香椿（TSL-1）及樟芝（AC-10）對人類急性骨髓血癌細胞凋亡及細胞週期的機制探討

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(1)中國醫藥大學營養研究所. 碩士論文. 香椿（TSL-1）及樟芝（AC-10）對人類急性骨髓血癌細胞凋亡及細胞週期的機制探討 Toom Sinensis (TSL-1) and Antrodia Cinnamomea (AC-10) Induces Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Human Premyelocytic Leukemia Cell Lines In Vitro and In Vivo. 研究生：郭雅婷（Ya-Ting Kuo）. 指導教授：楊新玲（Hsin-Ling Yang）博士. 共同指導教授：許游章（You-Cheng Hseu）博士. 中華民國九十六年七月.

(2) 目錄第一部分香椿（TSL-1）對人類急性骨髓血癌細胞凋亡及細胞週期的機制探討. 中文摘要及英文摘要縮寫表第一章、. 文獻整理及研究動機 ------------------------------------------1. 一、香椿之介紹 ------------------------------------------------------1 二、血癌 ---------------------------------------------------------------4 二、細胞週期與癌症的關係 ---------------------------------------7 四、細胞凋亡之介紹 ----------------------------------------------13 五、粒線體與細胞凋亡之關連性 -------------------------------18 六、活性氧化物 (reactive oxygen species；ROS) 與細胞凋亡之關連性 --------------------------------------------------------20 七、裸鼠異位移植腫瘤 (nude mice xenograft tumor model) 模式 -----------------------------------------------------------------21 八、研究動機 --------------------------------------------------------23 第二章、. 實驗設計架構圖 -----------------------------------------------25. 第三章、. 實驗器材 --------------------------------------------------------26. 一、實驗材料 --------------------------------------------------------27 二、儀器 --------------------------------------------------------------29 第四章、. 實驗方法 --------------------------------------------------------30. 第一部分：探討香椿成分 TSL-1 對人類急性前骨髓血癌細胞株（HL-60）的抑癌影響一、人類急性骨髓血癌細胞(HL-60)培養 ----------------------31. I.

(3) 二．香椿(Toona sinensis；TS)之配製 ---------------------------32 三、細胞存活率(viability)之測定 ---------------------------------33 四、以倒立式位相差顯微鏡觀察細胞型態(Morphology) -----33 五、利用流式細胞儀(Flow cytometry)探討香椿萃取液對 HL-60 細胞週期之影響 ----------------------------------------------33 六、利用流式細胞儀探討香椿萃取液對HL-60細胞 sub G1 phase的分布情形 ---------------------------------------------35 七、粒線體膜電位△Ψm的分析 ---------------------------------36 八、活性氧化物測定(Reactive oxygen species) -----------------36 九、西方墨點法(Western blotting)分析細胞蛋白質的表現 --37 十、實驗統計 ---------------------------------------------------------44 第二部分：探討香椿成分 TSL-1 在活體動物抗癌作用一、人類急性骨髓血癌細胞(HL-60)培養 ------------------------45 二、實驗動物 ---------------------------------------------------------46 三、裸鼠異位移植腫瘤 (nude mice xenograft tumor model)模式 ----------------------------------------------------------------------46 四、給藥之方式 ------------------------------------------------------47 五、活體觀察 ---------------------------------------------------------47 六、組織包埋和切片 -------------------------------------------------47 七、病理 H&E 染色法 ---------------------------------------------48 第五章、. 實驗結果與圖表 ------------------------------------------------50. 第一部分：探討香椿成分 TSL-1 對人類急性前骨髓血癌細胞株（HL-60）的抑癌影響。第一節香椿萃取液(TSL-1)在HL-60細胞株對細胞存活的影響與細胞型態上的改變情形 ---------------------------52. II.

(4) 第二節香椿萃取液(TSL-1)在HL-60細胞株對細胞週期(Cell cycle)的影響 ----------------------------------------------56 第三節測定香椿萃取液(TSL-1)在HL-60細胞株是否產生活性氧化物(Reactive oxygen species) --------------------59 第四節香椿萃取液 (TSL-1) 在 HL-60 細胞株對膜電位 (Mitochondrial membrane potential)的影響 ----------62 第五節利用西方墨點法(Western blotting)探討香椿萃取液 (TSL-1)對細胞週期調控蛋白質表現量的影響 -----65 第六節利用西方墨點法(Western blotting)探討香椿萃取液 (TSL-1)對Casapse-9 蛋白表現量的改變 ------------75 第七節利用西方墨點法(Western blotting)探討香椿萃取液 (TSL-1)對死亡受器路徑中調控蛋白質表現量的影響 ----------------------------------------------------------------77 第八節利用西方墨點法(Western blotting)探討香椿萃取液 (TSL-1)對 SOD 及 Catalase 蛋白質表現量的影響 -82 第二部分：探討香椿成分 TSL-1 在活體動物抗癌作用第一節香椿萃取液 (TSL-1) 可抑制血癌 (HL-60) 腫瘤的生長-------------------------------------------------------------86 第六章、. 討論 ---------------------------------------------------------------92. 第七章、. 結論 ---------------------------------------------------------------98. 第八章、. 參考文獻 -------------------------------------------------------100. III.

(5) 第二部分樟芝（AC-10）對人類急性骨髓血癌細胞凋亡及細胞週期的機制探討. 中文摘要及英文摘要縮寫表第一章、. 文獻整理及研究動機 ----------------------------------------114. 一、. 樟芝之介紹 -----------------------------------------------115. 二、. 研究動機 --------------------------------------------------127. 第二章、. 實驗設計架構圖 ----------------------------------------------128. 第三章、. 實驗器材 -------------------------------------------------------130. 一、實驗材料 -------------------------------------------------------131 二、儀器 -------------------------------------------------------------133 第四章、. 實驗方法---------------------------------------------------------134. 第一部分：探討樟芝發酵液（AC-10）對人類急性前骨髓血癌細胞株（HL-60）的抑癌影響。一、人類急性骨髓血癌細胞(HL-60)培養 ---------------------135 二．樟芝(Antrodia Camphorata；AC)之配製 -----------------136 三、細胞存活率(viability)之測定 --------------------------------137 四、以倒立式位相差顯微鏡觀察細胞型態(Morphology) ---137 五、利用流式細胞儀(Flow cytometry)探討樟芝發酵液對 HL-60 細胞週期之影響 ----------------------------------------------138 六、利用流式細胞儀探討香椿萃取液對HL-60細胞sub G1 phase的分布情形 ---------------------------------------------139 七、粒線體膜電位△Ψm的分析 --------------------------------140 八、活性氧化物測定(Reactive oxygen species) ---------------140. IV.

(6) 九、西方墨點法(Western blotting)分析細胞蛋白質的表現 -141 十、實驗統計 --------------------------------------------------------148 第二部分：探討樟芝發酵液（AC-10）在活體動物抗癌作用。一、人類急性骨髓血癌細胞(HL-60)培養 ----------------------149 二、實驗動物 --------------------------------------------------------150 三、裸鼠異位移植腫瘤 (nude mice xenograft tumor model)模式 ---------------------------------------------------------------------150 四、給藥之方式 -----------------------------------------------------151 五、活體觀察 --------------------------------------------------------151 六、組織包埋和切片 -----------------------------------------------151 七、病理 H&E 染色法 -------------------------------------------152 第五章、. 實驗結果與圖表 ----------------------------------------------152. 第一部分：探討樟芝發酵液（AC-10）對人類急性前骨髓血癌細胞株（HL-60）的抑癌影響。第一節、樟芝(AC-10)在HL-60細胞株對細胞存活的影響與細胞型態上的改變情形 ---------------------------155 第二節、樟芝發酵液(AC-10)在HL-60細胞株對細胞週期 (Cell cycle)的影響 ----------------------------------158 第三節、樟芝發酵液(AC-10)在HL-60細胞株是否產生活性氧化物(Reactive oxygen species) ------------------161 第四節、樟芝發酵液 (AC-10) 在 HL-60 細胞株對膜電位 (Mitochondrial membrane potential)的影響 -----165 第五節利用西方墨點法(Western blotting)探討樟芝發酵液 (AC-10) 對細胞週期調控蛋白質表現量的影響 -----------------------------------------------------------168 第六節利用西方墨點法(Western blotting)探討樟芝發酵液 V.

(7) (AC-10)對Casapse-9 蛋白表現量的改變 -------178 第七節利用西方墨點法(Western blotting)探討樟芝發酵液 (AC-10)對死亡受器路徑中調控蛋白質表現量的影響 ------------------------------------------------------180 第八節利用西方墨點法(Western blotting)探討樟芝發酵液 (AC-10)對 SOD 及 Catalase 蛋白質表現量的影響 -----------------------------------------------------------186 第二部分：探討樟芝發酵液（AC-10）在活體動物抗癌作用。第一節樟芝發酵液(AC-10)可抑制血癌 (HL-60) 腫瘤的生長 -----------------------------------------------------------190 第六章、. 討論 -------------------------------------------------------------197. 第七章、. 結論 -------------------------------------------------------------202. 第八章、. 參考文獻 -------------------------------------------------------204. VI.

