前言
酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)又稱麫包酵母、出芽酵母、啤 酒酵母、釀酒酵母。酵母菌是與人類關係最廣泛的一種菌種，不僅因 爲傳統上它用於製作麵包和饅頭等食品及釀酒之用，屬真核生物，酵 母菌是發酵工業中最常用的生物種類。近年來，釀酒酵母除發酵食物 及酒精性飲料外，還能提供藥用工業的經濟價值。為增加酵母菌在生 化工業上的產值，發展出更完善大規模的發酵製程247。目前酵母菌已 經 可 以 大 量 生 產 麩 胱 甘 肽248。 自 修 飾 過 的 酵 母 菌 中 ， 篩 選 出 的 YA03083 品系，有非常高含量的麩胱甘肽，並選擇適當培養液使產值 達到最高。
麩胱甘肽缺乏通常導致氧化壓力增加，其通常在疾病發展過程 中扮演極重要角色249。組成麩胱甘肽的材料胺基酸，包括麩胺酸、胱 氨酸和甘胺酸被吸收之後，多集中於肝門脈區，使得肝細胞內麩胱甘 肽前驅物利用率明顯增加250。口服麩胱甘肽，效果如同服用細胞內麩 胱甘肽前驅物。此外，胱胺酸曾在動物實驗中被證實，可以減緩肝臟
損傷251, 252。此實驗主要目的為探討酵母菌發酵物 (FSSC) 對於大鼠四氯
化碳誘發肝損傷模式之影響。
材料與方法
一、 試劑
1. BD & Difco, USA：酵母麥芽萃取物瓊脂(Yeast malt agar) 、甘蔗糖 蜜、大豆水解物。
2. Sigma-Aldrich, USA：glutathione 二、 製備 FSSC
FSSC 由食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心提供。使 用酵母菌為由
S. cerevisiae YA03083 篩選出修飾過後的品種，可以大量
生產麩胱甘肽。酵母麥芽萃取物瓊脂和培養液分別用在保存和繼代培養 上。主要基礎培養溶液中含甘蔗糖蜜，大豆水解物，及礦物質成份 [(NH4)2SO4 4 g/l， KH2PO4 6 g/l，MgSO4.7H2O 1 g/l] ，經放大發酵培養 後，將培養液過濾滅菌，凍晶乾燥處理，儲存於40C 備日後研究用。三、 以高效液相層析分析麩胱甘肽含量
由食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，以高效液相 層析確認麩胱甘肽含量，分析結果為FSSC 含有麩胱甘肽 11.3 mg/g。
四、 動物
使用 Wistar 雄性大鼠，體重 250-300 公克，購自國家實驗動物 繁殖及研究中心。餵養環境維持22 ± 3℃，相對溼度 55 ± 5％，光照為 12 小時亮 12 小時暗(早上七點亮，下午七點暗)的環境，自由飲水及攝 食。
五、 四氯化碳誘導之慢性肝毒性
大鼠之四氯化碳誘導慢性肝損傷，方式如第二章所述。FSSC 劑 量 0.5 或 1.5 g/kg 體重，每天口服投與。犧牲時，血液與肝臟處理方式 如第二章所述。
六、 血液生化值檢驗
收 集 之 血 液 處 理 方 式 ， 如 第 三 章 所 述 ， 項 目 為 alanine aminotransferase (ALT)、albumin、globulin。
七、 肝臟脂質過氧化產物、蛋白質和羥基脯胺酸含量測定 實驗方法如第二章所述。
八、 mRNA 表現分析
實 驗 步 驟 如 第 二 章 所 述 。 分 析 基 因 為
methionine adenosyltransferase 1A (MAT1A), methionine adenosyltransferase 2A (MAT2A), collagen ( α 1)(I) ， transforming growth factor- β 1 (TGF- β 1), matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) 和 tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) ，
