第五章 結論
II. 微生物蛋白質顯像技術
9.2 微生物體內蛋白質與蛋白質間的交互作用觀察
除了前面利用 biotinylation 的標記方法標記大腸桿菌的外膜蛋白質 FhuA 之外，我們還可以用來觀察大腸桿菌體內蛋白質 FtsZ 與蛋白質 ZapA 之間的交互作用。接著要探討 biotinylation 的標記方法，首先我們先透過 傳統的螢光蛋白標記法，先確定大腸桿菌內的蛋白質 FtsZ 的位置及實際觀 察時的情況，透過 Fig. 9-3 可以觀察出大腸桿菌中間明顯有一條紅色螢 光。
Fig. 9-3 利用顯微鏡觀察大腸桿菌體內 FtsZ 蛋白質接上紅色螢光蛋白。
左圖為相位差 (phase contrast)圖；右圖為螢光圖。
接下來，我們將兩個有交互作用的蛋白質 FtsZ 和 ZapA 分別接上標籤 與酵素 (FtsZ-BAP/ZapA-BirA)，再透過大腸桿菌將其表現之後，用實驗方 法 8.3 (B)的步驟標記並用顯微鏡觀察。
104
Fig. 9-4 利用顯微鏡觀察大腸桿菌 FtsZ-BAP/ZapA-BirA 在加入生物素螢 光衍生物之後的情況。
左圖為相位差 (phase contrast)圖；右圖為螢光圖。
105
透過比較可以發現，利用 biotinylation 標記方法可以觀察微生物體內 兩個蛋白質 (FtsZ/ZapA)之間的交互作用，也間接證明這兩者確實會靠近 產生交互作用形成位於細胞中間的環 (Z-ring)。
106
第十章 結論
本研究的目的要將 biotinylation 標記法應用在活體微生物上，利用 BirA 酵素將 BAP 標籤催化後接上生物素螢光衍生物，再透過螢光顯微鏡觀察，
而此方式大多是應用在標記哺乳類動物細胞的蛋白質。將欲觀察的大腸桿 菌外膜上的蛋白質 FhuA 接上 BAP 標籤，再加入純化後的 BirA 酵素、ATP 和生物素螢光衍生物標記，接著用顯微鏡觀察大腸桿菌可以看到，表面有 環狀或是點狀的螢光，對照傳統螢光蛋白標記也具有同樣的效果，可以支 持本方法的可靠性。另外將此方式運用在大腸桿菌體內蛋白質 FtsZ 與 ZapA 之 間 有 交 互 作 用 的 特 性 ， 將 其 分 別 接 上 標 籤 與 酵 素 (FtsZ-BAP/ZapA-BirA)，並在大腸桿菌表現之後只要外加生物素螢光衍生 物即可做標記，接著透過顯微鏡觀察到大腸桿菌中央有線狀或是環狀的螢 光，對照傳統螢光蛋白標記也具有同樣的效果。
此標記方法與傳統螢光蛋白標記方法效果差不多，但是花費的時間較 短，而且提供了另外一種新穎的標記方法，協助觀測微生物的蛋白質。
107
參考文獻
1. Verma, N.; Singh, M., Biosensors for heavy metals. BioMetals 2005, 18 (2), 121-129.
2. Yagi, K., Applications of whole-cell bacterial sensors in biotechnology and environmental science. Appl Microbiol Biotechnol 2007, 73 (6), 1251-8.
3. Reith, F.; Etschmann, B.; Grosse, C.; Moors, H.; Benotmane, M. A.; Monsieurs, P.; Grass, G.; Doonan, C.; Vogt, S.; Lai, B.; Martinez-Criado, G.; George, G. N.; Nies, D. H.; Mergeay, M.; Pring, A.; Southam, G.; Brugger, J., Mechanisms of gold
biomineralization in the bacterium Cupriavidus metallidurans. Proceedings of the National Academy of Sciences 2009.
4. (a) Brown, N. L.; Stoyanov, J. V.; Kidd, S. P.; Hobman, J. L., The MerR family of transcriptional regulators. FEMS Microbiology Reviews 2003, 27 (2-3), 145-163; (b) Ravel, J.; DiRuggiero, J.; Robb, F. T.; Hill, R. T., Cloning and Sequence Analysis of the Mercury Resistance Operon of Streptomyces sp. Strain CHR28 Reveals a Novel Putative Second Regulatory Gene. Journal of Bacteriology 2000, 182 (8), 2345-2349.
