前言
橄欖油是來自於齊敦果(Olea europaea L., Oleaceae)的果實壓製 而成，是地中海地區常被使用的油脂119。其被認為具有抗氧化、抗發 炎、降低心血管風險等之健康油脂124。但對肝病的益處，鮮有研究。
對 thioacetamide 誘發肝硬化的大鼠，其肝硬化的回復，補充單 元不飽和脂肪酸比多元不飽和脂肪酸的效果好 131, 132。在四氯化碳誘導 大鼠肝硬化模式中，比較四氯化碳溶於不同溶媒的作用，以溶於橄欖 油的毒性比玉米油、魚油、葵花油都低134。這些結果顯示橄欖油對肝 纖維化病程有正面的影響。本研究之目的在於釐清橄欖油是否會減輕 四氯化碳所引發的肝硬化，並解明其相關作用機轉。 使用的橄欖油為 精煉橄欖油，主要是為避免一些雜質的干擾，且有文獻指出初榨與精 煉橄欖油之間的酚類化合物含量相近118。
材料與方法
一、試藥
1. Roche, Germany：Alanine aminotransferase (ALT) ，triglyceride 2. Sigma-Aldrich, USA： hydroxyproline，NaOH，H2SO4
，p-dimethylamino-benzaldehyde，triton 100，sodium dodecyl sulfate (SDS)，
2-thiobarbituric acid，Sirius Red，3-3’-diaminobenidine (DAB)，
chloroform，isopropanol，tris base，Bradford reagent
3. Wako, Japan：n-butanol，pyridine，acetic acid，Methanol，H2O2 4. BioGenex, USA：α-smooth muscle actin (α-SMA)
5. Santa-Cruz, USA：lipopolysaccharide binding protein (LBP)，NADPH oxidase，NF-κB，collagen I 和 TGF-β1 一級抗體，anti-mouse、anti-goat、anti-rabbit 二級抗體
6. Invitrogen, USA：trizol 試劑
7. Fermentas, Canada ： MMLV RT 套 組 、 PCR Master Mix 套 組 、 Ethidium Bromide (EtBr)
8. Promega, USA：Agarose gel
9. Perkin Elmer, USA：冷光試劑 (Western Lighting) 10. Osaka, Japan：CCl4
11.Fluka, Switzerland：橄欖油 12. Intron, Korea：蛋白質萃取試劑
13. Amresco, USA ： 40% Acrylamide/bis-acrylamide (37.5:1) ， Ammonium persulfate (APS) ， N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)
二、動物
使用 Wistar 雄性大鼠，體重 250-300 公克，購自國家實驗動物 繁殖及研究中心。餵養環境維持22 ± 3℃，相對溼度 55 ± 5％，光照為 12 小時亮 12 小時暗(早上七點亮，下午七點暗)的環境，自由飲水及攝 食。
三、四氯化碳誘導之慢性肝毒性
大鼠每週兩次經口服投與四氯化碳(20％，以橄欖油稀釋)，每公 斤體重投予 2 ml 體積，持續 8 週。將動物分成四組，其中三組以四氯 化碳誘導肝纖維化，每天分別經口投予橄欖油(2 ml/kg 或 10 ml/kg 體 重)，及一次水。另外，控制組每日投與一次水及每周兩次投與四氯化
碳之溶媒橄欖油。每周秤體重一次，以作為給予實驗物質之依據。四 氯化碳與實驗物質投予時間，相隔 5 小時以上。投藥滿八週犧牲時，
快速取下肝臟，浸泡於冰冷生理食鹽水中，洗淨擦乾水分後，以肝臟 最大葉分成五大部分，第一部份浸泡於 10%中性福馬林中，供病理切 片用，第二部份供測定羥基脯胺酸，第三和第四部份冰存於 – 80℃，
以供後續實驗使用，第五部份保存於液態氮環境，供蛋白質以及 RNA 之分析。
四、肝臟羥基脯胺酸含量測定
秤取0.5 公克新鮮肝臟組織，以 100℃ 12 小時烘乾，加 5 ml 6N HCl 100℃加熱 16 小時，加以水解。待冷卻後，取樣品 1 ml 離心 9100 g， 30 分鐘。羥基脯胺酸含量測定，依照 Neuman 和 Logan184的方法。