(8) 第一部分香椿（TSL-1）對人類急性骨髓血癌細胞凋亡及細胞週期的機制探討. VII.

(9) 縮寫表 APL：Acute Promyelocytic Leukemia AML：Acute Myelocytic Leukemia ATRA：All-trans Retinoic Acid Apaf-1：apoptosis protease-activating factor-1 CDK：Cyclin-dependent kinase CDKI：Cyclin-dependent kinase inhibitor CARD：Caspase recruitment domain Caspase：cysteinyl aspartate-specific protease DISC：Death-inducing signaling complex DED ：Death effector domain DNA-PK：DNA-dependent protein kinase DiOC6：3,3,- Dihexyloxacarbocyanine iodide FAS-L：Fas ligand FADD：Fas-associated death domain protein FACS：flow cytometry FBS：Fetal bovine serum HTLV-I：Human T-lymphotropic Virus type I H2DCF-DA：2,7- dichlorofluorescein diacetate HL-60：Human premyelocytic leukemia cells PARP：poly（ADP-ribose）polymerase PI：propidium iodide PS：penicillin-streptomycin PBS：Phosphate-buffered saline Rb：Retinoblastoma protein. VIII.

(10) ROS：Reactive oxygen species SOD：Superoxide dismutase TS：Toona sinensis TSL-1：Toona sinensis leave-1. IX.

(11) 中文摘要. 香椿（Toona sinensis，TS）含有酚類及類黃酮等化合物，近年來研究發現具有降血糖及抗癌等功效。本實驗室已得知由香椿葉萃取液（TSL-1）能誘導人類急性骨髓血癌細胞（Human Premyelocytic Leukemia Cells； HL-60）之細胞凋亡，但其機制並不清楚。因此，本實驗將由細胞實驗（in vitro）和動物實驗（in vivo）兩方面來更進一步探討 TSL-1 對 HL-60 細胞造成細胞凋亡之機制為何？結果由流式細胞儀分析發現細胞週期（Cell cycle）停滯在 G0/G1 期。以西方墨點法分析調控細胞週期的相關蛋白質分子表現，發現 TSL-1 可降低 HL-60 細胞之 Cyclin D1、CDK4、Cyclin E、CDK2 及 Cyclin A 蛋白質的表現，增加 p15 和 p27 蛋白質的表現。在 ROS 方面，TSL-1 會促進 HL-60 細胞 ROS 的釋放，造成粒線體受損，導致粒線體膜電位（mitochondrial membrane potential）下降，並活化 Caspase 9，進而誘導細胞凋亡。在死亡受器路徑（Death receptor pathway）發現 TSL-1 也活化 Caspase 8 ，進而誘導細胞凋亡。在活體動物抗癌試驗（Xenograft tumor assays）方面，TSL-1 可有效抑制腫瘤的生長。本研究之結果為香椿具有保健食品之功效，可開發作為化學預防（chemoprevention）的保健食品及藥品。. 關鍵字：香椿（Toona sinensis，TS），人類急性骨髓血癌細胞（Human Premyelocytic Leukemia Cells ； HL-60 ），細胞凋亡、細胞週期（Cell cycle）、ROS （reactive oxygen （Apoptosis） species）、活體動物抗癌試驗（Xenograft tumor assays）. X.

(12) 英文摘要. Previous phytochemical work on Toona sinensis (TSL-1) had led to phenolic compounds and flavonoids.Plants possess many phytochemicals with various bioactivities , which include hypoglycemic effect and anticancer activities. According to the previous data, we also analyzed its cytotoxic effect on human premyelocytic leukemia HL-60 cells and underlying mechanisms. In this study, we have addressed the cytostatic and apoptosis effects of Toona sinensis (TSL-1) on human premyelocytic leukemia HL-60 cells in vitro and in vivo. Treatment of HL-60 cells with Toona sinensis (TSL-1) resulted in the inhibition of cell proliferation , arrest of cell cycle in G0/G1 phase and commitment to apoptosis. The results also demonstrated that Toona sinensis (TSL-1) down-regulate the expression of cell cycle progress factors cyclin D1, CDK4, cyclin E, CDK2 and cyclin A .The Toona sinensis (TSL-1) up-regulate the expression of cell cycle progress factors p15 and p27. Toona sinensis (TSL-1) also induced production of reactive oxygen species and decreased the levels of mitochondria membrane potential in HL-60 cells. The active form of apoptosis key enzyme caspase-8 and caspase-9 was increased. Our results revealed that treatment of Toona sinensis (TSL-1) inhibits HL-60 tumor growth in experiments. Whereas, Toona sinensis (TSL-1) did not show any side effects in these in vivo studies. Our results suggest Toona sinensis (TSL-1) that could be used as a health food preventing and alleviating leukemia proliferation and possess the potential to be developed as an anticancer drug. Keyword：Toona sinensis、Human Premyelocytic Leukemia Cells、 Apoptosis、Cell cycle、reactive oxygen species、Xenograft tumor assays XI.

(13) 第一章文獻整理及研究動機一、香椿之介紹（一）關於香椿香椿(Toona sinensis Roem. ； Cedrela sinensis A. Juss.)為楝科 (Meliaceae)多年生落葉性喬本植物，英文名為Chinese mahogany，原生於中國東南，西南至華北地區，別名椿、紅椿、椿甜樹等。在形態上，其莖上枝條散佈皮孔，全株具濃烈氣味。葉為偶數羽狀複葉，互生，具長柄；對生，卵狀披針形，疏鋸齒緣，上表面深綠色，下表面淺綠色。花序為聚繖花序，圓錐狀排列，白色；花萼5裂：花瓣5裂，長橢圓形，花期5-6月。果實為蒴果，卵形，熟時褐色。種子橢圓形，有翅。產地為臺灣中低海拔山區及一般庭園栽培。多以扦插或種子繁殖【1-2】。在文獻已知全植物各部分(種子、根皮、樹皮、葉軸、樹葉)均有保健或治療之功能。全樹可利用，是經濟價值極高之樹種，自古為我國人民熟知和喜愛【3-4】。根據文獻記載樹皮、根皮及種子藥效為治神經痛，亦可止血、散寒、止痛、治胃、十二指腸潰瘍、淋病、月經不調、蛔蟲、抑制傷寒桿菌、抗阿米巴原蟲、風濕關節痛及抗癌的療效【5-6】。香椿的嫩葉呈小鉅齒狀可食，是自古以來深受喜愛的木本蔬菜，經現代科技分析含有蛋白質、脂肪、胡蘿蔔素(Carotene) 及維生素B 和C等，是營養價值極高的蔬菜。有文獻指出香椿的主要成分類黃酮及酚類化合物，具有抗氧化、抗癌的功效。針對香椿之可食的葉部與可供藥用的皮部進行有效活性成分分析，發現富含gallic acid、methyl gallate、ethyl gallate、kaempferol、quercetin、quercitrin、 rutin 、 catechin 等化合物【 8-11 】。而這些活性成分中的 gallic acid(3,4,5-trihydroxybenoic acid)及其衍生物已指出具有抗氧化及抗癌 1.

(14) 的功效【12-14】。. 圖一、gallic acid的化學結構圖. （二）香椿的生理機能之相關研究（1）抗癌功效：香椿葉具有抗卵巢癌及肺癌的效果。在動物實驗中顯示，香椿葉萃取液經腹腔注射給予裸鼠，能有效抑制卵巢癌的生長【15】。且也對肺大細胞癌細胞(H661)有極佳的抑癌影響，藉由抑制 cylin D1、CDK4的蛋白質表現，使細胞週期停滯在G1期進而誘發細胞凋亡【16】。（2）降血糖功效：以Alloxan 所誘發糖尿病鼠投予椿葉粗萃取粉劑後，實驗結果顯示不但能降低糖尿病鼠的血糖值、增加葡萄糖的耐受性，亦無急性及慢性的毒性，而且也不會影響正常老鼠的血糖值【17】。（3）抗發炎反應：有效抑制LPS刺激巨噬細胞釋放NO活性，可作為香椿之抗發炎活性成分指標【18】。（4）保肝功效：以四氯化碳在大白鼠誘發之急性肝炎後，發現香椿能隨劑量明顯地降低血清中GOT及GPT之值【19】。（5）香椿萃取液具有增進人類精液機能活性之效用。高濃度的椿葉粗萃液不具pro-oxidant作用並可有效改善氧化壓力所誘導的男性精子功能障礙，對於健康男性或不孕男性患者都具有提升精子品質的作 2.

