驗用到的引子：

Primers Sequence

rfp_NdeI fw TTTTCATATGgcgagtagcgaagacgttatcaaaga rfp_BamHI rv TTTTGGATCCttaagcaccggtggagtg

cupR_EcoRI fw TTTTGAATTCttagtgatggcaggccgggcg cupR_BglII rv TTTTAGATCTattagtgatggcaggccgggcg

PcupR_EcoRI fw TTTGAATTCaatccttgaccttccaatggtggtaaggttcacagtgc agttgtcgcgctccgtcgctcagattccacgactccgatgaacatcggaga agccgcgg

PcupR_BglII rv TTTTAGATCTtgtcgcgtgcgactcaacaaat cupR(rev)_EcoRV fw TTTGATATCttagtgatggcaggccggg cupR(rev)_EcoRI rv TTTGAATTCatgaacatcggagaagccgcgg PcupCR_EcoRI fw TTTTGAATTCggagtcgtggaatctgagcgacg PcupCR_BglII rv TTTTAGATCTggtgatgactcctgttgggttggatcg

cupC_BamHI fw TTTTGGATCCtttaagaaggagatatacatatgatccagttccaagt cgaagg

cupC_XhoI rv TTTTCTCGAGtcagcttgccgacttgaccg

cupA_BamHI fw TTTTGGATCCtttaagaaggagatataatgacccatcctgccgcat ctctc

cupA_BamHI rv TTTTGGATCCttaaatcattgcgttacctccttgtggcc Table 3-1 引子的名稱和序列。

2. 基因片段 (insert)

透過 PCR 儀器進行聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction)，

其中引子 (primer)結合目標基因片段的前端及後端，引導 DNA 聚合酶開

17 Fragments Extraction Kit 將含有目標基因片段的膠體純化並最後加入純 水 (ddH2O)回收目標基因片段，可將其保存於 4℃ or -20℃的環境。 Extraction Kit 純化出載體及目標基因片段，最後可得到有相同的缺口的 載體和目標基因片段，緊接著進行連接酶作用反應 (ligation)。

18 5. 連接作用 (ligation)

使用連接酶 (ligase)將裁切好的載體和目標基因片段一起反應並置 於室溫約 1~2 小時，使載體和目標基因片段可以結合，形成新的完整質 體。

6. 轉化 (transformation)

透過轉化作用可以將質體植入微生物體內，使微生物獲得額外的遺

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而且低溫可降低細胞活性，延長保存的時間。

E. 接合作用 (conjugation)

將完成的質體，透過轉化作用到大腸桿菌的另外一種菌株 E. coli S17，

此菌株的細菌表面含有線毛 (性菌毛，pilus)，透過此線毛與其他菌的膜結 合，菌與菌之間建立了一道細胞質的橋樑，可將自身所帶的質體基因透過 此橋梁傳到另外一個菌的質內 (Fig. 3-3)。當其他菌透過此方法得到新的質 體基因時，也可以獲得質體的功能 (如抗藥性或蛋白質表現等)。

20 Fig. 3-3 接合作用的示意圖。

(A)一個帶有質體的細菌 E. coli S17 菌株為提供者，而另外一個細菌 (C.

metallidurans 或 R. eutropha)則為接受者。 (B)線毛開始與另一個細菌的膜 結合。 (C)兩菌之間建立了直通細胞質的橋樑，並透過聚合酶開始複製質 體並轉移到接受者。 (D)最後兩個菌都擁有質體。

21 Kanamycin 和 Gentamycin)，接著培養於 37℃的培養箱並以 250 rpm 的轉速 培養至隔夜。

隔天，取原本的菌液 2%加到新的且含有抗生素的培養液中，此過程為 稀 釋 (dilution) ， 依 照不同 實驗 的需 求 稀釋不 同數 量的 試 管 ，並 透過 Multi-Mode Microplate Reader 檢測生長的 OD 值 (波長 600nm 的吸收度，

可做為微生物生長指標)，大腸桿菌約在 4 小時 OD600 為 0.4~0.6 之間 (若 小時。之後觀察紅色螢光的強度與金屬的關係，並用 Multi-Mode Microplate Reader 檢測螢光的強度以及生長的 OD 值，分別比較各個金屬鹽類與微生 物感測器所發出的螢光關係。