第五章 結論
II. 微生物蛋白質顯像技術
6.3 目標蛋白質 (target proteins)
6.3.2 蛋白質與蛋白質之間的作用 (Protein-protein interaction)
在細胞內複雜的環境中，若要控制蛋白質完全表現其功能，有時須仰 賴其他協同蛋白質的幫助。目前已經有很多相關的研究在探討蛋白質與蛋 白質之間的交互作用 (protein-protein interactions, PPIs)，大部分都是利用雙 分子螢光互補 (bimolecular fluorescence complementation, BiFC)的方法來 標記兩邊的蛋白質。
2008 年，Alice Y. Ting19發表了利用 biotinylation 的標記方法來研究蛋 白質與蛋白質之間的交互作用，他們將 BirA 接在一個蛋白質上，而當另 一個有接上 BAP 的蛋白質與其靠近並有交互作用時 (Fig. 6-5)，BirA 將會 催化 BAP，此時加入 biotin 即可檢視 biotinylation 的過程，隨後加上與 biotin 有很強作用力的分子抗生物素蛋白鏈親合素 (streptavidin)檢視。
Fig. 6-5 蛋白質 A 與蛋白質 B 間的交互作用，分別接上 BirA 酵素和對其 具有專一性的胜肽做 biotinylation 標記並檢視19。
78 白質間的調節分子雷帕黴素 (rapamycin)並做 biotinylation 並檢視。左圖運 用微分干涉差顯微鏡 (DIC)和螢光顯微鏡的重疊圖並利用傳統螢光蛋白質 標記做對照圖；右圖為在螢光顯微鏡下，利用 biotinylation 的方法標記後 加入含有合成螢光素 Alexa568 的 streptavidin 19。
蛋白質間的交互作用實驗，透過觀察常被研究的 FKBP (FK506 binding protein)和 FBP (FKBP-rapamycin binding protein)蛋白質，兩者是透過辨識 調節分子雷帕黴素 (rapamycin)存在時，才會產生交互作用。將 FKPB 接上 BAP 的胜肽；FBP 接上 BirA 的酵素後，利用人類胚胎的腎細胞 (human embryonic kidney cell, HEK cell)來表現兩種蛋白質 FRB-BirA 和 FKBP-BAP 後，觀察 biotinylation 的標記方法 (已經加入 rapamycin 之後)有沒有成功。
將傳統的螢光蛋白標記法當作對照來比較，可以發現兩者的效果差不多，
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但 biotinylation 的標記方法只需要幾分鐘即可，而螢光蛋白的培養則是需 要花較長的時間19。
本實驗則是想運用一樣的方法，觀察微生物體內的蛋白質與蛋白質間 的交互作用，我們選擇兩個作用力很強的蛋白質 FtsZ 和 ZapA 當作目標蛋 白質20，並分別於 FtsZ 接上 BAP 和 ZapA 接上 BirA 後，利用微生物表現 FtsZ-BAP 和 ZapA-BirA 兩個重組蛋白質並加入 biotin 含螢光分子行 biotinylation，最後透過螢光顯微鏡檢視觀察。FtsZ 是大腸桿菌在進行細胞 分裂時，會集中在細胞中央並形成一個類似環的結構 (Z-ring)；ZapA 則是 當 Z-ring 形成時會與 FtsZ 產生交互作用並穩定 Z-ring 的形成21，故當我們 判別 biotinylation 的標記方法有沒有成功時，僅需觀察在微生物中間有無 條狀或是環狀的螢光形成。
Fig. 6-7 蛋白質 FtsZ 與 ZapA 交互作用透過 biotinylation 標記的示意圖。
微生物表現含有標籤 BAP 的蛋白質 FtsZ 和含有酵素 BirA 的蛋白質 ZapA 後，加入生物素螢光衍生物，即可將生物素標記在標籤上並觀察蛋白質與 蛋白質間的交互作用。
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6.4 研究動機
生物顯像技術因為應用範圍極廣，在生物活體細胞方面，則是從細胞 表面甚至到細胞質或細胞核的蛋白質都可以被標記且顯像。螢光蛋白在生 物蛋白質顯像的技術中，一直都是普遍被使用的技術，尤其擁有不錯的專 一性而廣受歡迎，但缺點是其分子量較大，有可能會對目標蛋白質造成干 擾。然而，後續有很多標記的方法出現，有蛋白質標籤的標記方法，還有 則是胜肽標籤的標記方法，但大部分都有專一性不佳、螢光強度不強或是 背景訊號干擾，因此透過生物素化作用 (biotinylation)來標記並觀察目標蛋 白質 (target protein)，當結合生物素的胜肽 (biotin acceptor peptide, BAP) 經過生物素的酵素 (biotin ligase, BirA)催化後，就可以與生物素 (biotin)結 合，有不錯的專一性且標記所花的時間較少。
除了研究單一蛋白質的運動之外，還可以利用生物素化作用標記的方 法來研究細胞中蛋白質與蛋白質間的交互作用，所以應用此標記法來彌補 原本螢光蛋白標記法不足的地方，提供了更多技術選擇投入對蛋白質的研 究。
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6.5 研究目標
前面提到的標記方法，大部分都應用在哺乳類動物細胞中，只有幾種 方法是用在微生物中，且只有螢光蛋白標籤的標記最常被用於觀察活體微 生物中的蛋白質，其他標記法幾乎都是要先將微生物裂解後純化出目標蛋 白質，或是將微生物製成標本後才能做標記。
本實驗嘗試將 BirA 酵素與 BAP 標籤的 biotinylation 標記法應用在活體 微生物上，再透過螢光顯微鏡觀察。實驗不只標記微生物外膜上的蛋白質，
也觀察體內蛋白質與蛋白質間的交互作用。
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第七章 實驗藥品與器材
7.1 實驗儀器
名稱 (中文) 名稱 (英文) 廠牌
高速冷凍多用途離心機 Centrifuge(Refrigerated) Hettich 數位顯示型乾浴器 Dry Bath Basic Life 離心機 High-Performance
Micro-Centrifuge
WiseStir
