前言
枳椇子(Hovenia dulcis) ，為傳統中藥，為急性酒精中毒解毒 劑，止吐和緩瀉劑17。
果實內成分含有類黃酮 (flavonoids)，如(+)-ampelopsin、hovenitins I 17 。 藥 理 學 研 究 結 果 指 出 hovenitin I 對 小 鼠 D-galactosamine/lipopolysaccharide 或 四氯化碳模式的肝損傷有保護作用
17。Hase 等人的報告指出， (+)-ampelopsin 也有肝保護作用19。
枳椇子對於慢性肝損傷的作用仍然不清楚。本實驗的目的要探 討枳椇子之酒精萃取物對於小鼠四氯化碳誘導慢性肝損傷的影響。
方法與材料
一、 試劑
1. Sigma-Aldrich, USA：Diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH), Catechin。
二、 植物抽取物製備
枳椇子購自於台中草藥市場，經由中國醫藥大學中國藥學研究 所陳忠川教授鑑定，確認無誤。
枳椇子的傳統炮製法為浸泡於酒中，所以本實驗採用酒精萃取 有效成分。枳椇子 (20 kg) 用 40 公升酒精萃取三次，之後過濾，溶媒於 500C 進行減壓濃縮，酒精萃取得的濃縮物(ethanolic extract of the fruit of
Hovenia dulcis, EHD) 冰存於–30
0C 備用。萃取率約 16 %。三、 酚類化合物及抗氧化活性測試
植物中酚類化合物含量，被視為一種具有抗氧化能力和抗自由
基效果的特徵234。許多報告指出含有高抗氧化物質，多數有抗纖維化
作用67, 235。此實驗中，分析總酚類含量及自由基清除能力，確認本實
驗物質的藥理作用特性。
總酚類含量測試法：以 Folin-Ciocalteu 反應法118。取枳具子萃 取液1 ml 加入 0.1 ml Folin-Ciocalteu 和 0.2 ml 10% Na2CO3。混合均勻 後，水浴 99 1 ℃ 分鐘。待冷卻後，以分光光度計（Hitachi U-2001）
700 nm 測定反應後產物吸光值，以 catechin 為標準品。
EHD 的 DPPH 自由基清除能力測試，修改自 Chang 等人236之方 法， 以 0.1 mM DPPH/methanol 加入不同濃度萃取液或以 methanol 當對 照組。室溫下靜置 30 分鐘，於分光光度計以波長 517 nm 測試。
四、 動物
實驗動物使用 ICR 雄性小鼠，購自國家實驗動物繁殖及研究中 心。餵養環境維持 22 ± 3℃，相對溼度 55 ± 5％，光照為 12 小時亮 12 小時暗(早上七點亮，下午七點暗)的環境，自由飲水及攝食。
五、 四氯化碳誘導肝損傷模式
小鼠之四氯化碳誘導方式如第六章所述，EHD 劑量為 0.5 或 1.0 g/kg 體重，口服，每天給藥。實驗時間共為九週。
给四氯化碳滿三和六週後，收集小鼠後眼窩血管叢之血液，進 行生化值分析。滿九週小鼠犧牲時，血液和肝臟處理方式如前所述。
六、 肝臟功能分析
血漿處理如第三章所述，分析項目為 alanine aminotransferase (AST)、aspartate aminotransferase (ALT)。
七、 肝臟脂質過氧化產物和羥基脯胺酸含量分析
肝臟脂質過氧化產物和羥基脯胺酸含量測定，如第二章所述。
八、 RNA 萃取以及 mRNA 表現分析 (real-time quantitative reverse transcriptase- polymerase chain reactions, RT-qPCR)
實驗處理如第五章所述。
本實驗主要的分析基因為
collagen (α1)(I) ， collagen (α1)(III) ， methionine adenosyltransferase 1A (MAT1A) 和 methionine adenosyltransferase 2A (MAT2A)，詳細引子如表十五所述。
九、 病理檢驗
病 理 組 織 處 理 如 第 二 章 所 述 。 進 行 蘇 木 青 及 伊 紅 染 色 (Hematoxylin 和 Eosin stain） 及天狼星紅染色（Sirius Red stain），以 便評估肝纖維化程度。
肝纖維化判斷及統計分析方法，如第二章所述。
十、統計方法
數據結果以平均值（mean）± 標準偏差（standard diviation，
SD）表示，統計方式如前所述，以 P 值小於 0.05 表示在統計學上具有 顯著差異。
結果
一、酚類化合物及抗氧化活性測試
1. 測得 EHD 總酚類含量為 27.2 μg/mg。
2. EHD 和 catechin 相對清除 DPPH 50 % 的能力，分別為 0.94 mg/ml 、5.42 μg/ml。EHD 具有明顯的清除 DPPH 自由基的能力。
二、 血漿中 AST 和 ALT 活性
如表十六所示，第三、六和九週的小鼠 ALT 和 AST 血液生化 值，單獨給予四氯化碳組，會明顯高於控制組，且此組的數據，有時 間依賴性的關係，以第九週數值最高。而投與 EHD (0.5 或 1.0 g/kg)的 組別，則是在第三週與四氯化碳組相比，明顯降低 ALT 和 AST 的活 性。EHD 1.0 g/kg 的劑量，則在第六週及第九週都能降低因四氯化碳而 增加的ALT 和 AST 活性。
三、 肝臟脂質過氧化及羥基脯胺酸含量
如表十七所示，四氯化碳組能增加小鼠中肝臟脂質過氧化產物 和羥基脯胺酸含量，相較於控制組分別高出 60% 和 66.7%。投與 EHD (0.5、1.0 g/kg)能明顯降低肝臟脂質過氧化產物和羥基脯胺酸含量，相 較於四氯化碳組分別降低了18.8 %、31.3% 和 22.5%、25.4%。
