探討不同 C 肝病毒基因型對患者代謝特徵與肝臟組織學關係的影

研究設計為回溯性世代分析(retrospective cohort study)：利用先前已收集之 528 位慢性 C 肝患者的臨床資料，包括身高、體重、BMI、血液、生化、

肝功能、病毒學、血清代謝特徵與肝臟組織學檢查資料。利用單變項與多 變項分析方法，比較不同C 肝病毒基因型感染對患者血清中代謝特徵與 肝臟組織學纖維化嚴重程度關係的影響性。

二、 C 肝病毒蛋白對葡萄糖及脂肪代謝訊息傳遞途徑的影響和機制

利用能表現 C 型肝炎病毒核心蛋白之肝癌細胞株(HuH-7)，分析 C 型肝炎 病毒核心蛋白量對於細胞三酸甘油酯與總膽固醇表現量之影響以及對於 葡萄糖與脂肪代謝訊息傳遞途徑上相關基因之核醣核酸表現量之影響

利用表現不同濃度C 肝基因型第一型病毒核心蛋白的肝癌細胞株 (Huh 7-based cell lines)來分析脂肪與膽固醇合成途徑上的重要基因的表 現，包括固醇調節區域結合蛋白1c 與固醇調節區域結合蛋白 2 (SREBP1c, SREBP2)，醯基輔酶 A 合成酶(acyl-CoA synthetase short-chain family member 2, ACSS2) ，腺苷三磷酸檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase)， 3-羥 基-3-甲基戊二酸單醯輔酶 A 合成酶以及還原酶

(3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A (HMG-CoA) synthase, HMG-CoA reductase)，微粒体三酸甘油酯轉移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein, MTTP) 以及法尼基轉移酶 1 (farnesyl-diphosphate

farnesyltransferase 1, FDFT1)。吾人首先將細胞的三酸甘油酯與總膽固醇 萃取出來後，比較C 肝基因型第一型病毒核心蛋白對三酸甘油酯與總膽 固醇表現量的影響。其次將細胞內的核醣核酸萃取出來後利用real-time PCR 來分析上述基因傳訊核醣核酸(mRNA)的表現量。

三、實驗材料及方法

血清學標記檢驗

B型肝炎表面抗原和C肝抗體將使用commercial kits (Ausria II, HCV EIA II, Anti-Delta, Abbott Laboratories, North Chicago, IL, USA)來檢驗。血 清中脂締素濃度以ELISA assay (Human Adiponectin ELISA Kit, B-Bridge International, Inc., CA, USA)來分析。所有的檢驗試劑將按照廠商所提供的 操作流程進行。

C 型肝炎病毒核醣核酸的萃取與檢驗方法：

我們先使用QIAmp^R Viral RNA Mini Kit 將血清中的 C 型肝炎病毒核 醣核酸分離出來，再利用反轉錄聚合酶連鎖反應(rtPCR)來取得互補雙股 去氧核醣核酸(cDNA)，並利用聚合酶連鎖反應(PCR)來大量增殖這段 cDNA。反轉錄聚合酶連鎖反應(rtPCR)的分析方法則有兩種：分別是使用 LightCycler 的方法以及一般實驗室 in house 的方法。利用 LightCycler 的 分析方法可以在一個單一毛細管中，結合及時聚合酶連鎖反應( real time PCR ) 和及時偵測各亞型特有之單一核苷酸( genotype-specific single nucleotide polymorphism, SNP ), 使用螢光探針( fluorescence hybridization probes ) ，藉由偵測 Ct 值以及加熱解離曲線( melting curve ) 來完成血清 中的C 型肝炎病毒核醣核酸之定量與定性分析。至於使用 in house 的反轉 錄聚合酶連鎖反應方式所得到的cDNA，則是採用特定 PCR 引子之定型 法 ( PCR with type-specific primers) 來鑑別 C 型肝炎病毒的基因型^{64, 157}。

細胞培養(Cell culture)

將 在 37℃ ， 5%CO2 並 且 含 有 10% 胎 牛 血 清 (fetal bovine serum, FBS:Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) 與 2%

Penicillin-Streptomycin 與 L-glutamine 的 Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)中的 HuH-7 細胞以密度為 9 x 10⁵ cells per 60-mm dish 或 是4.5 x 10⁵ cells per well in 6-well 的方式，在進行轉殖前先培養 24 小時。

C191/S2 、#3、#6、#7 以及#21 為以 Huh-7 細胞為基礎帶有嵌入 C 肝基因型 第 1b 型病毒核心蛋白基因片段(cDNA fragments) 的 S2 載體(S2 retrovirus based vector)之複製子(replicons)，能穩定表現不同濃度 C 肝基因型第一型病 毒核心蛋白(為陽明大學黃麗華教授所提供)。帶有這些複製子的細胞將以 上述培養 HuH-7 細胞之培養液中加入濃度為 400 µg/ml 的 G418 (Geneticin;

