第一部分：探討香椿成分TSL-1對人類急性前骨髓血癌細胞株
（2）0.4％ Trypan blue：
取 0.04g Trypan blue 溶於 10 ml 1X PBS 中，通過孔徑 0.45 μM 的濾膜，濾除雜質，室溫保存。
2. 細胞株來源及培養條件：
將人類血癌細胞株(HL-60)培養於 RPMI-1640 培養液中(含 10%
foetal bovine serum 、 2 mM L-glutamine 、 1% penicillin -streptomycin），置於 37℃、5% CO2的培養箱中培養。
3. 繼代培養(secondary culture)：
平常使細胞密度維持在 2～5×105 cells/mL。繼代培養時，將培 養液收集至離心管中，離心1200 rpm，5 分鐘，吸掉上清液，在將 細胞打散加入新鮮培養液培養。
4. 解凍細胞：
自液態氮桶將HL-60細胞取出後，立即移置於37 ℃水浴槽中，
在30 秒 內 急 速 解 凍 ， 再 將 細 胞 冷 凍 保 存 液 (Cell culture freezing medium-DMSO)吸到已加好培養液無菌離心管內稀釋，經離心，去除 上清液，再加入培養液，將細胞均勻打散後，移到培養瓶(T75 Flask)，
於含5% CO2的37℃培養箱中生長，並且需定期更換培養液。
5.冷凍細胞：
將生長狀態良好的細胞自培養瓶移至50 mL離心管，1200 rpm，5 分鐘，吸掉上清液，再加入freezing medium(5% DMSO 和95% FBS) 充分混合後，置於入2 mL冷凍小管內，此時每個冷凍小管的細胞密度 為1～5×106 cells/mL。先將內含有細胞freezing medium的冷凍小管放 在4 ℃ 15分鐘，再移至- 20 ℃ 15分鐘，之後移到- 80 ℃ overnight，最 後放入液態氮中保存。
6. 細胞計數(Cell count)：
先將細胞培養液吸至50 mL離心管，離心1200 rpm 5分鐘，倒去 上清液後，加入細胞培養液將細胞打散，最後再取適量體積與trypan blue 做均勻混合後(含有細胞的培養液：trypan blue = 1：1)，吸至細 胞計數盤(counting chamber / Hamacytometer)，在顯微鏡下計數。
二．香椿(Toona sinensis；TS)之配置 香椿萃取流程：
將 100 克洗淨的新鮮香椿葉，加入 1000 mL 的去離子水，於沸點 下煮沸直到剩100 mL 的體積量，此溶液為香椿萃取液。所得香椿粗 萃取液以離心(3000 rpm、12 分鐘)取得上清液，而後進行真空冷凍乾 燥，得粉末 TSL-1 保存於-20℃下【61】，再利用二次水將TSL-1 粉末 充分溶解，配置成所需濃度以利實驗之進行。
1.原理：
未受損之健康細胞，由於細胞膜完整使 Trypan blue 染劑無法進 入細胞內，所以細胞不會被染色。而受損或死的細胞，因細胞膜被破 壞，其膜通透性已改變，故染劑會進入細胞中，使細胞被染色。若經 Trypan blue 染色後細胞呈藍色為死細胞，而不被染色的細胞為活細 胞。
2.實驗步驟：
在 12 well culture plate 中種 2×105 cells/mL(共 1mL)的 HL-60，
再加入不同濃度的香椿萃取液(0、10、25、50、75μg/mL、75μg/mL+10 U Catalase)，放置於 37℃培養箱反應 6 hr。時間到時，由 12 well culture plate 中取出 100μL 再加入 100μL 的 0.4% Trypan blue 溶液，混合均 勻後，以血球計數器計數細胞數目【129】。
四、以倒立式位相差顯微鏡觀察細胞型態(Morphology) 實驗步驟：
培養細胞2×105 cells/mL(共1mL)於12 well culture plate中，再加入 不同濃度的香椿萃取液(0、10、25、50、75μg/mL、75μg/mL+10 U Catalase)，放置於37℃培養箱反應6 hr，以倒立式位相差顯微鏡(phase microscope)觀察細胞型態。
五、利用流式細胞儀(Flow cytometry)探討香椿萃取液對HL-60 細胞週期之影響
1.原理：
當一個細胞複製完成自己的 DNA，分裂成二個 細胞，整個過