(15) 用【20】。（6）止痛功效：香椿葉萃取液對化學治療引起周邊神經痛有明顯的止痛效果【21】。（7）香椿抗癌有效成分之安全性評估：香椿葉萃取物對於所測試的濃度範圍內 (5mg/plate) ，對 Salmonella typhimurium TA97 、 98 、 TA1535、TA100及TA102無致突變性。此外，以三月齡雄性SAMP8 小鼠進行動物實驗顯示每天固定給予香椿葉萃取物(2g/kg/BW)，連續 12週並未產生任何毒性【22】。（8）抗氧化及抑制低密度脂蛋白過氧化功效：香椿萃取液具有良好的抗氧化能力，包括提供還原力、氫原子的能力、清除超氧陰離子的能力及螯合亞鐵離子。另外也具有抑制LDL氧化修飾的效用，包括降低MDA生成量、抑制apo B裂解及LDL電位的改變，同時也保護LDL 避免膽固醇氧化裂解，且保護功效隨香椿萃取液濃度的增加而增加【23】。. 3.

(16) 二、血癌血癌(Leukemia)就是俗稱的「白血病」。佔台灣癌症的第十三位，小兒血癌更為小兒癌病之第一位，發病的人數更有逐年增加之勢。國內外均是如此。再九十四年全國癌症死亡統計調查，白血病的死亡人數佔全部癌症死亡人數的 2.61%，死亡率的排名男性為第十一位，女性為第十一位【24】。白血病是一種骨髓惡性疾病，骨髓無法產生正常的血球，取而代之的是一些毫無功能的異常血球，這些血球一直失控的滋生，但不會變成熟有功能的血球，所以白血病常常表現出白血球過高的現象，正常數目是一萬以下，這時可高達數萬，甚至數十萬, 由於骨髓衰竭了。沒有正常的白血球，病患就會容易感染，會有發燒、冷顫、敗血症。沒有紅血球，就會貧血、面色蒼白、氣促、頭暈、頭痛、疲勞。沒有血小板，就會止血不良、身體各處會有紫斑出現，甚至有鼻出血、牙齦出血、腦溢血或腸胃道排血現象，這些臨床症狀在個別病患不一定全部出現，或有程度的差異。. （一）血癌的成因 1.放射線照射：正常人罹患血癌的機率約在兩萬五千分之一左右，但在原子彈爆炸圈的倖存居民，罹患白血病的機率竟然高達六十分之一。另外懷孕婦女的腹部 X 光射，出生的小孩罹患白血病的機率也較高。 2.化學藥品：如某些抗癌藥物，及如 benzene、toluene 等化學物質。 3.病毒：目前只一種病毒被認為與血癌有關，即嗜人類 T 細胞淋巴球病毒(Human T-lymphotropic Virus type I，簡稱 HTLV-I)與成人型 T 細胞白血病(Adult T-cell lymphoma-Leukemia)有關。 4.遺傳及基因突變：先天染色體異常，如唐氏症候群(Down's)、布倫. 4.

(17) 氏症候群(Bloom's)等先天疾病可能會誘導白血病的發生。如家族中罹患急性白血病，則罹病的機率也會比較高。 5.免疫能力：自體免疫能力的缺陷可能與慢性淋巴球性白血病有關。. （二）急性前骨髓性白血病(APL)的簡介急性前骨髓性白血病(Acute Promyelocytic Leukemia，APL)是屬於急性骨髓性白血病(Acute Myelocytic Leukemia, AML)之一種亞型，約占成人AML的百分之十【25-26】。臨床上急性前骨髓性白血病常合併有出血症狀、貧血、淋巴結腫大等。而急性前骨髓性白血病細胞大多對化學治療有敏感性，主要是由anthracycline及cytarabine所組成的化療藥劑，但在緩解期的早期會有較高的死亡率【27】。急性前骨髓性白血病不同於其他的急性骨髓性白血病其他亞型，其病患第15及第17號的染色體片段會有交錯異位(t(15;17))的情形發生【 28 】，而使得其有前骨髓性白血病基因與 retinoic acid receptor-alpha(RAR-alpha)基因互相融合，是急性前骨髓性白血病病患最明顯的特徵【29-30】。. （三）血癌的治療方式目前血癌的治療方式包括化學治療、骨髓幹細胞移植、放射線治療，與免疫治療等方式。 1.化學治療：為最主要的治療方式，大致可分為二階段，第一階段為「引導治療」目的在殺死血癌細胞，以達到完全緩解，讓骨髓長出正常之白血球、血小板及紅血球之後，必須再接受第二階段的「鞏固治療」目的在清除殘餘的癌細胞。傳統化療是利用極高劑量的化學藥物殺死癌細胞來達到緩解目的。現今利用藥物促進細胞分化的方式，如臨床上 5.

(18) 的全反式維甲酸(All-trans Retinoic Acid；ATRA)誘導前骨髓細胞得以自然分化成正常骨髓細胞。但 ATRA 的使用並不能消滅癌基因，也無法完全治癒病人，但分化療法使得瀰漫性血管內凝血異常的發生率減少，疾病的緩解率也同時提高【31】。另一類藥物為可使血癌細胞凋亡的三氧化二砷。其主要之機轉可能在於三氧化二砷會影響癌細胞的「細胞週期」，它使癌細胞停滯在 G1 期及 G2/M 期之檢查點，主要的原因在於三氧化二砷作用於增殖細胞，而正常之幹細胞因大多停留在 G0 期，故對正常之幹細胞毒性遠比增殖細胞來得少【32】。三氧化二砷在治療初期，會有輕度消化道症狀 (如：噁心、嘔吐、食慾降低等) ，和手足麻木，肝、腎功能改變，顏面及下肢水腫、皮膚色素沉著，以及肋膜腔積水、腹水等副作用，於停藥後即可慢慢恢復。 2. 骨髓幹細胞移植：骨髓移植：分自體和異體骨髓移植，在接受高劑量化療及全身放射線治療之後再輸入自體或捐贈者的骨髓，以重建病人的造血系統及免疫系統。亦可使用週邊血液幹細胞移植，也分為自體及異體週邊血液幹細胞移植，通常於高劑量化療或合併全身放射線治療後，達到重建造血及免疫系統的目的。 3. 放射線治療：可分為局部或全身性放射線治療。防止少數癌細胞流竄到中樞神經，醫師會建議做中樞(腦部、脊髓)之預防性治療，而全身性放射線治療則用於骨髓移植前的治療。 4. 免疫療法：干擾素、單株抗體。. 6.

(19) 二、細胞週期與癌症的關係（一）細胞週期之介紹細胞的生長和增殖具有一定的規律性，藉由染色體的複製及傳遞遺傳訊息給予細胞的能力，細胞才能進行生長、分裂。當子代細胞形成後，又開始新一輪的物質累積，準備下一輪的細胞分裂，如此週而復始，細胞的數量不斷增加，這種細胞物質累積與細胞分裂的循環過程，稱為細胞週期(Cell cycle)。一個細胞週期即是一個細胞的整個生命過程，由一個老的細胞變成了兩個新的細胞，因而細胞週期有時也稱為細胞生活週期(Cell life cycle)。細胞週期可分為四個時期，是包含了G0/G1、S、G2、M等階段時期【33】。 (1). Gap 0(G0)：細胞處於休眠的狀態，可能是暫時休眠或者是永久性休眠，需要有適當的訊息才會重新投入細胞週期。 (2). Gap 1(G1)：細胞維持正常代謝並且繼續生長，在進入S (synthesis) 時期之前會檢查染色(chromosome) DNA是否受到破壞以進行修補(repair)的工作。細胞也可能由此脫離細胞週期進入不生長的休止狀態(G0)。 (3) .Synthesis(S)：當細胞進入S 時期進行DNA 的合成，將原本的二十三對染色體複製另一份，其目的在複製。 (4) .Gap 2(G2)：當細胞進入G2 (gap2)時期除了繼續生長並且合成蛋白質之外，細胞也會負責檢查染色體DNA 的複製是否完整以準備進行有絲分裂(mitosis)。 (5) .M (mitosis) ：細胞會由一個母細胞變成兩個子細胞，已複製完整的染色體會各自分配到子細胞內，使得子細胞內的染色體與母細胞完全一樣，之後子細胞再開始進入下一個細胞週期。. 7.