Gibco-BRL) 來進行培養。

質體(Plasmid constructions)

C 肝基因型 1b 型或 3a 型病毒核心蛋白基因片段(cDNA fragments)乃是 利用C 肝患者治療前血清萃取與複製而得來的(為日本廣島大學茶山教授所提 供，Dr. Kazuaki Chayama, Hiroshima University, Hiroshima, Japan.)簡言之，所有的

質體皆是以標準的重組DNA 技術所分離出來的，使用 PCR 的方式利用 C 肝病 毒核心蛋白基因的引子(primer)以及 DNA 聚合酶(KlenTaqLA DNA

polymerase，Ab Peptides, Inc. USA) ¹⁵⁸增加C 肝基因型 1b 型或 3a 型病毒核心 蛋白基因的複製片段。PCR 的複製產物將以電泳的方式來檢驗與分離

(electrophoresis on 2.5% agarose gel)，DNA 片段於定序後將進行限制酶的切割並嵌 入p3xFLAG-CMV^TM-10 vector (SIGMA, Missouri, USA)載體之中，於再次定序之 後將所需要的質體選殖出來。

細胞轉殖並選殖穩定細胞株(Transfection and selection of stable clones)

HuH-7細胞以密度為9 x 10⁵ cells per 60-mm dish的方式，在進行轉殖前 先培養24小時，再使用Arrest-InTM Transfection Reagent(GenDiscovery Biotechnology, Inc, Taiwan)並按照所提供的操作流程來進行來細胞轉殖，將 能表現C肝病毒核心蛋白之PCR產物的質體轉殖至肝癌細胞內。簡言之，

混合4µg (DNA) 的質體與21µl Arrest-In^TM Transfection Reagent試劑，並放 置混合液於室溫下20分鐘，之後加入混合液於細胞的培養液中。先將細胞 先培養於不含G418之培養液中24小時，再培養於含G418 800µg /ml的培養 液中。轉殖後每隔3至4天進行選殖一次直至單一細胞株被選殖出來。

分離並反轉錄細胞內之核醣核酸(RNA isolation and reverse transcription)

利用TRIzol® reagent (Invitrogen^TM, California, USA.) 的試劑將細胞之核醣核 酸萃取出來，然後將1µg 的 RNA 混合 ReveTra Ace (TOYOBO, Japan)以及 20µl 之混合試劑(包含25pmol的random primer (TaKaRa Bio Inc, Japan) 與10.8µl RNase free water)來進行 RNA 的反轉錄作用。混合試劑將先於 65°C 下進行反應 5 分鐘 後再加入4µl 的 5x buffer、2µl 的 10mM dNTP、2µl 的 0.1M DTT、0.2µl 的 RNase inhibitor (TaKaRa Bio Inc, Japan)與 1µl 的 Revetra Ace。然後置於 30°C 下進行反應 10 分鐘，42°C 下進行反應 60 分鐘， 95°C 下進行反應 5 分鐘，最後將 cDNA 儲 藏於-80°C 冰箱內。

聚合酶連鎖反應(Real time-PCR)

使用 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems)以及 Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)來進行個基因產物的聚 合酶連鎖反應。簡言之，將1pmol 的 sense 以及 anti-sense specific primers (表 32)，12.5µl 的 SYBR Green PCR Master Mix，1µl 的 cDNA 以及 9.5µl 的 distilled water 混合。PCR cycle conditions 為 50°C 下進行反應 2 分鐘，95°C 下進行反應10 分鐘，95°C 下進行反應 15 秒以及 60°C 下進行反應 1 分鐘共 40 cycles。Huh-7 cells 將被逐倍稀釋成 (10 倍、 50 倍、100 倍、500 倍以及 1000 倍) 以作為標準曲線的相對定量使用(standard curves of relative quantitation)，而 36B4 基因的表現量將被使用來作為其他基因的比較基準 (endogenous control gene)。

PCR 產物轉殖後對於細胞所可能造成的不良反應，將以細胞的外型、

生長速率、non-HCV 蛋白質的表現以及細胞毒性等來做分析。細胞毒性的 分析是以MTS assay 與 CellTiter96 Aqueous 1 solution proliferation assay (Promega, Madison, WI)按照標準的操作流程來進行。Non-HCV 蛋白質乃 是分析甲型胎兒蛋白(α-fetoprotein)的表現量使用 AFP kits of AXSYM systems(Abbott, GmbH Diagnostica, Wiesbaden, Germany) 來測量的。

汙染控制(Contamination control)

為避免實驗時假陽性的產生，將依照Kwok與Higuchi (1989)的建議進 行PCR。

西方點墨法(Western Blots)

將細胞溶解後加入1 mL 的萃取液，以高速離心後取上清液。接著將 上清液加入 TCA 使蛋白質沉澱，然後再用高速離心，並於離心後丟棄上 清液。接著利用高熱使蛋白質分子變性，使用膠體電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)將蛋白質依其個別的分 子量分離開，然後利用轉印設備將膠體中的蛋白質轉移至硝基纖維紙上，