5. Perez Audero, M. E.; Podoroska, B. M.; Ibanez, M. M.; Cauerhff, A.; Checa, S.
K.; Soncini, F. C., Target transcription binding sites differentiate two groups of MerR-monovalent metal ion sensors. Molecular microbiology 2010, 78 (4), 853-65.
6. Checa, S. K.; Espariz, M.; Audero, M. E.; Botta, P. E.; Spinelli, S. V.; Soncini, F.
C., Bacterial sensing of and resistance to gold salts. Molecular microbiology 2007, 63 (5), 1307-18.
7. Jian, X.; Wasinger, E. C.; Lockard, J. V.; Chen, L. X.; He, C., Highly sensitive and selective gold(I) recognition by a metalloregulator in Ralstonia metallidurans. J Am Chem Soc 2009, 131 (31), 10869-71.
8. Checa, S. K.; Soncini, F. C., Bacterial gold sensing and resistance. Biometals 2011, 24 (3), 419-27.
9. Cerminati, S.; Soncini, F. C.; Checa, S. K., Selective detection of gold using genetically engineered bacterial reporters. Biotechnology and bioengineering 2011, 108 (11), 2553-60.
10. Wei, W.; Zhu, T.; Wang, Y.; Yang, H.; Hao, Z.; Chen, P. R.; Zhao, J., Engineering a gold-specific regulon for cell-based visual detection and recovery of gold. Chemical Science 2012, 3 (6), 1780.
11. Tseng, H. W.; Tsai, Y. J.; Yen, J. H.; Chen, P. H.; Yeh, Y. C., A fluorescence-based microbial sensor for the selective detection of gold. Chemical communications 2014, 50 (14), 1735-7.
12. Uttamapinant, C.; White, K. A.; Baruah, H.; Thompson, S.; Fernández-Suárez, M.; Puthenveetil, S.; Ting, A. Y., A fluorophore ligase for site-specific protein labeling
108
inside living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 2010, 107 (24), 10914-10919.
13. Lin, M. Z.; Wang, L., Selective labeling of proteins with chemical probes in living cells. Physiology 2008, 23, 131-41.
14. Chen, I.; Choi, Y. A.; Ting, A. Y., Phage display evolution of a peptide substrate for yeast biotin ligase and application to two-color quantum dot labeling of cell surface proteins. J Am Chem Soc 2007, 129 (20), 6619-25.
15. Li, Y.; Sousa, R., Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation. Protein expression and purification 2012, 82 (1), 162-7.
16. Chen, I.; Howarth, M.; Lin, W.; Ting, A. Y., Site-specific labeling of cell surface proteins with biophysical probes using biotin ligase. Nature methods 2005, 2 (2), 99-104.
17. Plançon, L.; Janmot, C.; le Maire, M.; Desmadril, M.; Bonhivers, M.; Letellier, L.; Boulanger, P., Characterization of a High-affinity Complex Between the Bacterial Outer Membrane Protein FhuA and the Phage T5 Protein pb5. Journal of Molecular Biology 2002, 318 (2), 557-569.
18. Slavoff, S. A.; Liu, D. S.; Cohen, J. D.; Ting, A. Y., Imaging protein-protein interactions inside living cells via interaction-dependent fluorophore ligation. Journal of the American Chemical Society 2011, 133 (49), 19769-76.
19. Fernandez-Suarez, M.; Chen, T. S.; Ting, A. Y., Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society 2008, 130 (29), 9251-3.
20. Mohammadi, T.; Ploeger, G. E.; Verheul, J.; Comvalius, A. D.; Martos, A.;
Alfonso, C.; van Marle, J.; Rivas, G.; den Blaauwen, T., The GTPase activity of Escherichia coli FtsZ determines the magnitude of the FtsZ polymer bundling by ZapA in vitro. Biochemistry 2009, 48 (46), 11056-66.
21. Buss, J.; Coltharp, C.; Huang, T.; Pohlmeyer, C.; Wang, S. C.; Hatem, C.; Xiao, J., In vivo organization of the FtsZ-ring by ZapA and ZapB revealed by quantitative super-resolution microscopy. Molecular microbiology 2013, 89 (6), 1099-120.
22. 戴珮琳. 利用化學標定及質譜技術分析經脂多醣刺激後小鼠巨噬細胞 (RAW 264.7) 之比較分泌蛋白質體研究. 國立臺灣師範大學, 2013.