取 0.2 ml 羥基脯胺酸標準品或水解後上清液，以 1N NaOH 中和水解產 物，每管分別加入 1 ml CuSO4，1 ml 2.5N NaOH，1 ml H2O2震盪後靜 置反應 5 分鐘，80 ℃加熱 5 分鐘，以去除多餘過氧化物。冷卻後加入 4 ml 3N H2SO4、 2 ml p-dimethylaminobenzaldehyde 劇烈震盪混合均勻 後，於 70℃水浴 16 分鐘，冷卻後，以分光光度計 540 nm 測定反應後 產物吸光值。以羥基脯胺酸為標準品，含量以 μg/g 組織重表示。
五、肝臟三酸甘油酯含量測定
參考 Danno 等人185的方法，經適當修改後進行，取新鮮肝臟組 織 0.1 公克，加入 1 ml 95% 酒精，以均質機均質化之後，冰上靜置 30 分鐘，以5000 g 、4℃、離心 5 分鐘，取上清液 200 μl，置於 55℃乾熱 器，以氮氣吹乾，乾燥後，加入 40 μl 95% 酒精溶解，加入 960 μl methanol / triton 100 (1:1)，以市售三酸甘油酯試劑測試。單位表示以 μg/g tissue 表示。
六、肝臟脂質過氧化產物測定 (Lipid peroxidation product)
肝臟脂質過氧化測定，參考 Ohkawa 等人186 的方法。秤取肝臟 組織 0.5 公克，加入 5 ml 的 1.15% KCl 溶液，以均質機均質化後，取 0.1 ml 的均漿，依序加入 0.2 ml sodium dodecyl sulfate (8.1%)、1.5 ml acetic acid (20%)、1.5 ml 2-thiobarbituric acid (0.8%)，再以一次水調整 體 積 為 4 ml ， 以 95℃ 水 浴 1 小 時 ， 待 冷 卻 後 ， 加 入 4 ml n-butanol/pyridine 混合液 (15:1，v/v)，劇烈震盪混合均勻後，以 4000 g 離心 10 分鐘，取有機層以分光光度計於 532 nm 測量吸光值。肝組織 的脂質過氧化以nmol malondialdehyde (MDA)/mg protein 表示。同時依 照 Coomassie Blue 蛋白質定量法，測定肝組織蛋白質含量，以胎牛血 清(Bovine derum akbumin)蛋白為標準品187。
七、病理檢驗
肝臟組織浸泡於福馬林液固定後，脫水後進行石蠟包埋，以切 片機切成4 μm 之肝組織薄片。進行蘇木青及伊紅染色（Hematoxylin &
Eosin stain ， H.E. satin ） 及 天 狼 星 紅 染 色 （ Sirius Red stain ， S.R.
stain），以便評估肝臟組織病變和纖維化程度。
H.E. satin 的步驟為，將切片 60℃烘乾 30 分鐘後，待涼，進行以 xylene 脫蠟、復水步驟(依序為 100%, 95%, 75% 酒精)，H.E. satin 則先 染蘇木青 10 秒，置於流動水清洗 10 分鐘，再染伊紅 30 秒，進行脫水 步驟(依序為 70%, 95%,100 % 酒精)，之後封片。
S.R. stain 的步驟則是進行烘片、脫蠟、復水，之後以天狼星紅 染 1 小時，以 1% 醋酸溶液清洗至背景至淡黃色，之後進行脫水、封片 步驟即可。
參考Honda 的作法188 進行 α-SMA 免疫化學染色，藉以評估星狀 細胞活化程度。進行烘片、復水步驟之後，以 5％ 脫脂奶粉阻斷非特 異性反應 1 小時，以磷酸鹽緩衝液清洗 3 次，每次 5 分鐘，之後與一 級抗體 α-SMA 在 4℃反應 16 小時，以磷酸鹽緩衝液清洗 3 次，每次 5 分鐘，和小鼠來源之二級抗體室溫反應一小時，再利用免疫偵測套組 及 3-3’-diaminobenidine 反應呈色，脫水、封片後，以光學顯微鏡觀察 即可。
肝纖維化判斷採取 Ruwart 等人189的半定量分析方法，評估分數 由 0 至 4 分五個等級，0 代表正常肝組織，沒有任何肝纖維化；1 代表 有少量膠原蛋白增生，但沒有形成中隔，(在中央靜脈區或門脈區有放 射性纖維增生)；2 代表在中央靜脈或門脈區二者間，形成不完全的中 隔(此二中隔間，彼此沒有交會)；3 代表形成完全的中隔，彼此交會相 連，並將肝實質分隔成許多節片段，但此中隔很薄；4 代表形成完全中 隔，且中隔變厚，為完整之肝硬化病變。
八、 mRNA 表現分析 (1) RNA 萃取
取 0.1 公克的肝組織加入 1 ml trizol 試劑，使組織粉碎均質化，