(20) 在細胞週期中，每個階段或是時期交界都有所謂的『檢查點』 (checkpiont)，其意義類似於工廠製造過程中的品管控制。G1期所監測的為細胞個體的大小，在細胞成長過程中，細胞核遺傳物質若有受外界高能輻射線或化學物質的影響而突變，則啟動修復系統。S期則是在進行DNA複製，而G2期主要在檢查所有染色體DNA是否都被複製且限於一次，若一切都正常才能進入最後細胞分裂M期。若是當 DNA受損時，細胞週期便無法通過檢查哨而造成停滯，這就是所謂的cell cycle arrest。此時DNA會進行修復(DNA repair)，若是遇到無法彌補的錯誤時，細胞則會走向計畫性凋亡(apoptosis)【34】。. （二）細胞週期調控之蛋白質週期素cyclin D和E主要存在G1期，並在G1-S期時會被分解，像是幾種cyclin-dependent kinases (CDKs)，皆與G1期調控有關，當靜止細胞進入細胞週期時，基因編碼(encoding)在D-type週期素上(D1，D2 和D3)，並且誘發細胞分裂的訊息，而週期素亦會催化一些因子，如 CDK4和CDK6，進而促進G1期【35】。由Cyclin D1去調節holoenzymes的次單元並使其磷酸化，而藉由 cyclin E/CDK2 而磷酸化，視網膜母細胞瘤蛋白 (retinoblastoma protein；pRb)呈現未活化狀態而抑制細胞週期，pRb可說是G1期的看門人，亦可說它會穿越過限制點而導致DNA的合成【36】。當cyclin D1 過度表現時，會是導致癌症和腫瘤因子的形成和轉移的開始。故cyclin D1在G1期的調控扮演重要角色【37】。關於真核細胞的G1/S期的檢查點(checkpoint)，主要是G1期進入DNA合成期(synthesis phase)時，由兩群細胞激素調控，包括(CDK4/6-cyclin D和CDK2-cyclin E)，及轉錄複合物包括(Rb and E2F)扮演在此檢查點的關鍵角色。在G18.

(21) phase，發現Rb-HDAC的抑制複合物會與E2F-DP1轉錄因子結合並抑制下游路徑的轉錄。藉由 CDK4/6 和分離的 CDK2 與 Rb-repressor complex會使Rb磷酸化，容許轉錄的S期基因與蛋白編碼(encoding)，成為一個G1往S期的開關，並進行DNA複製。多數不同的刺激會影響檢查點(checkpoint)的控制，如TGF-β、DNA損傷、contact inhibition，和生長因子消退。而在G1時期的後期cyclin E會大量增加，並與CDK2 結合，除了促使細胞進入S時期外，也和DNA複製的早期調控有關。進入S時期後，cyclin E即消失，CDK2再與cyclin A結合。當要進入 G2/M時期，cyclin A與cyclin B會與Cdc2（CDK1）結合，調節有絲分裂的進行。. 細胞週期中還有另一群重要的調控因子，就是CDKI（cyclin dependent kinase inhibitors）【38-40】。基本上分成兩個族群，一為INK4 family，另一為KIP/CIP family。在INK4 family中，主要成員有p14、 p15(INK4B)、p16(INK4A)、p18(INK4C)以及p19(INK4D)，其功能為抑制Cyclin D/CDK4 與Cyclin D/CDK6 而達G1時期的控制。另一個族群為KIP/CIP family，包括p21(CIP1/WAF1/SDI1)、p27(KIP1)以及 p57(KIP2)。KIP/CIP家族所影響的層級較INK4家族為廣，其所調控的蛋白包括 Cyclin E/CDK2 、 Cyclin D/CDK1 、 Cyclin D/CDK6 、 CyclinA/CDK2及Cyclin B/CDK1等。p21及p27幾乎在所有細胞都會表現，對G1及G2時期的調控十分重要，過度表現會使細胞週期停滯。. 研究顯示G2/M期之調控機制是當細胞由G2時期欲進入M時期，藉由Tyr-14與Tyr-15已去磷酸化Cdc2/CDK1與cyclin B結合，使得細胞進入分裂期。正向調節cyclin B/CDK1活性的蛋白質包括去磷酸化的蛋白質Cdc25C，而負向調節則包括Cdc25C的上游蛋白質Chk1/2、 9.

(22) Cdc2/CDK1 磷酸化的蛋白質Wee1與Myt Kinase等【41】。. 圖二、細胞週期調控之蛋白質 www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/gifs... 10.

(23) （三）細胞週期與癌症之關係癌症與細胞週期的變化息息相關，細胞不受控制的增殖是癌症的主要特徵。導致此現象的發生是由於負責調節細胞週期或者參與細胞週期檢查點調控的蛋白質的基因受到改變，使得這些蛋白質產物失去原有的功能而造成細胞週期不斷地進行。有幾種腫瘤抑制蛋白質 (tumor suppressor gene)的作用之處是位於細胞週期的檢查點上，隨時掌握細胞週期是否該採煞車，例如p53轉錄因(transcription factor)的基因突變之情形在很多癌症中可以被發現，p53蛋白質的含量在DNA受損時會增加，受到活化的p53會使p21開始生產，p21結合至Cyclin與 CDK的複合體使細胞週期被停止在G1晚期以修補錯誤的DNA序列，所以p53的功能喪失將會使得細胞該停止時卻停不下，來，因此不斷地增生。視網膜母細胞(retinoblastoma, RB)是在視網膜(retina)生成的一種癌症，在正常情況下，未受到Cyclin D與CDK4及Cyclin E與CDK2 的複合物高度磷酸化的RB會與轉錄因子E2F結合並停在G1晚期，當 pRB受到高度磷酸化時，E2F會離開RB而啟動基因轉錄的進行，而此基因所轉譯的蛋白質會推動細胞週期走向S時期，所以當RB基因突變時，細胞週期便無法正常停止在G1晚期，在細胞尚未檢查DNA序列正確與否之前就直接走入S時期，結果會使得細胞無法停止地增生【42-43】。. 11.

(24) 圖三、Rb Signaling Pathway Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 5, March 1, 2000. 12.

(25) 四、細胞凋亡之介紹（一）細胞凋亡訊息調控之路徑細胞凋亡是一種由基因調控所產生的自然的死亡，故亦稱之為細胞計畫性死亡【44】。在細胞凋亡過程中，其特定型態的改變，如細胞皺縮、染色質濃縮、DNA 斷裂為 180～200 base-pair 的倍數、細胞膜表面的磷脂醯絲胺酸(phosphatidylsine；PS)由細胞膜內側翻轉至外側，和凋亡小體(apoptotic bodies)的形成【45】。在哺乳細胞中發現誘發細胞凋亡的訊息傳遞路徑可分為三類，一類為經由死亡受器傳遞路徑(Death receptor pathway)，第二類為粒線體傳遞路徑(Mitochondrial pathway)，第三類為內質網路徑(Endoplasmic reticulum pathway)( 圖四)，而這三條主要細胞凋亡路徑上下游間及彼此間也互相影響：（1）死亡受器傳遞路徑(Death receptor pathway) 當 Fas ligand(Fas-L)與細胞膜表面蛋白質 Fas(CD95)結合後，促使下游的受體傳導蛋白質 FADD(Fas-associated death domain protein) 與 procaspase-8 結合形成 DISC(Death-inducing signaling complex)進而活化 procaspase-8，活化的 caspase-8 便活化其下游的 caspase-3，而使得細胞凋亡發生【46】。另外，也發現死亡受器傳遞路徑會經由活化 Bcl-2 家族蛋白中的 Bid，來達到與粒線體路徑產生互動。當 caspase-8 活化之後，會切割 Bid 使其轉換成 truncated Bid(tBid)，接著 tBid 會由細胞質移動到粒線體上，可能經由與 Bax 或 Bak 作用，進一步促使 Cytochrome c 的釋放【47】。（2）粒線體傳遞路徑(Mitochondrial pathway) 粒線體接受細胞凋亡的刺激，會活化 Bcl-2 家族蛋白，造成粒線體膜電位下降，便釋放凋亡因子，如 Apaf-1(apoptosis protease-activating factor-1) 、 Cytochrome c 、 procaspase-9 ，和. 13.

(26) AIF(apoptosis-inducing factor)等蛋白。當 Apaf-1、Cytochrome c、 dATP 及 procaspase-9 結合形成凋亡複合體(apoptosome)後，使 procaspase-9 便形成活化態的 caspase-9 ，進而活化下游的 caspase-3 而使 poly(ADP-ribose)polymerase【48】分解斷裂，使細胞走向細胞凋亡。（3）內質網路徑(Endoplasmic reticulum pathway) 在內質網路徑中發現 caspase-12 專一性地存在於內質網中。當內質網受到外在壓力刺激後，Ca2+會被釋出，活化 caspase-12，進而使細胞走向細胞凋亡【49】。有文獻指出，由內質網誘發細胞凋亡也可受到 Bcl-2 家族的調控【50】。. 圖四、細胞凋亡訊息傳遞路徑 http://www.immunityageing.com/content/3/1/5/figure/F1. 14.