四、 肝組織中基因 mRNA 表現結果分析
如圖四十九所示，肝臟組織的 RT-qPCR 基因表現分析，包括
collagen ( α 1)(I)、 collagen ( α 1)(III) 和 MAT2A，四氯化碳組分別高出控
制組 46.1%、70.0% 和 140.0%。EHD 1.0 mg/kg 組與四氯化碳組相比 較，能降低 collagen (α 1)(I)，collagen ( α 1)(III) 和 MAT2A mRNA 的表
現，分別降低 18.2%、29.4% 和 41.7%。四氯化碳組的 MAT1A 的基因 表 現 ， 低 於 對 照 組 50.4% ， EHD 1.0 mg/kg 組 比 四 氯 化 碳 組 增 加 96.4%。五、 病理切片結果分析
四氯化碳組的切片染色結果，顯示於中央靜脈區有嚴重的細胞 壞死，廣泛的發炎浸潤表現，和纖維化的病徵，結果如圖 五十 B 及 五 十 E，統計結果如表十六。相較之下，投與 EHD 的小鼠肝臟，則是呈
現較輕微的細胞壞死及浸潤現象，結果如圖 五十 C 及 五十 F，統計結 果如表十六所示。
討論
本實驗結果顯示，小鼠口服投與枳椇子之酒精萃取物，能有效 的降低四氯化碳所誘發之肝纖維化。可以從ALT 和 AST 的血液生化值 中，以及肝臟的
collagen ( α 1)(I)和 collagen ( α 1)(III) mRNA 表現的結果
得到印證。ALT 和 AST 等兩項血液生化值，被認為肝臟細胞壞死的重要生 化指標211。在小鼠投與四氯化碳誘發肝細胞受損，血液中 ALT 和 AST 活性，在第三、六、九週有明顯的增加。第三週時，EHD 能明顯降低 ALT 和 AST 活性，顯示 EHD 有明確的肝細胞保護作用。枳椇子的肝 保護作用在第六和第九週變弱，這可能是因為慢性四氯化碳在第六週 和第九週時，肝臟傷害越來越嚴重，低劑量的 EHD 無法抵抗四氯化碳 毒性所致。
當肝臟受損時，MAT1A 表現會下降，而 MAT2A 表現會被啟動
195。在本實驗中，在四氯化碳的慢性肝損傷下，會降低
MAT1A 的表
現，而
MAT2A 的表現則是增加的。EHD 組的表現，正好相反，更支持
了 EHD 對小鼠四氯化碳誘導肝損傷有保護作用。
肝 纖 維 化 是 慢 性 肝 發 炎 的 修 復 過 程 ， 會 使 細 胞 外 間 質 (extracellular matrix protein) 聚集，特別是膠原蛋白70。而羥基脯胺酸是 膠原蛋白中的特有胺基酸成分23。羥基脯胺酸的量，會反應出膠原蛋白 的聚集的程度，可以藉由羥基脯胺酸的量來評估纖維化程度23。當四氯 化碳誘導肝損傷時，羥基脯胺酸含量會明顯增加，EHD 組的小鼠肝臟
可以降低羥基脯胺酸含量，顯示 EHD 組的纖維化程度較輕。此外，許 多研究指出，在肝纖維化時，膠原蛋白第一型和第三型表現會明顯上 升237。本實驗的 EHD 組 Collagen (
α 1)(I) 和 collagen ( α 1)(III)的 mRNA
表現結果明顯降低。這些結果也與病理切片結果相互印證，EHD 確能 減緩四氯化碳誘導的肝損傷。四氯化碳誘導肝毒性的機轉，主要會增加自由基的生成，和產 生脂質過氧化233。一般認為脂質過氧化與肝纖維化有相當密切的關 係，在四氯化碳誘導肝纖維化模式中，可以偵測到較高的脂質過氧化 產物232。在本實驗也印證了此項結果，四氯化碳組有較高的脂質過氧 化產物，EHD 能減少肝臟脂質過氧化產物的產生，顯示 EHD 本身的抗 氧化能力抑制脂質過氧化的作用，減緩了肝纖維化的發展。
Yoshikawa 等人17曾經報告枳椇子中含有數種類黃酮。類黃酮類 化合物具有酚基，故也具有抗氧化及抗自由基之功能234。本研究中也 測得 EHD 有很強的清除 DPPH 自由基的能力。清除 DPPH 自由基能 力，被認為與抑制脂質過氧化能力相關238, 239。所以，EHD 的抑制脂質 過氧化的結果，可以視為是因為清除DPPH 自由基的能力所致。
結論，口服投與枳椇子酒精萃取物對於四氯化碳誘導的小鼠慢 性肝損傷，具有肝臟保護作用，其影響機制應該是透過抗氧化作用而 來。
Table 15. Primer Sequences for PCR Amplification. (EHD)
mRNA Primer sequence Length
(bp) Collagen(α1)(I) Sense 5’ CGA CTA AGT TGG AGG GAA CGG TC3’ 319
Antisense 5’ TGG CAT GTT GCT AGG CAC GAC3’
Collagen(α1)( III) Sense 5’ CGA GGT GAC AGA GGT GAA AGA 3’ 336 Antisense 5’ AAC CCA GTA TTC TCC GCT CTT 3’
MAT1A Sense 5' CGG TAG GAA AAG GGC ATCC 3' Antisense 5' GGG ACT GTT GCT CCA GAA CC 3’
270
MAT2A Sense 5’ GCA TCT GCG CCC TCC GCA GT3’ 420 Antisense 5’ GTG ACT GTT GTT CCA AGG CA3’
GAPDH Sense 5’ TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA 3’ 76 Antisense 5’ CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA 3’