S phase、M phase。G1 phase，是細胞生長的時期，此時細胞代謝活 化，複製所需胞器以及一些細胞質的組成，以供下一階段複製染色體 使用；而 S phase 是 DNA 複製的時期，也就是染色體複製；G2 phase 繼 續 生 長 ， 並 且 合 成 酵 素 和 蛋 白 質 ，G1 、 S 、 G2 又 合 稱 間 期 (Interphase)；而 M phase，是有絲分裂期。可以利用細胞中 DNA 的含 量 來 決 定 週 期 ， 利 用 螢 光 物 質 標 示 DNA 再 利 用 FACS (fluorescence-activator cell sorter)分析 DNA 含量，這種方法稱為 flow cytometry。G2 期 DNA 含量為 G1 期的兩倍，而 S 期的 DNA 含量則 居於兩者之間
圖五、流式細胞儀分析出來標準細胞週期圖
2.實驗步驟：
將2×105 HL-60細胞種於6 cm dish，給予不同濃度的香椿萃取液 (0、10、25、50、75 μg/mL、75 μg/mL+10 U Catalase)培養6個小時，
及給予50 μg/mL香椿萃取液培養於不同時間(0、3、6、12、18h)，置 於37 5℃ % CO2培養箱反應。等待培養時間到之後，收集懸浮細胞，
PBS洗滌2次，利用4 ℃70% 的酒精固定細胞形態，-20 ℃冰箱隔夜存
放。隔天，將細胞懸浮液以1200 rpm、5分鐘離心去除酒精上清液，
再以PBS清洗兩次之後，將細胞徹底打散，加入500 μL的PI stain染 劑，避光30分鐘之後轉移到FACS專用小管，進行流式細胞計數儀檢 Propidium iodide
(PI) (0、10、25、50、75 μg/mL、75 μg/mL+10 U Catalase)培養6個小時，
置於37℃ 5% CO2培養箱反應。等待培養時間到之後，收集懸浮細 胞，PBS洗滌2次，利用4 ℃70% 的酒精固定細胞形態，-20 ℃冰箱隔 夜存放。隔天，將細胞懸浮液以1200 rpm、5分鐘離心去除酒精上清 液，再以PBS清洗兩次之後，將細胞徹底打散，加入500 μL的PI stain 染劑，避光30分鐘之後轉移到FACS專用小管，進行流式細胞計數儀
檢測，以一秒細胞數不超過300顆細胞，每個數據收集10000顆細胞，
數據以Modfit LT®軟體進行處理分析。每個實驗組皆以三重複增加實 驗的準確度。
七、粒線體膜電位△Ψm的分析 1.原理：
在細胞凋亡過程中粒腺體膜電位會耗散，主要是由於多個蛋白 質組成的通透性轉變孔道(PT孔道)打開，使得粒腺體內膜發生通透性 改變，造成粒線體內膜H+梯度下降。利用親脂性染劑DiOC6 (3,3,- Dihexyloxacarbocyanine iodide) 作為粒線體膜電位的探針。DiOC6可 以穿透細胞膜並且與粒線體基質結合，藉由發散出的螢光強度不同來 偵測出粒線體膜電位的改變。
2.實驗步驟：
將2×105 HL-60細胞種於6 cm dish，以濃度75 μg/mL的香椿萃取 液，分別培養0、2、4、6小時後，收集懸浮細胞，PBS洗滌2次，加 入500 μL的100 μM DiOC6於試管中，要全程避光，培養於37℃培養 箱中30分鐘，再移至FACS管，再以流式細胞計數儀偵測【62】。
八、活性氧化物測定(Reactive oxygen species) 1.原理：
利用2,7- dichlorofluorescein diacetate(H2DCF-DA)的螢光特性對 細胞進行染色，以分析細胞內ROS的生成量。H2DCF-DA是一種脂溶 性染劑，可以通透細胞膜，本身具有螢光，進入細胞後會被細胞內的
乙醯脂酶(esterases)去乙醯化形成非螢光性的DCFH，接著會被H2O2 氧化成具螢光性的DCF，以此特性，去評估細胞內H2O2的濃度變化。
2.實驗步驟：
將2×105 HL-60細胞種於6 cm dish，以濃度75 μg/mL的香椿萃取 液，分別培養0、0.5、1、1.5、2小時後，收集懸浮細胞，PBS洗滌2 次，加入500 μL的10 mΜ H2DCF-DA於試管中，要全程避光，培養於 37℃培養箱中30分鐘，再移至FACS管，再以流式細胞計數儀偵測
【62】。
九、西方墨點法(Western blotting)分析細胞蛋白質的表現 1.原理：
細胞有許多不同種類的蛋白質，不易直接測得特定蛋白質的含 量，因此利用此法以特定的抗體找出特定的蛋白質，判斷其含量的相 對多寡。由於抗體和抗原能專一性結合，所以可利用此特性標定特定 的蛋白質，稱為免疫標定法。先加入能和欲標定蛋白質抗原位置結合 的專一性抗體(一級抗體；Primary antibody)，充分反應後，再加入能 和 一 級 抗 體 上 之 抗 原 位 置 結 合 的 另 一 專 一 性 抗 體( 二 級 抗 體 ； Secondary antibody)，兩次抗體結合後，使抓取目標蛋白質的作用更 精準，且二級抗體上結合了酵素，可以分解特定之基質(Substrate)而 呈色，可供測量含量時使用。