(27) （二）細胞凋亡調控之蛋白質 1. Caspase 家族 Caspase(cysteinyl aspartate-specific protease)為一群蛋白質水解酵素的總稱。當特定天冬胺酸(Asp)的 C-端之肽鍵被切斷而活化，對下游的蛋白產生水解作用，造成細胞凋亡的發生【51】。Caspase 在細胞凋亡發生的過程中，扮演很重要的角色，會直接或間接影響細胞凋亡的進行。 Caspase 依其在執行凋亡進行中的角色可分為三類【52-54】：（1）ICE 家族(the ICE subfamily of cytokine processors)：有 caspase-1、 -4、-5、-11、-12、-13 與-14，其功能主要與發炎反應有關。（2）ICH-1/Nedd-2 家族(the ICH-1/Nedd-2 subfamily of apoptotic initiators)：有 caspase-2、-8、-9 與-10，其功能主要負責活化 apoptotic executioners 以執行細胞凋亡。此類 caspase 在結構上，N 端具有較長的 prodomain，如 caspase-8、caspase-10 其 N 端 prodomain 具有兩個 death effector domain(DED)，來和下游的 adaptor molecule C 端的 DD domain 聯結，以傳導來自 Death receptor pathway 的 death signals。而在 caspase-9 上，則具有 CARD(caspase recruitment domain) 位於 prodomain 上，此 CARD domain 可與 Apaf-1 上 N 端的 CARD 結合，傳導來自 mitochondria pathway 的 death signals。（3）Ced-3/CPP32 家族（the Ced-3/CPP32 subfamily of apoptotic executioners）：有 caspase-3、-6、-7。其功能主要負責執行細胞凋亡，裂解其下游的蛋白質，如 poly(ADP-ribose)polymerase(PARP) 、 DNA-dependent protein kinase(DNA-PK)等。這類的 caspase 結構上 N1的 prodomain 較短，能分解細胞內的蛋白質 PARP。PARP 的功能是修. 15.

(28) 復受損的 DNA、調控細胞增殖與死亡的平衡，和維持基因體的穩定性。當 PARP 受 caspase-3 裂解，由原本的 116 kDa 被水解成 85 kDa 而失去原本的作用。Caspase-3 也將裂解 ICAD/DFF45(inhibitor of caspase-3-activatedDNase)導致其鍵結的 CAD/DFF40(caspase-activated deoxyribonuclease)能脫離 ICAD 的束縛，進而 CAD 可轉移到細胞核內分解 DNA 成大約 180～200 bp 長度的片段。然而，caspase 均具有下列共同的特徵：（a）原本為單一無活性的酶原，活化後被切割成大、小次單位，而形成四聚體模式，如 caspase-8 其活化態為(P20/P10)2，其切割蛋白質的作用位置則是 Asp 之 C 端的肽鍵。（b）具有自身催化或相互激活的能力。（c）具有相似的催化部位(catalytic site)，包括含有 active site cysteine 殘基的 QACAG sequence。. 2.Bcl-2 家族 . Bcl-2為凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白，扮演調控粒線體凋亡途徑。Bcl-2家族也是調控細胞凋亡重要因子之ㄧ。Bcl-2家族具有 BH(Bcl-2 homology)domain，分為BH1、BH2、BH3、BH4。此家族依功能性分為兩大類：（1）促進細胞凋亡的蛋白質(pro-apoptotic)：包括 Bax、Bak、Bad、 Bid、Bik，與 Bcl-Xs 等，大都存於細胞質，一旦接受到死亡訊息則會從細胞質轉位至細胞膜上。（2）抑制細胞凋亡的蛋白質(anti-apoptotic)：包括 Bcl-2、Bcl-XL、 Bcl-W 等，大都存於粒線體膜、內質網膜，和核膜上。此兩類分子在體內相互制衡。若促進細胞凋亡的蛋白質較抑制. 16.

(29) 細胞凋亡的蛋白質多時，則將細胞誘導凋亡；反之細胞存活不死。. 17.

(30) 五、粒線體與細胞凋亡之關連性粒線體除了是細胞能量工廠外，學者發現粒線體呼吸鏈被抑制，細胞內大量產生活性氧屬 (reactive oxygen species；ROS) 將導致細胞凋亡。有研究指出ROS會經由氧化作用造成細胞質、蛋白質與核酸受到破壞，使得粒線體上電子傳遞鏈的複合體活性受到抑制，進而造成粒線體傷害，使得粒線體膜電位去極化，放出大量的ROS，而使得細胞內GSH耗空、脂質過氧化、改變酵素活性與DNA的破壞等等，最後造成細胞凋亡【55】。因此，粒線體已成為研究細胞凋亡的中心。而粒線體膜電位下降在細胞凋亡的過程中更是為一項重要的指標。當粒線體膜電位下降時會釋放出apoptogenic proteins，而粒線體電位下降大多是由於粒線體內膜滲透性 (mitochondrial membrane permeabilization)而導致，滲透性轉移孔洞(permeabilization transition pore；PTP)與粒線體內膜滲透性及粒線體膜電位的穩定有很重要的關係，它是一個橫跨粒線體內膜及外膜的 complex ，一但因為被 proapoptotic factors而開啟，permeabilization transition pore就會打開，使得粒線體內膜電位下降進而造成細胞凋亡。根據推測它至少由三種蛋白所組成，其中一種為電位敏感性陰離子管道(voltage-dependent anion channel；VDAC)，它位於粒線體外膜，以及位於粒線體內膜上的soluble matrix protein cyclophilin D (Cyp D)及adenine nucleotide translocase (ANT)所共同組成之複合體。一些antiapoptotic 分子，利如；Bcl-xL、Bcl-w、或Bcl-2會抑制，而一些proapoptotic proteins，如 Bax、Bak所形成的supramolecular openings就阻止了VDAC的開啟。在細胞凋亡的過程中，當細胞表面的death receptor受到外來物刺激，而活化caspase-8時，被活化的caspase-8會將Bid切割成活化的tBid，活化的tBid就會抑制了Bcl-2的活性，而使的Bax、Bak不被抑制而活化了. 18.

(31) VDAC進而釋放出apoptotic factors，如cytochrome c 接著就會活化下游的caspase-9及caspase-3進一步的造成細胞凋亡【56】。. 19.

(32) 六、活性氧化物 (reactive oxygen species；ROS) 與細胞凋亡之關連性. 科學家在探討老化和年齡之間的關係，於是有人提出代謝所產生一種活性大的副產物稱「活性氧化物」(ROS，reactive oxygen species)，認為ROS會傷害細胞，造成DNA傷害，並可能會導致老化。後來發現取決於 ROS 對於人體產生反應的好壞在於氧化壓力 (oxidative stress)，而利用過氧化歧異酶(superoxide dismutase)，和催化酶(catalase) 可以對抗氧化壓力而延長生命【57】。 ROS即氧化自由基，由氧和氧所衍生的氧化物質所生成，含有一或多個不成對電子，包括超氧陰離子(O2. ‧－. )、過氧化氫(H2O2)、過氧. 化基(ROO‧)和氫氧基(OH‧)。而活性氧化物(reactive oxygen species) 會調節多種細胞的死亡，而高濃度的活性氧化物會導致脂質過氧化、細胞膜損傷、caspase酵素的未活化和細胞壞死。相反地，低濃度的活性氧化物會活化蛋白質激酶和磷酸酶、鈣離子儲存、活化或未活化轉錄因子和導致細胞凋亡的現象。高濃度的活性氧化物會直接損傷細胞並殺死細胞，相反地，低濃度的活性氧化物會間接的經由蛋白質激酶和磷酸酶、轉錄因子和分子中基因表現而誘發細胞凋亡【58、59】。近年來，活性氧已被發現與許多人類疾病有關，其中與老化、心血管疾病、杭汀頓氏舞蹈症 (Huntington’s disease) 、帕金森氏症 (Parkinson’s disease)、阿滋海默症(Alzheimer’s disease)、神經退化疾病、癌症以及發炎疾病有著密切的關係。氧化壓力主要的來源為活性氧化物，故調節活性氧化物對於調控氧化壓力扮演著重要的角色，亦可以使用技術去調控細胞凋亡有關的氧化壓力【60】。. 20.