Table 16. Effect of EHD on the activities of plasma ALT and AST in CCl4-treated mice.
Activity (U/L) Treatment Dose
(g/kg) 3 Weeks 6 Weeks 9 Weeks
ALT
Control - 35.2 ± 4.8 33.0 ± 6.5 34.4 ± 9.6 CCl4 + H2O - 382.9 ± 32.7### 632.5 ± 240.0### 867.6 ± 203.0###
CCl4 + EHD 0.5 154.9 ± 40.9*** 622.2 ± 192.0 608.0 ± 334.5 1.0 103.2 ± 28.8*** 418.8 ± 80.4* 588.4 ± 251.5*
AST
Control - 67.6 ± 6.8 69.9 ± 6.5 68.0 ± 14.7 CCl4 + H2O - 259.7 ± 46.8### 313.7 ± 80.1### 476.4 ± 167.5###
CCl4 + EHD 0.5 148.2 ± 41.2*** 347.4 ± 196.8 352.6 ± 168.6 1.0 118.2 ± 23.4*** 195.6 ± 63.2** 310.4 ± 49.1*
All values are mean ± S.D. (n = 10). ###
P < 0.001 compared with the control
group.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 compared with the CCl4 + H2O group.
Table 17. Effect of EHD on the hepatic malondialdehyde and hydroxyproline in CCl4-treated mice at 9 weeks.
Drugs Dose (g/kg)
Malondialdehyde (nmol / mg protein)
Hydroxyproline (μg/g tissue) Control - 1.0 ± 0.2 566.8 ± 163.5 CCl4 + H2O - 1.6 ± 0.1### 944.3 ± 234.0##
+ EHD 0.5 1.3 ± 0.2* 732.9 ± 149.1*
1.0 1.1 ± 0.1*** 704.9 ± 78.0*
All values are mean ± S.D.(n = 10). ###
P < 0.01 compared with the control
group. *P < 0.05, ***P < 0.001 compared with the CCl4+H2O group.Table 18. The pathological score of CCl4-induced chronic liver damage in mice.
Fibrosis Necrosis Treatments Dose
(g/kg) 0 1 2 3 4 Average 0 1 2 3 4 Average Control - 10 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 CCl4 + H2O - 0 0 1 3 6 3.5 0 0 1 4 5 3.4 CCl4 + EHD 0.5 0 0 2 5 3 3.1 0 0 2 4 4 3.2 1.0 0 0 2 8 0 2.8* 0 0 3 7 0 2.7*
* p < 0.01 compared with the CCl4 + H2O group.
mRNA expression ratio
collagen (a1)(I) MAT1A MAT2A
#
Fig 49. RT-qPCR analysis of collagen (
α 1)(I), collagen ( α 1)(III), MAT1A
and MAT2A in CCl4-treated rat liver tissue.Results are expressed in arbitrary units, and data are mean ± S.D. (n=10). #
P
< 0.05, ##
P < 0.01,
###P < 0.001 compared with the control group. *P < 0.05,
***P < 0.001 compared with the CCl4 + H2O group.
Fig 50. Treatment with EHD improved the histology of CCl4-treated rat liver.
(A-C) H.E. staining (100X); (D-F) Sirius red staining (100X). (A, D) control group; (B, E) CCl4 + H2O group, showing gross necrosis, broad infiltration of lymphocytes around the central vein, and fibrosis ; (C, F) CC4 + EHD (1.0 g/kg) group, showing a reduction in gross necrosis, broad infiltration of lymphocytes around the central vein, and fibrosis.