詳細引子如表二十四所列。九、 病理檢驗
肝臟病理組織處理方式，如前所述。進行蘇木青及伊紅染色
（Hematoxylin 和 Eosin stain） 及天狼星紅染色（Sirius Red stain），以 便評估肝纖維化程度。
結果判讀及分析，如前所述。
十、 統計方法
數據結果以平均值（mean）± 標準偏差（standard diviation，
SD）表示，統計方式如前所述，以 P 值小於 0.05 表示在統計學上具有 顯著差異。
結果
一、 動物體重、肝臟及脾臟重量和肝臟含水量
投與四氯化碳的大鼠體重與對照組相比明顯降低。四氯化碳組 和四氯化碳+ FSSC 組之間，體重無明顯差異。第八週的控制組與四氯 化碳組體重分別為 455.0 ± 16.5 和 407.7 ± 31.6 g (P < 0.001)。
四氯化碳肝損傷通明顯造成肝臟和脾臟腫大，四氯化碳組之肝
臟重和脾重分別高出對照組 55% 和 100% (表二十五)。FSSC 1.5 g/kg 組明顯降低因四氯化碳而增加的肝臟和脾臟重。
如表二十五所示，四氯化碳引發的肝纖維化通常會伴隨著增加 肝臟含水量，四氯化碳組之肝臟含水量明顯高出對照組 6.8%，而給予 FSSC 1.5 g/kg 組與四氯化碳組相比，明顯降低含水量 2.8%。
二、 血液生化值測定
如表二十六所示，四氯化碳誘發肝損傷，血漿中的 ALT 活性明 顯比對照組高。 FSSC 1.5 g/kg 組明顯降低因四氯化碳而增加的 ALT 活 性。
如表二十六所示，四氯化碳組之血漿中的白蛋白含量及白蛋白/
血清球蛋白(albumin/globulin，A/G) 比例明顯低於對照組。FSSC 1.5 g/kg 組明顯改善因四氯化碳而降低的血漿白蛋白及白蛋白/血清球蛋白 血清值。
三、 肝臟脂質過氧化產物、蛋白質和羥基脯胺酸含量
大鼠以四氯化碳誘發肝損傷時，其羥基脯胺酸和脂質過氧化程 度與對照組相比，分別增加約 77.5%和 123.5%。FSSC 1.5 g/kg 組與四 氯化碳組相比，明顯降低 羥基脯胺酸和脂質過氧化產物，分別降低 17.4% 和 26.3% 。
如表二十七所示，四氯化碳引發之肝損傷，會伴隨肝臟蛋白質 含量會降低，與控制組相比降低約 34 %。FSSC 1.5 mg/kg 組則會明顯 增加因四氯化碳而降低的蛋白質含量。
四、 肝臟組織基因表現分析
MAT1A 和 MAT2A 的 mRNA 表現結果，如圖五十四 A 所表示。
MAT1A 量化結果如圖五十四 B，和 MAT2A 量化結果如圖五十四 C 所
示。MAT1A 會表現於正常無傷害的肝臟，四氯化碳組的 MAT1A 表現低 於對照組 22%。與四氯化碳組相比，FSSC 1.5 g/kg 組 能增加 29.2%的
MAT1A 表現。MAT2A 則是在肝臟受傷害時才會表現，四氯化碳組的 MAT2A 表現明顯高於控制組 246%，而 FSSC 1.5 g/kg 組，與四氯化碳
組相比則是降低31.9% 。collagen ( α 1)(I)和 TGF- β 1 的基因表現，如圖五十五 A 所示。量
化後結果， collagen (α 1)(I)的表現，如圖五十五 B 所示和 TGF- β 1 表現
則是如圖五十五C 所示。對照組的肝臟 collagen (α 1)(I) 和 TGF- β 1 的表
現都非常低。四氯化碳組的collagen ( α 1)(I) 和 TGF- β 1 表現明顯高於對
照組207% 和 150%。而 FSSC (1.5 g/kg) 與四氯化碳組相比明顯降低，分別是 51.6% 和 52%。
MMP-13 和 TIMP-1 的基因表現，如圖五十六 A 所示，量化後結
果，MMP-13 (圖 五十六 B) 和 TIMP-1 (圖五十六 C)。MMP-13 和 TIMP-1 均會在正常組織中表現。MMP-13 在四氯化碳組中表現比控制