(33) 七、裸鼠異位移植腫瘤 (nude mice xenograft tumor model) 模式. 裸鼠是一種獨特的純系動物。例如裸小鼠，就其基因型而言，它們帶有等位基因的 nu/nu，其表現型則為：全身無毛，先天性無胸腺， T 淋巴細胞缺失，細胞免疫機能缺陷，對異體移植物幾乎無免疫排斥反應，可接受異系、異種腫瘤移植等。所以，它在實驗腫瘤研究中已被廣為應用。這也是實驗動物科學的開發研究成果為抗癌研究提供了一種極有價值的實驗材料，大大促進了腫瘤學研究的進展。 1968 年 Flanagan 首先報導了裸體小鼠，1968 年 Pantelouris 報告此種動物表現為先天性胸腺缺失，展示了免缺陷動物的研究和應用。 Rygaard 和 Povlesev 二氏在 1969 年將人類腫瘤異種移植於裸鼠時，首次獲得成功，其腫瘤組織在移植後不僅存活，而且繼續生長，並於 2～3 週後，形成很大的瘤塊。此前，人類腫瘤的異種移植基本上是不可能成活的；或者是要在某種特殊處理條件下（如實驗動物先受放射線照射，可地鬆處理，胸腺摘除，投與抗 T 細胞抗體等）偶然得以成活。此後，相繼已有許多學者移植成功，並證明此種小鼠是研究人體腫瘤的一種較理想的實驗動物，有人認為是活的試管。自 1969 年以來，國外已建立了可移植性人體腫瘤數百種，這些瘤株除了能防止由傳代而伴隨的腫瘤組織形成學退化外，還能保持原代細胞的各種功能，如胃癌細胞產生的粘液、惡性黑色素瘤細胞產生的黑色素、肝癌細胞產生的甲胎球蛋白等，同時在多種情況下還可顯示各種腫瘤所產生的激素，加上其對治療實驗、化療及放療的敏感性和臨床結果的一致性，使這些瘤株成為研究抗癌藥物一個較為理想的工具，1983 年 B. 21.

(34) odgen 等用無胸腺小鼠腎囊膜內移植人體腫瘤法篩選新藥，全部實驗僅 11 天，且成功率較高【61】。. 22.

(35) 八、研究動機香椿(Toona sinensis，TS)為楝科(Meliaceae)之落葉喬木。根據文獻資料可知各部位均有保健或治療之功能。近年來有研究發現香椿中含有酚類及類黃酮等化合物，並具有降血糖及抗癌等功效。本實驗室已得知由香椿葉萃取液(TSL-1)能誘導人類急性骨髓血癌細胞(Human Premyelocytic Leukemia Cells； HL-60)之細胞凋亡，其結果發現香椿葉萃取液(TSL-1)在對人類正常內皮細胞無傷害的情況下，會減少 HL-60 細胞存活率及生長情形；同時藉由西方墨點法(Western blotting) 結果顯示 Bcl-2 蛋白質表現量減少，Bax、cytochrome c 蛋白量表現量增加，活化 Caspase 3 進而裂解 PARP 成兩片段(116 和 89 KDa)。由以上結果顯示香椿葉萃取液(TSL-1)對 HL-60 細胞具有藉由誘導細胞凋亡而表現出有效的抗增值性【62】。雖然已知香椿葉萃取液(TSL-1)能誘導人類急性骨髓血癌細胞 (Human Premyelocytic Leukemia Cells； HL-60)之細胞凋亡，但對細胞凋亡的可能機制及路徑仍不太清楚。因此，本研究以香椿葉進一步處理香椿葉水萃物得到香椿葉水萃物第一部分(fraction)簡稱為TSL-1，並以TSL-1對人類急性前骨髓血癌細胞之抗癌影響。本研究分為兩個部分進行：第一部分：探討香椿成分TSL-1對人類急性前骨髓血癌細胞株(HL-60) 的抑癌影響。第二部分：探討香椿成分TSL-1在活體動物抗癌作用。. 23.

(36) 第二章實驗設計架構圖. 24.

(37) 實驗設計流程圖香椿萃取液(TSL-1). 血癌細胞株(HL-60). 細胞毒性分析觀察細胞形態. ROS. 西方墨點法. 膜電位(△Ψ). (Western blotting). 細胞凋亡調控蛋白之表現. 細胞週期. 細胞週期調控蛋白之表現. 細胞凋亡. 動物實驗. 25.

(38) 第三章實驗器材. 26.

(39) 一、實驗材料. 1.購自美國 Sigma Chemical Company： Trypan. blue. 、. Dimethyl. sulfoxide(DMSO). 、. Sodium. bicarbonate(NaHCO3)、propidium iodide(PI)、Trition-X 100、RNase A 、 Sodium chloride(NaCl) 、 Potassium chloride(KCl) 、 Sodium phosphate(NaHPO4) 、 Potassium phosphate monobasic(KH2PO4) 、 Tris-base、Ethylenediamide-tetraacetic acid(EDTA) 2.購自德國 GIBCO 公司： RPMI Medium 1640、Penicillin-streptomycin(PS)、2 mM L-Glutamine 3.購自 Hyclone 公司： Fetal bovine serum(FBS) 4.購自 Millipore 公司： PVDF 5.購自德國 BIO-RAD 公司： Protein assay dye reagent、30％ Acrylamide/Bis solution(29：1)、 Ammonium persulfate、N,N,N,N-Tetramethyl ethylenediamide(TEMED)、Glycine、Sodium dodecyl sulfate(SDS)、 Tris-HCl 6.購自 Amersham Life Science： Recombinant protein molecular weight marker 7.購自 Pierce 公司： SuperSignal WestPico Chemiluminesent Substrate 8.購自 BioChemike 公司： 2,7- dichlorofluorescein diacetate(H2DCF-DA) 9.購自 ALDRICH 公司： 27.

(40) 3,3,- Dihexyloxacarbocyanine iodide(DiOC6) 10.各種抗體：一級抗體：β-actin mouse monoclonal antibody 購自 Sigma, USA 公司。 FAS rabbit polyclonal antibody、FAS-L rabbit polyclonal antibody、PCNA mouse monoclonal antibody、Cyclin E rabbit polyclonal antibody 、 CDK2 rabbit polyclonal antibody、Cyclin B rabbit polyclonal antibody、CDC2 rabbit polyclonal antibody、P21 rabbit polyclonal antibody 購自 Santa Cruz, USA 公司。 Caspase 9 mouse monoclonal antibody、Caspase 8 rabbit polyclonal antibody、Bid mouse monoclonal antibody、 Cyclin D1 mouse monoclonal antibody、CDK4 mouse monoclonal antibody、Rb mouse monoclonal antibody、 Phospho-Rb rabbit polyclonal antibody、Cyclin A mouse monoclonal antibody、P15 rabbit polyclonal antibody、P27 rabbit polyclonal antibody 購自 Cell Signaling, USA 公司。 Catalase rabbit polyclonal antibody 購自 Cashmer Biotech, USA 公司。 SOD sheep antibody 購自 BIODESIGN 公司。. 二級抗體：Anti-mouse IgG、Anti-rabbit IgG、Anti- sheep IgG購自 Santa Cruz, USA公司。. 28.

(41) 二、儀器. 1.天秤：Scaltec SBC31 2.直立式電泳槽：Hoefer 3.電泳轉印槽：BIO-RAD 4.電源供應器：BIO-RAD computer power supply model 3000Xi 5.加熱攪拌器：Barustead thermolyne SP18425 6.桌上型微量離心機：Sigma 1K15 7.高速離心機：KUBOTA 2010 8.ELISA Reader：Dynatech MR7000＆Dynex MRX 9.PH meter：Denver Basic 10.細胞培養箱：NUAIRETM US AUTO flow 11.幫浦：HETO SUE 30Q 12.無菌操作台：NUAIRETM class II TYPE A/B3 13.倒立式顯微鏡：Nikon Diaphot 300 14.超因波震盪器：Bransonic PC 620 15.高壓殺菌釜：TOMIN TM32 16.水平式搖晃器：Oribital shaker OS 701 17.水浴槽：FIRSTERTM SIENTIFIC 18.感光夾：HypercassetteTM rpn111649 19.X 光感光底片：Kodak Scientfic Imaging Film 20.純水製造機：Millipore milli-Q Plus 21 震盪器：KS ORBITAL Shaker 22.Ultracentrifuge：Beckman 23. 流式細胞計數儀（flow cytometry：FACS）：Becton Dickinson. 29.

(42) 第四章實驗方法. 30.

(43) 第一部分：探討香椿成分TSL-1對人類急性前骨髓血癌細胞株 (Human premyelocytic leukemia cells；HL-60)的抑癌影響。. 一、人類急性骨髓血癌細胞(HL-60)培養 1. 試劑：（1） RPMI-1640(1 升)： RPMI-1640(9.5 g)粉狀培養基溶於 900 mL 的二次水中，加入 2 g NaHCO3，一起混合均勻，溶解後調 PH 值至 7.4，最後體積定量至 1 升。利用 pump 通過孔徑 0. 22μM 的無菌過濾謨過濾，再加入 1％抗生素(PS；penicillin-streptomycin)，混合後保存於 4℃。（2）0.4％ Trypan blue：取 0.04g Trypan blue 溶於 10 ml 1X PBS 中，通過孔徑 0.45 μM 的濾膜，濾除雜質，室溫保存。 2. 細胞株來源及培養條件：將人類血癌細胞株(HL-60)培養於 RPMI-1640 培養液中(含 10% foetal. bovine. serum 、 2. mM. L-glutamine 、 1% penicillin. -streptomycin），置於 37℃、5% CO2 的培養箱中培養。 3. 繼代培養(secondary culture)：平常使細胞密度維持在 2～5×105 cells/mL。繼代培養時，將培養液收集至離心管中，離心 1200 rpm，5 分鐘，吸掉上清液，在將細胞打散加入新鮮培養液培養。 4. 解凍細胞：自液態氮桶將HL-60細胞取出後，立即移置於37 ℃水浴槽中，. 31.