螢光數位影像照膠系統 Image Analysis System SmartGel™
電泳槽 Mini Horizontal Gel Electrophoresis System
Major Science
蛋白質轉漬 Mini Tank Transfer Unit Amersham Biosciences 垂直電泳系統 Mini-vertical Gel
Electrophoresis Unit
Amersham Biosciences 光學顯微鏡 Optical Microscope ZEISS 恆溫迴轉式振盪培育箱 Orbital Shaking Incubator Firstek
酸鹼度測試儀 pH Meter CLEAN
超音波細胞破碎機 Sonicator Qsonic 熱循環儀主機 Thermal Cycler Arktik™
精密天平 Uni Bloc Electronic Balance Shimadzu 多功能試管振盪器 Vortex Scientific
Industries 精密恆溫水槽 Water Bath Firstek
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7.2 實驗藥品
名稱 (中文) 名稱 (英文) 廠牌
丙烯酰胺/甲叉雙丙烯 酰胺
Acryl/Bis™ 37.5:1 (Acrylamide solution)
AMRESCO
瓊脂 AGAR Zymeset
瓊脂糖 Agarose Zymeset
牛血清白蛋白 Albumin, Bovine serum Bioshop Canada 過硫酸銨 Ammonium persulfate
(APS)
AMRESCO
腺甘三磷酸 ATP (Adenosine
5'-triphosphate disodium salt hydrate)
Sigma-Aldrich
生物素螢光衍生物 Biotin (5-fluorescein) conjugated
Sigma-Aldrich
Bradford 蛋白質定量 檢測試劑
Bradford Reagent AMRESCO
二甲基碸 Dimethyl sulfoxide (DMSO)
AMRESCO
溴化乙啶 Ethidium bromide (EtBr) AMRESCO 乙烯二胺四醋酸二鈉 Ethylenediaminetetraacetic
acid disodium salt dihydrate (EDTA)
Fluka Chemie (Sigma)
甘油 Glycerol Zymeset
His•Tag 蛋白質純化 樹脂
HisPur™ Ni-NTA Resin Thermo Scientific
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鹽酸溶液 Hydrochloride AMRESCO 三水合四氯金酸 Hydrogen
tetrachloroaurate(III) trihydrate
Acros Organics
咪唑 Imidazole AMRESCO
蛋白質染色劑 Imperial™ Protein Stain Thermo Scientific 異丙基-β-D-硫代吡喃
半乳糖苷
IPTG AMRESCO
硫酸卡那黴素 Kanamycin sulfate Zymeset 蛋白質電泳 Sample 緩
衝液
Laemmli Loading Buffer 4X AMRESCO
阿拉伯糖 L(+)-Arabinose Acros Organics LB 培養基 LB Broth Miller (Lysogeny
Broth or Luria-Bertani Medium)
Zymeset
溶菌酶 Lysozyme Sigma-Aldrich 磷酸鹽緩衝液 10X PBS Buffer (Phosphate
buffered saline)
BasicLife Bioscience
pH 標準校正液 pH Standard solution (pH=4, 7, 10)
Clean
蛋白酶抑制劑 Protease Inhibitor Roche Diagnostics 氯化鈉 Sodium chloride AMRESCO
十二烷基硫酸鈉 Sodium dodecyl sulfate (SDS)
AMRESCO
氫氧化鈉 Sodium hydroxide AMRESCO
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磷酸氫鈉 Sodium phosphate dibasic anhydrous
AMRESCO
四甲基乙二胺 TEMED AMRESCO
Tris 緩衝液 Tris Buffer 0.5M Solution pH6.8
AMRESCO
Tris 緩衝液 Tris Buffer 1.5M Solution pH8.8
AMRESCO
聚山梨醇脂 20 Tween® 20 AMRESCO 聚乙二醇辛基苯基醚 Triton® X-100 AMRESCO
86 (inducer)來控制微生物合成含有標籤的 FhuA 蛋白質表現在外膜上，之後只 要再外加酵素 BirA 和生物素螢光衍生物 [Biotin (5-fluorescein) conjugated]，
透過螢光顯微鏡觀察 FhuA 蛋白質有沒有被標記成功 (Fig. 8-2)。
Fig. 8-1 質體的設計。
(A)為觀察微生物表面的蛋白質 FhuA，而將 BAP 標籤接在 FhuA 上， (B) 則是將兩個蛋白質 FtsZ/ZapA 分別接上 FtsZ-bap/ZapA-birA 的標籤，透過 啟動子 pBad 與誘發劑阿拉伯糖 (L(+)-Arabinose)來調控微生物做蛋白質的 合成。
接著，除了觀察微生物外膜上的蛋白質之外，我們還要觀察微生物體內蛋白 質與蛋白質之間的交互作用，分別是蛋白質 FtsZ 和蛋白質 ZapA，我們分別在兩
個蛋白質接上標籤和酵素，為 FtsZ-BAP 與 ZapA-BirA (Fig. 8-1 (B))並利用啟動
子 (promoter)和誘發劑 (inducer)來控制微生物合成，最後再加入生物素螢 光衍生物 [Biotin (5-fluorescein) conjugated]並用螢光顯微鏡觀察微生物中 的蛋白質與蛋白質的交互作用(Fig. 8-3)。