肝纖維化及肝硬化的發展，源自於慢性的肝細胞受損後的修復 過程。肝纖維化的發展過程中，會大量增加自由基表現12。脂質過氧 化，一種自由基傷害後的產物， 長久以來被認為與慢性肝損傷、肝纖 維化有密切關聯12。一般認為肝纖維化發生時，肝細胞先受損，因而增 加脂質過氧化產物，活化庫氏細胞，釋出細胞激素，也使星狀細胞活 化，大量的 α-smooth muscle actin (α-SMA)和膠原蛋白表現192。但是，
脂質過氧化產物對於肝纖維化是否有直接的促進關係，仍是有爭議 的。
在動物實驗證實魚油(屬於多元長鏈不飽和脂肪酸)，在四氯化碳 模式214，或在酒精誘導肝損傷模式113都不會加重傷害的誘導程度。根 據 Iritani 等人141發表，大鼠餵以玉米油，會增加脂質過氧化產物，但 未提及傷害的發生。
在星狀細胞部分，多數學者認為脂質過氧化產物如丙二醛， 4-hydroxynonenal (4-HNE)和 F2-isoprostanes，會直接活化星狀細胞12, 83, 215-217。但是，有相反的論點認為丙二醛(malondialdehyde, MDA)或 4-HNE 並不會促使星狀細胞活化218，也指出 MDA 能使細胞週期停滯(arrest)
219。
從我們前一篇研究結果來看，玉米油合併四氯化碳使用時，會 產生大量的脂質過氧化產物，但並未加重大鼠的四氯化碳誘導肝損 傷，只加重了脂肪肝的情況。因此，脂質過氧化產物對肝纖維病程的 影響，仍需更近一步的釐清。本實驗的第一部分是動物實驗，目的是
透過單獨給予玉米油或四氯化碳的時間點差異，能藉此了解不同來源 的脂質過氧化產物對肝纖維化的影響。第二部分是直接使用大鼠的肝 細胞和星狀細胞為實驗材料，加入 TGF-β1 和 MDA 等脂質過氧化產 物，藉此釐清脂質過氧化產物對細胞直接的影響。
材料與方法
一、 材料
1. Sigma-Aldrich, USA ： 膠 原 蛋 白 分 解 酶 (Collagenase type IV) 、 CaCl2、triton X-100、DMSO、trypsin-EDTA、paraformaldehyde 2. BioSource, USA：ApoTarget Annexin-V FITC Apoptosis 套組 3. Promega, USA：MTS 試劑
4. HyClone, USA：RPMI 培養液，L-15 培養液 5. GeHealthcare, Sweden：percoll
6. BD, USA：Titanium Taq polymerase kit
7. Cambrex, USA：Sybr-Green nucleic acid stain 二、 動物
使用 Wistar 雄性大鼠，體重 250-300 公克，購自國家實驗動物 繁殖及研究中心。餵養環境維持22 ± 3℃，相對溼度 55 ± 5％，光照為 12 小時亮 12 小時暗(早上七點亮，下午七點暗)的環境，自由飲水及攝 食。
三、 四氯化碳及玉米油的給藥方式
四氯化碳組大鼠誘導方式如第二章所述，將大鼠分為 3 組，每 週投與兩次四氯化碳，分別於開始投與四氯化碳後滿二、四、八週 時，將動物犧牲，犧牲方式如第二章所述。
玉米油組大鼠則分為 6 組，每天分別投予玉米油，劑量分別是 2 ml/kg 或 10 ml/kg 體重，共 6 組，分別於開始投與四氯化碳後滿二、
四、八週時，將動物犧牲，犧牲方式如第二章所述。另有 3 組大鼠，
但只餵食一次水，於實驗開始進行之後滿二、四、八週時，將動物犧 牲，犧牲方式如第二章所述。
四、 血液生化值檢驗
血 漿 處 理 方 式 ， 如 第 三 章 所 述 。 血 液 生 化 值 測 定 項 目 包 括 Alanine aminotransferase (ALT) 、 Aspartate aminotransferase (AST) 、 albumin、triglycerin。
五、 肝中三酸甘油酯含量
實驗步驟參考第二章所述。
六、 肝臟脂質過氧化產物測定 實驗步驟參考第二章所述。
七、 肝臟中 8-iso-PGF2α 含量分析 實驗步驟參考第四章所述。
八、 肝臟中 15-keto-PGF2α含量偵測 實驗步驟參考第四章所述。
九、 肝臟羥基脯胺酸含量測定 實驗步驟參考第二章所述。
十、 肝中 protein carbonyl 含量測試 實驗步驟參考第三章所述。
十一、mRNA 表現分析
RNA 萃取及 cDNA 合成如第二章所述。
半定量式 PCR (Real time PCR)：將 cDNA 稀釋 100 倍，將下列 材料: 取去離子水 17 μl、10X Titanium Taq PCR buffer 2.5μl、10 mM dNTP 1μl、Sybr-Green (1: 1000）1μl、50X Titanium Taq polymerase 0.5μl、引子 各 1μl、cDNA 1μl，混合均勻後，以 Rotor Gene 2000 (Corbett Research) 進 行 反 應 及 並 以 軟 體 (Rotor Gene Real-time amplification system)分析之，分析方式如第二章所述。