組低 50% ，併用 FSSC (1.5 g/kg)之後，與四氯化組相比會提高 80%。四氯化碳組的
TIMP-1 表現高於對照組 180% ，而併用 FSSC 1.5 g/kg 之
後，與四氯化碳組相比則是降低32.1%。五、 病理學結果
經四氯化碳處理的老鼠肝臟會呈現圍繞著中央靜脈區有細胞壞 死、廣泛的單核球浸潤和纖維化情形，如圖五十七 B。而 FSSC 1.5 g/kg 組能降低四氯化碳引起的脂肪堆積、發炎和細胞壞死情形，如圖 五十七C。量化後結果如表二十六所示。
圖五十八為天狼星紅染色結果，可以藉此染色判別肝纖維化之 程度，如圖五十八 B 所示，為四氯化碳誘導之肝纖維化，可以看到明 顯的紅色纖維及形成中隔較多， 而合併 FSSC (1.5g/kg) 組，如圖五十 八 C 所示，纖維化程度明顯輕微，量化結果如表二十八所示。
討論
本研究結果顯示，FSSC 能有效降低大鼠慢性四氯化碳誘導之肝 臟損傷。從血漿生化值及肝臟病理切片，與肝纖維化和肝臟保護作用 相關的基因表現分析，FSSC 能使四氯化碳誘發之肝臟傷害病程減輕。
血漿中 ALT 活性為肝臟傷害之常見生化指標211。因四氯化碳引 發的肝臟傷害的纖維化病程中，血漿中 ALT 活性會明顯的增加。而 FSSC 能明顯的降低因四氯化碳而增加的 ALT 活性，顯示 FSSC 能減輕 四氯化碳對肝臟的損傷。
MAT1A 會在正常肝臟組織表現的
31。當肝臟受損時，MAT1A 表 現會下降，而MAT2A 表現會被啟動
27。因四氯化碳誘導肝傷害而產生 的MAT 的基因變化，會因為 FSSC 的給予而改變，這些結果支持了
FSSC 有肝保護作用。組織學分析的結果也證實，FSSC 能減輕四氯化 碳造成的損傷。肝臟內質網合成多種蛋白質，包括白蛋白212, 242。慢性肝損傷 時，白蛋白量會降低243。當四氯化碳引發肝損傷時，肝臟蛋白質和血 漿中的白蛋白都會降低。 FSSC 能明顯的減緩此現象。 顯示 FSSC 能減 緩因四氯化碳破壞的蛋白質合成功能。
免疫球蛋白由免疫系統合成，肝臟疾病時常見高免疫球蛋白 (hyperglobulinemia)現象，為肝臟的防禦反應253。在四氯化碳誘導慢性
肝損傷中，常見白蛋白/免疫球蛋白(A/G)的比例降低。FSSC 明確的降 低因四氯化碳而增加的A/G 比例，也抑制了肝臟的發炎反應。FSSC 降 低四氯化碳誘發肝損傷的發炎反應，亦可以由病理切片上看到此結 果。
當肝臟受損，會促使肝新生作用212，因此而增加肝臟的重量。
但是，當肝臟嚴重受損，肝纖維化及肝硬化的最終結果會導致肝萎縮
244。在本實驗四氯化碳誘導肝纖維化，伴隨著肝腫大(hepatomegaly)以 及增加含水量。FSSC 能改善肝腫大及降低肝含水量之程度。由以上結 果得知，FSSC 確能減緩四氯化碳引發的肝臟傷害。
肝纖維化是一般慢性肝疾病的末期階段，肝纖維化及肝硬化會 阻斷肝臟血流供應，而導致肝門脈高血壓，並影響血流供應至脾臟，
導致脾臟腫大213。在本實驗的四氯化碳的肝損傷，伴隨脾臟腫大。而 FSSC 能改善脾臟腫大的情況，顯示能減緩門脈高壓的情形。
肝纖維化是肝臟過多膠原蛋白聚集造成192，而羥基脯胺酸為膠 原蛋白中特有成份23。膠原蛋白含量可以由羥基脯胺酸含量推測得知，
亦可藉此得知纖維化之程度23。當四氯化碳引發肝臟損傷進而纖維化 時，肝臟羥基脯胺酸的量會明顯上升，FSSC 與四氯化碳組相比，明顯 降低肝臟羥基脯胺酸的量，因此 FSSC 會降低肝纖維化程度。天狼星紅 染色的組織學結果，亦可得到驗證。許多研究指出肝纖維化的肝臟 中，第一型膠原蛋白會顯著大量的增加196。因此，我們分析了肝臟
Collagen ( α 1)(I)的表現結果，結果顯示 FSSC 確實可以減少此基因的表
現。透過 TGF-β1 活化的星狀細胞，會產生大量的細胞外間質，增加