於 3700 g 、 4℃ 條 件 離 心 10 分 鐘 。 取 上 清 液 加 入 0.2 ml 氯 仿 (chloroform)萃取 RNA，劇烈震盪 15 秒後，靜置於冰上 3 分鐘，於 4℃、14700 g 離心 15 分鐘，取上清液加入 0.5 ml 異丙醇 (isopropanol) 使 RNA 沉澱，輕微上下震搖後，靜置於冰上 10 分鐘，於 4℃、14700 g 離心 10 分鐘，倒掉上清液，留下沉澱物，再加入 75%酒精後，靜置 於 -30℃冰箱 30 分鐘。於 4℃、9100 g 離心 5 分鐘，再倒掉上清液，加
入適量 DEPC 水將 RNA 溶解，於波長 260 nm 測定吸光值，計算 RNA 濃度。
(2) 合成 cDNA
cDNA 的製備主要是採用 M-MuLV Reverse transcriptase (first-strand cDNA synthesis)。使用 M-MuLV RT 套組，取 1 μg mRNA 加入 1 μl oligo (dT)18 primer，10 μl DEPC 水，再加入 4 μl 5X MMLV RT buffer、2 μl MMLV RT、2 μl 10 mM dNTP，混合後於 37 ℃ 反應60 分 鐘。
(3) 聚合酵素反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)
利用 PCR Master Mix 套組，將特定 cDNA 量化。取去離子水 9.5 μl 、PCR Master Mix 12.5 μl、10 mM 引子(primer) 各 1μl、cDNA 1 μl，依照不同引子設定不同的溫度及時間條件。
(4)確認 DNA 結果
取 5 μl cDNA 產物，加入 1 μl 6X DNA loading dye，以 2% 洋菜 膠 (Agarose gel)，事先混合 Ethidium Bromide，50V、50 分鐘為條件跑 膠 ， 在 暗 箱 以 紫 外 光 照 射 ， 並 拍 攝 為 數 位 檔 案 ， 以 影 像 分 析 軟 體
（AlphaDigi Doc 1201）分析，每一樣品的基因表現，均會除以每一樣
品的
GAPDH 表現值作為校正，比值為目標基因/GAPDH，再以控制組
表現為基準值，分析組別間的表現差異。
分析基因為
lipopolysaccharide binding protein (LBP), cluster of
differentiation 14 (CD14), Toll-like receptor-4 (TLR4), nuclear factor κ B
(NF- κ B), NADPH oxidase, collagen ( α 1)(I), collagen ( α 1)(III) 和
transforming growth factor- β 1 (TGF- β 1)，引子如表一所述。
九、 西方墨點法 (Western Blotting)
(4) 轉漬 (transfer)
將海綿、3M 濾紙在轉漬緩衝液內浸濕，PVDF 轉漬膜以甲醇潤 濕 15 秒，再浸泡於轉漬緩衝液，依序放上海棉、濾紙、膠片、PVDF 轉漬膜、濾紙、海綿組成類似三明治結構，小心去除氣泡，放入轉漬 夾，以50V，300mA，1 小時為條件，進行蛋白質轉漬步驟。
將轉漬膜浸泡於 5% 脫脂奶 (溶於 0.1% tween 20 / TBS 緩衝液) 室溫進行阻斷非特異性反應步驟 1 小時，以 0.1% tween 20 / TBS 緩衝 液清洗 5 分鐘共 3 次。取封口袋放入 2 ml 2% 脫脂奶(溶於 0.1% tween 20 / TBS 緩衝液)含一級抗體 1:2000 lipopolysaccharide binding protein (LBP) ， NADPH oxidase ， nuclear factor
κ
B (NF-κB) ， collagen I 和 transforming growth factor- β1 (TGF-β1)。室溫進行 90 分鐘。以 0.1%tween 20 / TBS 緩衝液清洗 5 分鐘共 3 次，取封口袋放入 2 ml 2% 脫脂 奶(溶於 0.1% tween 20 / TBS)含二級抗體 anti-goat (LBP，NADPH oxidase，collagen I 和 TGF-β1 用)，anti-rabbit (NF-κB 用) 或 anti-mouse (β-actin 用) IgG 1:2000，室溫進行 90 分鐘，以 0.1% tween 20 / TBS 清 洗 5 分鐘共 3 次，以 TBS 緩衝液清洗 5 分鐘 1 次，進行壓片。將轉漬 膜浸泡於冷光試劑中 1 分鐘，以柯達底片進行感光，感光時間依照檢 體而定，之後放進顯影劑顯影約 1-3 分鐘，清水沖洗 1 分鐘，放入定影 劑 3 分鐘，清水沖洗即可。底片晾乾後，以影像分析軟體分析即可。