(44) 在 30 秒內急速解凍，再將細胞冷凍保存液 (Cell culture freezing medium-DMSO)吸到已加好培養液無菌離心管內稀釋，經離心，去除上清液，再加入培養液，將細胞均勻打散後，移到培養瓶(T75 Flask)，於含5% CO2的37℃培養箱中生長，並且需定期更換培養液。 5.冷凍細胞：將生長狀態良好的細胞自培養瓶移至50 mL離心管，1200 rpm，5 分鐘，吸掉上清液，再加入freezing medium(5% DMSO 和95% FBS) 充分混合後，置於入2 mL冷凍小管內，此時每個冷凍小管的細胞密度為1～5×106 cells/mL。先將內含有細胞freezing medium的冷凍小管放在4 ℃ 15分鐘，再移至- 20 ℃ 15分鐘，之後移到- 80 ℃ overnight，最後放入液態氮中保存。 6. 細胞計數(Cell count)：先將細胞培養液吸至50 mL離心管，離心1200 rpm 5分鐘，倒去上清液後，加入細胞培養液將細胞打散，最後再取適量體積與trypan blue 做均勻混合後(含有細胞的培養液：trypan blue = 1：1)，吸至細胞計數盤(counting chamber / Hamacytometer)，在顯微鏡下計數。. 二．香椿(Toona sinensis；TS)之配置香椿萃取流程：將 100 克洗淨的新鮮香椿葉，加入 1000 mL 的去離子水，於沸點下煮沸直到剩 100 mL 的體積量，此溶液為香椿萃取液。所得香椿粗萃取液以離心(3000 rpm、12 分鐘)取得上清液，而後進行真空冷凍乾燥，得粉末 TSL-1 保存於-20℃下【61】，再利用二次水將 TSL-1 粉末充分溶解，配置成所需濃度以利實驗之進行。. 三、細胞存活率(viability)之測定 32.

(45) 1.原理：未受損之健康細胞，由於細胞膜完整使 Trypan blue 染劑無法進入細胞內，所以細胞不會被染色。而受損或死的細胞，因細胞膜被破壞，其膜通透性已改變，故染劑會進入細胞中，使細胞被染色。若經 Trypan blue 染色後細胞呈藍色為死細胞，而不被染色的細胞為活細胞。. 2.實驗步驟：在 12 well culture plate 中種 2×105 cells/mL(共 1mL)的 HL-60，再加入不同濃度的香椿萃取液(0、10、25、50、75μg/mL、75μg/mL+10 U Catalase)，放置於 37℃培養箱反應 6 hr。時間到時，由 12 well culture plate 中取出 100μL 再加入 100μL 的 0.4% Trypan blue 溶液，混合均勻後，以血球計數器計數細胞數目【129】。. 四、以倒立式位相差顯微鏡觀察細胞型態(Morphology) 實驗步驟：培養細胞2×105 cells/mL(共1mL)於12 well culture plate中，再加入不同濃度的香椿萃取液(0、10、25、50、75μg/mL、75μg/mL+10 U Catalase)，放置於37℃培養箱反應6 hr，以倒立式位相差顯微鏡(phase microscope)觀察細胞型態。. 五、利用流式細胞儀(Flow cytometry)探討香椿萃取液對 HL-60 細胞週期之影響 1.原理：當一個細胞複製完成自己的 DNA，分裂成二個. 細胞，整個過. 程稱為細胞週期。細胞週期分為四個不同時期，G1 phase、G2 phase 、 33.

(46) S phase、M phase。G1 phase，是細胞生長的時期，此時細胞代謝活化，複製所需胞器以及一些細胞質的組成，以供下一階段複製染色體使用；而 S phase 是 DNA 複製的時期，也就是染色體複製；G2 phase 繼續生長，並且合成酵素和蛋白質， G1 、 S 、 G2 又合稱間期 (Interphase)；而 M phase，是有絲分裂期。可以利用細胞中 DNA 的含量來決定週期，利用螢光物質標示 DNA 再利用 FACS (fluorescence-activator cell sorter)分析 DNA 含量，這種方法稱為 flow cytometry。G2 期 DNA 含量為 G1 期的兩倍，而 S 期的 DNA 含量則居於兩者之間. 圖五、流式細胞儀分析出來標準細胞週期圖. 2.實驗步驟：將2×105 HL-60細胞種於6 cm dish，給予不同濃度的香椿萃取液 (0、10、25、50、75 μg/mL、75 μg/mL+10 U Catalase)培養6個小時，及給予50 μg/mL香椿萃取液培養於不同時間(0、3、6、12、18h)，置於37℃ 5% CO2培養箱反應。等待培養時間到之後，收集懸浮細胞， PBS洗滌2次，利用4 ℃70% 的酒精固定細胞形態，-20 ℃冰箱隔夜存 34.

(47) 放。隔天，將細胞懸浮液以1200 rpm、5分鐘離心去除酒精上清液，再以PBS清洗兩次之後，將細胞徹底打散，加入500 μL的PI stain染劑，避光30分鐘之後轉移到FACS專用小管，進行流式細胞計數儀檢測，以一秒細胞數不超過300顆細胞，每個數據收集10000顆細胞，數據以Modfit LT®軟體進行處理分析。每個實驗組皆以三重複增加實驗的準確度【59】。. PI stain 染劑的配製：組成 Propidium. 最初濃度 iodide 100μg/mL. 最終濃度. 體積(mL). 4μg/mL. 1.2 mL. (PI) TritonX-100. 10%. 1%. 3 mL. RNase A. 100 mg/mL. 0.5 mg/mL. 0.15 mL. PBS. 25.65 mL. 總體積. 30 mL. 六、利用流式細胞儀探討香椿萃取液對HL-60細胞 sub G1 phase的分布情形實驗步驟：將2×105 HL-60細胞種於6 cm dish，給予不同濃度的香椿萃取液 (0、10、25、50、75 μg/mL、75 μg/mL+10 U Catalase)培養6個小時，置於37℃ 5% CO2培養箱反應。等待培養時間到之後，收集懸浮細胞，PBS洗滌2次，利用4 ℃70% 的酒精固定細胞形態，-20 ℃冰箱隔夜存放。隔天，將細胞懸浮液以1200 rpm、5分鐘離心去除酒精上清液，再以PBS清洗兩次之後，將細胞徹底打散，加入500 μL的PI stain 染劑，避光30分鐘之後轉移到FACS專用小管，進行流式細胞計數儀 35.

(48) 檢測，以一秒細胞數不超過300顆細胞，每個數據收集10000顆細胞，數據以Modfit LT®軟體進行處理分析。每個實驗組皆以三重複增加實驗的準確度。. 七、粒線體膜電位△Ψm的分析 1.原理：在細胞凋亡過程中粒腺體膜電位會耗散，主要是由於多個蛋白質組成的通透性轉變孔道(PT孔道)打開，使得粒腺體內膜發生通透性改變，造成粒線體內膜H+ 梯度下降。利用親脂性染劑DiOC6 (3,3,Dihexyloxacarbocyanine iodide) 作為粒線體膜電位的探針。DiOC6可以穿透細胞膜並且與粒線體基質結合，藉由發散出的螢光強度不同來偵測出粒線體膜電位的改變。. 2.實驗步驟：將2×105 HL-60細胞種於6 cm dish，以濃度75 μg/mL的香椿萃取液，分別培養0、2、4、6小時後，收集懸浮細胞，PBS洗滌2次，加入500 μL的100 μM DiOC6於試管中，要全程避光，培養於37℃培養箱中30分鐘，再移至FACS管，再以流式細胞計數儀偵測【62】。. 八、活性氧化物測定(Reactive oxygen species) 1.原理：利用2,7- dichlorofluorescein diacetate(H2DCF-DA)的螢光特性對細胞進行染色，以分析細胞內ROS的生成量。H2DCF-DA是一種脂溶性染劑，可以通透細胞膜，本身具有螢光，進入細胞後會被細胞內的 36.