此部份分析基因為
Collagen (αI)(I), transforming growth factor- β 1
(TGF-β 1), cyclooxygenase-2 (COX-2), methionine adenosyltransferase 1A
(MAT1A), methionine adenosyltransferase 2A (MAT2A)，所用引子列於表 十一。十二、 病理檢驗
切片組織處理，如第二章所述，分為三種染色分別是蘇木青及 伊紅染色（Hematoxylin 和 Eosin stain） 及天狼星紅染色（Sirius Red stain），以便評估肝纖維化程度，以及 α-SMA 的免疫化學染色，藉以 評估星狀細胞活化程度。結果判讀如第二章所述。
十三、 大鼠星狀細胞分離和培養
分離星狀細胞之步驟，參考自 Mudra 和 Parkinson 發表以及 Froh 等人發表之方法220, 221，大鼠約 300 公克，以乙醚深度麻醉，75% 酒精 擦拭腹部，剪開腹部之後，將腸胃向右翻轉，找出肝門靜脈及下腔大 靜脈。以止血鉗將下腔大靜脈夾住，頭皮針插入肝門靜脈三分之一處 用止血鉗夾住，用灌流液 (成分為: 磷酸鹽緩衝液+葡萄糖+胎牛血清)充 分灌流，同時剪開心臟，讓灌流液流出。灌流約 200ml 後，使肝臟呈 現紅灰色，灌流時一邊按摩使血液及血球沖洗乾淨。之後加入膠原蛋 白酶及 CaCl 灌流。將肝剪下，放置於 10 公分培養皿，將肝剪成小碎
片，再倒入 100 ml 燒杯中，放到培養箱 37 ℃中，充分攪拌反應五分 鐘。取出用100 號網篩過篩，懸浮液放入 50 ml 離心管，離心 100 g、3 分鐘、4℃，收集上清液後，沉澱物再加入 L-15 培養液混合均勻，離 心 100 g、3 分鐘、4℃。將上清液統一收集後，以 700 g 離心、7 分 鐘、4℃，沉澱物以 L-15 培養液均勻混合至 20 ml，和 50%、 25%
percoll 分別依 1: 2: 2 比例順序加入 50 ml 離心管，以 1800 g、15 分 鐘、4℃，收集下層液體 20 ml，離心 650 g、7 分鐘、4℃，為星狀細 胞，計算細胞數目後，以 RPMI 培養液稀釋至適當濃度，即可分盤培 養。
十四、細胞生長曲線分析
細胞濃度為1 x 105 cell/ml，培養於96孔盤中，每孔加入100 μl含 細胞培養液，分別加入以培養液配製之藥物，每個時間點將含藥培養 液更換為不含藥之新鮮培養液，再加入MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,
tetrazolium salt]試劑，培養12小時，以分光光度計490 nm 讀取吸光值，
除以只加培養液之對照組，即可獲得細胞存活率。MTS試劑原理為 MTS是一種有機鹽染料，只和活細胞內具有活性的琥珀酸脫氫酶起反 應，生成紅紫色的 Formazan 顆粒，被還原 Formazan 的生成量與存活 細胞數成正比關係。因脫氫酶只存在於活細胞線粒體內，而不存在於 上清液中，故特異性極高。
依照Kharbanda 等人文獻222，TGF-β1 選用 1 ng/ml 的濃度，避免 星狀細胞過度活化，而無法觀察脂質過氧化產物是否會促進星狀細胞 活化。
星狀細胞的部份，實驗分二部份進行，第一組是為除對照組 外 ， 全 部 均 加 入 TGF-β1 (1 ng/ml) ， 培 養 24 小 時 後 ， 分 別 加 入 MDA(10-4~-7M)、8-iso-PGF2α (10-4~-7M)和 15-keto-PGF2α (10-4~-7M)，時 間點為0，24，48，72 小時；第二組 TGF-β1 (1ng/ml)以及 MDA (10-4~
-7M)、8-iso-PGF2α (10-4~-7M) 和 15-keto-PGF2α (10-4~-7M)，分別加入細胞 中，時間點與第一組相同。
十五、 以西方墨點法分析星狀細胞之 α-SMA 表現
此部份實驗為取下初代培養星狀細胞 24 小時後進行，先加入 TGF-β1 (1 ng/ml)，培養 24 小時後，再分別加入 10-4M 的 MDA、8-iso-PGF2α 及 15-keto-PGF2α，48 小時後收集細胞，進行以西方墨點法分析 星狀細胞之α-SMA 表現。西方墨點法之步驟，如前所述。
十六、 雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡分析