每個樣品的蛋白質表現，均除以樣品本身的 β-actin 值，比值為目標蛋 白質/β-actin，再以控制組表現為基準值，分析組別間的蛋白質表現差 異。
十、 統計方法
數據結果以平均值（mean）± 標準偏差（standard diviation，
SD）表示，各組與對照組間的數據以單因子變異數分析 （One-way analysis of variance，One-way ANOVA）方法分析，並進行 Dunnett 測 試 。 病 理 切 片 評 估 數 據 以 Kruksall-Wallis non-parametric test 加 上 Mann-Whitney U-test 測試。以 P 值小於 0.05 表示在統計學上具有顯 著差異。
結果
一、肝臟羥基脯胺酸、三酸甘油酯含量、脂質過氧化產物和蛋白質含 量
四氯化碳誘導大鼠肝纖維化，分別在肝臟的羥基脯胺酸 (圖 二)、三酸甘油酯(圖三) 和脂質過氧化產物含量 (圖四)與控制組相比，
分 別 增 加 87.7% 、 46.6% 、 172.0% 。 蛋 白 質 含 量 ( 圖 五) 則 是 下 降 40.5%。給予橄欖油高劑量 (10 ml/kg)，與四氯化碳組相比，肝臟羥基 脯胺酸、三酸甘油酯、脂質過氧化產物含量，分別降低 24.0% 、27.1%
和 31.8%。蛋白質含量則是增加了 55.5%。
二、肝臟組織切片染色及免疫化學染色結果
四氯化碳處理的大鼠肝臟呈現大區域細胞壞死、廣泛的單核細 胞浸潤及纖維結締組織增生形成偽小葉。橄欖油高劑量組 (10 ml/kg) 明 顯改善肝臟受損的情況 (圖六之左第一列)。藉由天狼星紅染色分析肝 臟纖維結締組織擴展和膠原蛋白沉積，判斷四氯化碳引發的肝纖維化 程度 (圖六之中間列)，經量化評估後，橄欖油高劑量組的纖維化程度 明顯比四氯化碳組輕微(表二)。肝纖維化時，星狀細胞活化，使α-SMA
表現大量增加，可藉由免疫化學染色結果，得知星狀細胞活化情形(圖 六之右第一列)，橄欖油高劑量組的α-SMA 表現明顯低於四氯化碳組。
三 、
LBP 、 CD14 、 TLR4 、 NADPH oxidase 、 NF- κ B 、 collagen ( α 1)(I) 、 collagen ( α 1)(III) 和 TGF-β1 肝臟組織 mRNA 表現分析
肝臟
LBP 、 CD14 、 TLR4、NADPH oxidase、NF- κ B、collagen ( α 1)(I) 、 collagen ( α 1)(III) 和 TGF-β1 的 RT-PCR 結果如圖七所示。
LBP 、 CD14 、 TLR4 和 NF- κ B 的 PCR 量化結果，顯示四氯化碳組的表
現明顯高於控制組(圖八)。LBP、 CD14 、 TLR4 、 NADPH oxidase 和 NF- κ B 的 mRNA 表現，四氯化碳組分別高出控制組 150%、40%、
150%、40% 和 80%。橄欖油高劑量組(10 ml/kg) 的 mRNA 表現，與四 氯化碳組相比分別降低了 70%、21.4%、32%、21.4% 和 33.3%。
collagen ( α 1)(I) 、 collagen ( α 1)(III) 和 TGF-β1 mRNA 表現的量化
結果，如圖九所示，控制組均有較低的表現。四氯化碳組的collagen ( α 1)(I) 、 collagen ( α 1)(III) 和 TGF-β1 mRNA 表現，分別比控制組高出
50%、40% 和 60%，橄欖油高劑量組的 mRNA 表現，相較於四氯化碳 組分別降低約 27%、40% 和 25%。四、肝臟組織的蛋白質表現
圖十為肝臟LBP、NADPH oxidase、NF-κB、collagen I 和 TGF-β1 的蛋白質表現結果。量化結果如圖十一所示，四氯化碳組高出控制 組的表現，依序分別是 200%、90%、140%、50% 和 50%。NADPH oxidase 和 NF-κB 的蛋白質表現，橄欖油低、高劑量組 (2、10 ml/kg)
圖十為肝臟LBP、NADPH oxidase、NF-κB、collagen I 和 TGF-β1 的蛋白質表現結果。量化結果如圖十一所示，四氯化碳組高出控制 組的表現，依序分別是 200%、90%、140%、50% 和 50%。NADPH oxidase 和 NF-κB 的蛋白質表現，橄欖油低、高劑量組 (2、10 ml/kg)