2.試劑：
(1)Antibody & lysis buffer：
(a) Primary antibody：β-actin、caspase 8、Fas、Fas-L、Bid、caspase 9、Cyclin D1、CDK4、Cyclin E、CDK2、Cyclin A、Cyclin B、
CDC2、Rb、P-Rb、P15、P27、P21、SOD、Catalase。
(b) 30% Acrylamide/Bis solution (29:1)
(c)10% SDS：取 10g SDS，最後用二次水定量到 100 ml。
(d)Ammonium persulfate：取 0.1g (NH4)S2O8溶於1 ml 二次水。
(e)1M Tris (pH=6.8)：取 12.1g Tris base 溶在 40 ml 二次水，以 1N HCl 調至 pH=6.8，最後用二次水定量到 100 ml，用 0.45 μm filter 過濾，4 ℃儲存 1 個月。
(f)3×Protein loading dye 配方：5 mM Tris-HCl (pH=6.8)、2%
SDS、10% glycerol、0.1% bromopherol blue、100 mM dithreitol 或 5% α-ME (使用前加入)
(g)5×electrode buffe (pH=8.4)：取 54.5 g Tris base、24.8 g Boric acid、4.7 g EDTA2Na、5g SDS，最後用二次水定量至 1000 ml。
(3)西方點墨法 (Western blotting)：
(a)Transfer buffer (3 升)：取 18.2 g Tris base、86.5 g Glycine、1200 ml methanol 最後用二次水定量至 3 升。
(b)Coomassies Brilliant Blue R250 (染色液)：取 1 g Coomassie Brilliant Blue 加入 70 ml acetic acid 及 250 ml methanol 用水定 量至 500 ml。
(c)Gel destain solution：取 210 ml Acetric acid、300 ml Methanol 用水定量至3000 ml。
(i)SuperSignal substrate solution：將 SuperSignal I：SuperSignal II
＝1：1 混合。(每次使用皆現配) 4)實驗步驟：
A. 細胞溶解萃取(Cell lysis extraction)：
(a)將 TSL-1 加入含 2×105 cells/ml HL-60 的 10 cm dish 中，置於
(g)然後以離心機，使用 12,000 rpm 離心 30 分鐘。
(h)收集上清液即為核萃取物。
(i)以 Bio-rad 定量其蛋白濃度，保存在-20 ℃冰箱備用。
B. 蛋白質濃度定量分析(Protein concentration assay)：
本定量法採用 Bio-rad 公司 Protein assay-micro assay 之做法。
(a)以二次水將牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin；BSA，0.1 mg/mL)分別配製成 0、2、4、6、8、10 μg /ml 之標準溶液。
(b)再加入 200 μl Protein assay dye (BIO-RAD)，振盪均勻靜置 5 分鐘。 30% Acrylamide Mix，0.2 mL 10% SDS，0.2 mL 10% ammonium persulfate 及 0.01 mL TEMED。
b. 10% SDS-PAGE：加 8 ml H2O，5 mL 1.5M Tris (pH=8.8)，6.6 Ml 30% Acrylamide Mix，0.2 mL 10% SDS，0.2 mL 10% ammonium persulfate 及 0.01 mL TEMED。
c. 12% SDS-PAGE：加 6.6 mL H2O，5 mL 1.5M Tris (pH=8.8)，
8.0 mL 之 30% Acrylamide Mix，0.2 mL 之 10% SDS，0.2 mL 之10% ammonium persulfate 及 0.01 mL TEMED。
(c)集離膠體溶液 (5% Stacking gel；總體積 5 mL)：加入 3.5 mL H2O，0.625 mL 之 1.5 M Tris (pH=6.8)，0.825 mL 之 30%