每格數量為5 x 104 cell/ml 的細胞，培養於 24 well，內部放上滅 菌過之 13 mm 的圓形蓋玻片，24 小時後進行實驗，一組事先加入 TGF-β1 (1 ng/ml)，培養 24 小時後，另一組則不事先處理，再同時分別 加入 MDA、8-iso-PGF2α和 15-keto-PGF2α，濃度為 10-4和-7M，於第 48 小時，以 PBS 清洗 2 次，加入 4% paraformaldehyde 1 ml 固定，以 0.25% triton X-100/ 7.5% DMSO/ PBS 輕度振搖 10 分鐘，以 PBS 清洗 2 次，加入 1.5% BSA/PBS 1 小時，加入一級抗體 1：500 室溫下一小 時，以PBS 清洗 2 次，加入具 FITC 螢光的二級抗體避光反應一小時，
利用50% 甘油封片，即可進行觀察。
十七、 Flow cytometry 偵測細胞早期的計畫性凋亡
Annexin-V 為 35-36 kDa 大小的蛋白質，對細胞膜上磷脂醯絲胺 酸(phosphatidylserine) 有高度親和性，若細胞正值早期凋亡，細胞膜失
去對稱性或完整性(membrane integrity)，Annexin-V 就會與磷脂醯絲胺 酸結合，只要將 Annexin-V 接上 FITC 螢光物質，即可以螢光偵測細胞 膜受損的早期凋亡。如果細胞已經死亡，propidium Iodine（PI）染劑會 進入細胞中，與核苷酸結合，亦可以螢光偵測得知。偵測螢光為流式 細胞儀雷射 488 nm 激發，FITC 為綠色螢光，PI 為紅色螢光。
此實驗流程為取下初代培養星狀細胞 24 小時後進行，先加入 TGF-β1 (1 ng/ml)，培養 24 小時後，再分別加入濃度為 10-4M 的 MDA、8-iso-PGF2α及 15-keto-PGF2α，48 小時後進行此實驗。
使用ApoTarget Annexin-V FITC Apoptosis 套組進行實驗， 細胞 以 PBS 清洗二次後，加入 0.5 ml 0.1% trypsin-EDTA 置於 37℃，5 分鐘 後，輕拍培養皿底部，加入新鮮培養液以中和掉 trypsin 的作用。充份 混合細胞懸浮液，使細胞皆成為單一顆粒，以 PBS 清洗並離心 1000 rpm 5 分鐘二次，使細胞懸浮於 Annexin-V 結合緩衝液中，並調整細胞 濃度為 2 x 106 個/ml，取 0.1 ml 細胞懸浮液，加入 5 μl Annexin-V FITC ，10 μl PI（50 μg/ml），避光室溫下 15 分鐘，以緩衝液將體積補 足為0.5 ml，一小時內以 FACScan flow cytometer 分析。
十八、 統計方法
數 據 結 果 以 平 均 值 （mean ） ± 標 準 偏 差 （ standard diviation;
SD）表示，統計方法如前所述。以 P 值小於 0.05 表示在統計學上具有 顯著差異。
結果
一、 血液中 ALT、AST 活性和 albumin 濃度
血液中 ALT 酵素(圖二十一)、AST 酵素(圖二十二)和 albumin 含 量(圖二十三)，第二、四和八週四氯化碳誘導大鼠的血漿值與控制組相 比，有明顯差異，ALT 酵素分別上升 378.9%、1921.5%、4394.2%，
AST 酵素分別上升 272.3%、2088.9%、3093.5% 和 albumin 含量第八週 下降22.2%，但給玉米油組並無明顯影響。
二、 血液和肝臟中三酸甘油酯含量
如圖二十四所示，四氯化碳誘導大鼠的三酸甘油酯含量與控制組 相比，在第二週及第四週，分別降低 60.8%、67.9%，於第八週則無影 響。玉米油組在第二、四週沒有影響，第八週上升54.6%。
如圖二十五所示，四氯化碳誘導大鼠的肝臟三酸甘油酯含量與控 制組相比，第二週沒有影響，在第四週及第八週，分別上升 25.5%、
32.0%。玉米油組肝臟中三酸甘油酯在第二、四、八週有明顯上升的情 形，分別上升 62.6%、29.0%、77.3%。
三、 肝臟脂質過氧化含量
在脂質過氧化含量方面，如圖二十六所示，四氯化碳組與控制 組相比，在第二、四、八週分別增加 69.4%、121.2%、115.4%。而玉 米油高劑量組在第四、八週則比控制組分別高出103.0% 和 124.6%。
四、 肝臟 8-iso-PGF2α含量
在肝臟 8-iso-PGF2α含量方面，如圖二十七所示，四氯化碳組與 控制組相比，在第二、四、八週分別增加 441.4%、581.8%、512.8%。
而 玉 米 油 組 高 劑 量 組 與 控 制 組 相 比 ， 在 第 二 、 四 、 八 週 分 別 高 出 230.2%、269.0% 和 443.1%。
五、 肝臟 15-keto-PGF2α
.含量
在肝臟 15-keto-PGF2α含量方面，如圖二十八所示，四氯化碳組 與控制組相比，在第二、四、八週分別增 87.3%、220.5%、285.7%，
但給玉米油組對此並無明顯影響。
但給玉米油組對此並無明顯影響。