再將鍵結有蛋白質的硝基纖維紙與含有標定特殊物質的專一性抗體作用 (此一級抗體可以辨識並鍵結至特殊蛋白上, immunoblot)。將可辨識前述特

定抗體並且結合(HRP)horseradish peroxidase 的二級抗體與之作用，就可以 鑑定出有含特定胺基酸的蛋白質¹⁵⁹。

測量細胞三酸甘油酯以及總膽固醇的濃度(Measurements of cellular triglyceride and total cholesterol concentration)

將細胞溶解後依照蛋白質的濃度來進行調整，並使用 Trinder-based colorimetric end-point assays (Randox Laboratories Limited, Crumlin, UK)的 方法，利用酵素與直接分光光度計來量測細胞三酸甘油酯以及總膽固醇的 濃度¹⁶⁰。

胰島素抗性的計算方式：

胰島素抗性的計算方式(IR)是採用 homeostasis model assessment^{64, 161} HOMA-IR=fasting insulin ( mU/L) x fasting glucose ( mg/dL) x

0.05551/22.5

抗病毒治療反應的定義

對於抗病毒治療達到持續病毒學反應(sustained virological response，

SVR)，乃是收案者在接受合併治療結束後之第6個月時接受C型肝炎病毒 核醣核酸之定性檢查為陰性反應者。對於抗病毒治療無持續病毒學反應 (non-SVR)乃是收案者在接受合併治療結束後之第6個月時之C型肝炎病毒 核醣核酸之定性檢查為陽性反應者。快速病毒學反應(RVR)定義為收案者 在接受合併治療4週時檢測不到病毒量；早期病毒學反應(EVR)定義為收案 者在接受合併治療12週時病毒量至少下降100倍者；c-EVR(complete EVR) 定義為無RVR者在治療第12週時檢測不到病毒量；p-EVR(partial EVR)定 義為無RVR者在治療第12週時病毒量下降100倍者。復發者(relapser)乃是 收案者在接受合併治療結束時之C型肝炎病毒核醣核酸之定性檢查為陰性 反應，但是在合併治療結束後之第6個月時接受C型肝炎病毒核醣核酸之定 性檢查為陽性反應者。對於抗病毒治療達到生化反應者乃指收案者在接受 合併治療結束後之第6個月時ALT數值仍在正常範圍者。

統計分析

所有類別變項是以Fisher exact test, Chi-square test, Mann-Whitney U-test 和 Kruskall-Wallis test 的方法做分析，對於各種連續變項則是以 t-test 方法做分析，各組之間的比較乃是以ANOVA 方法做分析。對於各種獨立 變項以及胰島素抗性、代謝、脂肪激素和細胞激素等相關因子作多變項線 性回歸分析、邏輯式回歸分析以及Pearson’s correlation test。所有的統計數 值皆是以統計軟體Stata statistical software (version 8.0, Stata corp, College Station, Tex)來進行分析的結果，分析都採雙尾檢定，當 p 值小於 0.05 時 被認為具有統計學上的意義。

叁、結果

一、葡萄糖代謝及脂肪代謝與 C 型肝炎病毒感染之相關性研究

1.1 探討慢性 C 肝病毒感染與患者體內代謝特徵的關係性

病例組與對照組之臨床特徵比較

慢性C 肝患者較健康成人有較低的血清三酸甘油酯、總膽固醇以及低 密度膽固醇脂蛋白(LDL)濃度，但是有較高的 HDL 以及 ALT 濃度 (表 4)。

由於當患者有較嚴重的肝臟纖維化時常會伴隨有較高的胰島素濃度 (hyperinsulinemia)以及葡萄糖耐受不全(impaired glucose tolerance)的現 象，為了檢視本研究患者肝臟疾病的嚴重程度，吾人分析了461 位慢性 C 肝 患 者 的 血 小 板 數 目 (platelet count, PLT) 以 及 Aspartate Aminotransferase-to-Platelet Ratio Index (APRI) (表 5)。假如以 APRI=1¹⁶²為 顯著肝臟纖維化的分界點(cutoff level of significant hepatic fibrosis)時，本研 究中51% 的收案者皆有顯著的肝臟纖維化或硬化。

慢性 C 肝患者的血清代謝特徵

利用多變項線性迴歸方法控制年齡、性別與體格指標等變相後分析慢 性C 肝感染與血清代謝特徵的關係時，吾人發現慢性 C 肝病毒感染與 ALT 值間存有正比例的關係，與血清三酸甘油酯及總膽固醇濃度則成反比例的 關係(表 6)。

ALT 值與慢性 C 肝患者的血清代謝特徵的關聯性

ALT 值與慢性 C 肝患者的血清代謝特徵的關聯性