Acrylamide Mix，0.05 mL 之 10% SDS，0.05 mL 之 10%
ammonium persulfate 及 0.05 mL 之 TEMED。
(d)樣品前處理：取 50 μg 之蛋白質量於離心管，以 Sample buffer 補齊不足量的體積，使每個反應管的體積皆為相同，同時加入3 倍Protein loading buffer (此為樣品 1/3 倍的體積)，混合均勻後，
以97 ℃加熱 5 分鐘後，以便將蛋白質樣本變性 (Denature)，立 即放回冰靜置5 分鐘，Speed down 後，再用含有 SDS 之 8%、
10% 或 12% Acrylamide gel (視蛋白質分子量大小而定)，以電泳 方式將蛋白質分離。
(e)電泳：將鑄好的 SDS-PAGE 組合放入電泳槽內，注入 1×Electrode buffer 至 well 內，此時 well 內都充滿 1×Electrode buffer，分別 將標準品以確定蛋白質之分子量及Sample 小心加入，以固定於 垂直電泳槽內的Stacking gel 的 well 內，以避免 Sample 溢出，
先以80 伏特電壓跑 5% Stacking gel，20 分鐘，再慢慢調整電壓 至200 伏特，約跑 5-6 小時，再進行蛋白質轉移。
(f)蛋白質轉移(Transfer protein to PVDF membrane)：先將 PVDF membrane 及 3M paper 裁剪與膠片大小相同。於 PVDF membrane
標記上膠片之蛋白質 Marker 的位置，方便偵測蛋白質訊號時比 對分子量大小位置。將轉漬夾打開後黑色面朝下放，取出一片海 綿墊片浸泡Transfer buffer 後放於其上面，並依序在海綿片上放 上3 MM paper、SDS-PAGE gel、PVDF membrane (先用 100%甲 醇濕潤5 秒、再放於 transfer buffer 中浸潤)、3 MM paper，最後 再放上一片海棉墊片後夾上轉漬夾(如圖)，並使用玻棒壓一壓以 去除氣泡(夾層中間切勿有氣泡)，放入濕式 transfer machine 中並 將transfer buffer 倒入電泳槽中，置於 4 ℃冰箱，以 35 伏特的電 流轉印14 小時(由負極到正極)，使蛋白質轉印到 PVDF 上。轉印 後，將gel 取出，浸在 0.05% Commassin Brilliant Blue R250 染色 20 分鐘，再浸在 destain solution 中脫色，觀察是否 transfer 完全；
PVDF 則進行西方點墨法。
白
海棉墊片 3M paper PVDF 膜 膠
3M paper 海棉墊片 黑
（＋）
（－）
(g)西方點墨法 (Western blotting)：將 PVDF 用 PBS 清洗一下，並以 Blocking solution(2％)振盪 15 min，再以 Blocking solution(2％) 作為溶劑分別將欲測之一次抗體 (β-actin、caspase 8、Fas、Fas-L、
Bid、caspase 9、Cyclin D1、CDK4、Cyclin E、CDK2、Cyclin A、
Cyclin B、CDC2、Rb、P-Rb、P15、P27、P21、SOD、Catalase) 稀 釋至適當的濃度，加到 PVDF membrane 使其均勻的覆蓋於
Membrane 上，並置於水平式旋轉器上室溫振盪 2 小時，此時蛋白為 接上一級抗體。先用 PBS 清洗一次，再用 PBST 洗三次，每次 10 分鐘轉速為 100 rpm。再以 Blocking solution(5％)作為溶劑加入二 次抗體稀釋至適當的濃度，加到 PVDF membrane 使其均勻的覆蓋於 Membrane 上，並置於水平式旋轉器上室溫振盪 2 小時，先以 PBS 清 洗一次，再用 PBST 洗三次，每次 10 分鐘轉速為 100 rpm，以清洗 未結合上的二次抗體，同時也可以低背景值。將 PVDF membrane
Membrane 上，並置於水平式旋轉器上室溫振盪 2 小時，此時蛋白為 接上一級抗體。先用 PBS 清洗一次，再用 PBST 洗三次，每次 10 分鐘轉速為 100 rpm。再以 Blocking solution(5％)作為溶劑加入二 次抗體稀釋至適當的濃度，加到 PVDF membrane 使其均勻的覆蓋於 Membrane 上，並置於水平式旋轉器上室溫振盪 2 小時，先以 PBS 清 洗一次，再用 PBST 洗三次，每次 10 分鐘轉速為 100 rpm，以清洗 未結合上的二次抗體，同時也可以低背景值。將 PVDF membrane