(49) 乙醯脂酶(esterases)去乙醯化形成非螢光性的DCFH，接著會被H2O2 氧化成具螢光性的DCF，以此特性，去評估細胞內H2O2的濃度變化。. 2.實驗步驟：將2×105 HL-60細胞種於6 cm dish，以濃度75 μg/mL的香椿萃取液，分別培養0、0.5、1、1.5、2小時後，收集懸浮細胞，PBS洗滌2 次，加入500 μL的10 mΜ H2DCF-DA於試管中，要全程避光，培養於 37℃培養箱中30分鐘，再移至FACS管，再以流式細胞計數儀偵測【62】。. 九、西方墨點法(Western blotting)分析細胞蛋白質的表現 1.原理：細胞有許多不同種類的蛋白質，不易直接測得特定蛋白質的含量，因此利用此法以特定的抗體找出特定的蛋白質，判斷其含量的相對多寡。由於抗體和抗原能專一性結合，所以可利用此特性標定特定的蛋白質，稱為免疫標定法。先加入能和欲標定蛋白質抗原位置結合的專一性抗體(一級抗體；Primary antibody)，充分反應後，再加入能和一級抗體上之抗原位置結合的另一專一性抗體(二級抗體； Secondary antibody)，兩次抗體結合後，使抓取目標蛋白質的作用更精準，且二級抗體上結合了酵素，可以分解特定之基質(Substrate)而呈色，可供測量含量時使用。. 2.試劑： (1)Antibody & lysis buffer： (a) Primary antibody：β-actin、caspase 8、Fas、Fas-L、Bid、caspase 9、Cyclin D1、CDK4、Cyclin E、CDK2、Cyclin A、Cyclin B、 37.

(50) CDC2、Rb、P-Rb、P15、P27、P21、SOD、Catalase。 (b)Second step antibody conjugates (2 級)：Alkaline Phosphate Goat anti-Mouse IgG、Alkaline Phosphate Goat anti-Rabbit IgG、 Alkaline Phosphate Goat anti-Sheep。 (c)Triton lysis Buffer：25 mM Tris-HCl (pH=8) 及 1% Triton X-100 (取 0.197 g Tris 加到 30 ml 無菌水調至 pH=8)，再加入 500 μl Trition X-100 最後用二次水定量至 50 ml。 (2)製備膠體電泳 (SDS-PAGE)： (a)1.5 M Tris (pH=8.8)：取 91g Tris base 溶在 300 ml 二次水，以 1N HCl 調至 pH=8.8，後用二次水量定量至 500 ml 用 0.45μm filter 過濾，4 ℃儲存 1 個月。 (b) 30% Acrylamide/Bis solution (29:1) (c)10% SDS：取 10g SDS，最後用二次水定量到 100 ml。 (d)Ammonium persulfate：取 0.1g (NH4)S2O8 溶於 1 ml 二次水。 (e)1M Tris (pH=6.8)：取 12.1g Tris base 溶在 40 ml 二次水，以 1N HCl 調至 pH=6.8，最後用二次水定量到 100 ml，用 0.45 μm filter 過濾，4 ℃儲存 1 個月。 (f)3×Protein loading dye 配方：5 mM Tris-HCl (pH=6.8)、2% SDS、10% glycerol、0.1% bromopherol blue、100 mM dithreitol 或 5% α-ME (使用前加入) (g)5×electrode buffe (pH=8.4)：取 54.5 g Tris base、24.8 g Boric acid、4.7 g EDTA2Na、5g SDS，最後用二次水定量至 1000 ml。 (3)西方點墨法 (Western blotting)： (a)Transfer buffer (3 升)：取 18.2 g Tris base、86.5 g Glycine、1200 ml methanol 最後用二次水定量至 3 升。. 38.

(51) (b)Coomassies Brilliant Blue R250 (染色液)：取 1 g Coomassie Brilliant Blue 加入 70 ml acetic acid 及 250 ml methanol 用水定量至 500 ml。 (c)Gel destain solution：取 210 ml Acetric acid、300 ml Methanol 用水定量至 3000 ml。 (d)1×PBS：取水 800 ml 二次水，加入 8 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、2.9 g Na2HPO4.12H2O，調 pH 7.4，並定量至 1000 ml。 (e)PBST：500 ml PBS 再加入 500 μl Tween-20。 (f)Block buffer：取 5% 脫脂奶粉溶於 PBST。 (g)顯影劑：取 103 ml developer 加入 370 ml 二次水，稀釋成 4.59 倍，放入避光的瓶子。 (h)定影劑：取 103 ml fixter 加入 370 ml 二次水，稀釋成 4.59 倍，放入避光的盒子。 (i)SuperSignal substrate solution：將 SuperSignal I：SuperSignal II ＝1：1 混合。(每次使用皆現配) 4)實驗步驟： A. 細胞溶解萃取(Cell lysis extraction)： (a)將 TSL-1 加入含 2×105 cells/ml HL-60 的 10 cm dish 中，置於培養箱反應，反應結束後收集培養液於離心管中，離心 1200 rpm，5 分鐘，去上清液。 (b)PBS 清洗一次，離心 1200 rpm，5 分鐘，去上清液。 (c)以 3000 rpm 離心 10 分鐘，4 ℃，抽掉上清液。 (d)加入適量 lysis buffer 充分混合。 (e)再將其強烈振盪以溶解 pellet。 (f)將樣品放在冰上反應 20 分鐘。. 39.

(52) (g)然後以離心機，使用 12,000 rpm 離心 30 分鐘。 (h)收集上清液即為核萃取物。 (i)以 Bio-rad 定量其蛋白濃度，保存在-20 ℃冰箱備用。 B. 蛋白質濃度定量分析(Protein concentration assay)：本定量法採用 Bio-rad 公司 Protein assay-micro assay 之做法。 (a)以二次水將牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin；BSA，0.1 mg/mL)分別配製成 0、2、4、6、8、10 μg /ml 之標準溶液。 (b)再加入 200 μl Protein assay dye (BIO-RAD)，振盪均勻靜置 5 分鐘。 (c)放入分光光度計讀取波長 595 nm 的吸光值，由在 595 nm 的吸光值，作成標準線，分析最佳標準迴歸直線，求出此線的方程式(當此直線的迴歸分析結果之 R2＞0.98 時，此直線方程式的值始可信)。 (d)將樣品取 2 μl 的待測蛋白質溶液加入 798 μl 二次蒸餾水，再加入 200 μl Protein assay dye，均勻混合後，室溫下反應 5 分鐘後，測吸光值再以樣品所測得 OD 值之結果，帶入方程式即可求得蛋白質濃度。 C. 蛋白質膠體電泳 (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE) (a)鑄膠：膠體的配製依訊號蛋白質分子量的大小而決定配製成 10 %或 12%的 SDS-PAGE。 (b)分離膠體溶液 (Running gel；總體積 20 ml)： a. 8% SDS-PAGE：加 15 ml H2O，5 mL 1.5M Tris (pH=8.8)，7 mL 30% Acrylamide Mix，0.2 mL 10% SDS，0.2 mL 10% ammonium persulfate 及 0.01 mL TEMED。. 40.

(53) b. 10% SDS-PAGE：加 8 ml H2O，5 mL 1.5M Tris (pH=8.8)，6.6 Ml 30% Acrylamide Mix，0.2 mL 10% SDS，0.2 mL 10% ammonium persulfate 及 0.01 mL TEMED。 c. 12% SDS-PAGE：加 6.6 mL H2O，5 mL 1.5M Tris (pH=8.8)， 8.0 mL 之 30% Acrylamide Mix，0.2 mL 之 10% SDS，0.2 mL 之 10% ammonium persulfate 及 0.01 mL TEMED。 (c)集離膠體溶液 (5% Stacking gel；總體積 5 mL)：加入 3.5 mL H2O，0.625 mL 之 1.5 M Tris (pH=6.8)，0.825 mL 之 30% Acrylamide Mix，0.05 mL 之 10% SDS，0.05 mL 之 10% ammonium persulfate 及 0.05 mL 之 TEMED。 (d)樣品前處理：取 50 μg 之蛋白質量於離心管，以 Sample buffer 補齊不足量的體積，使每個反應管的體積皆為相同，同時加入 3 倍 Protein loading buffer (此為樣品 1/3 倍的體積)，混合均勻後，以 97 ℃加熱 5 分鐘後，以便將蛋白質樣本變性 (Denature)，立即放回冰靜置 5 分鐘，Speed down 後，再用含有 SDS 之 8%、 10% 或 12% Acrylamide gel (視蛋白質分子量大小而定)，以電泳方式將蛋白質分離。 (e)電泳：將鑄好的 SDS-PAGE 組合放入電泳槽內，注入 1×Electrode buffer 至 well 內，此時 well 內都充滿 1×Electrode buffer，分別將標準品以確定蛋白質之分子量及 Sample 小心加入，以固定於垂直電泳槽內的 Stacking gel 的 well 內，以避免 Sample 溢出，先以 80 伏特電壓跑 5% Stacking gel，20 分鐘，再慢慢調整電壓至 200 伏特，約跑 5-6 小時，再進行蛋白質轉移。 (f)蛋白質轉移(Transfer protein to PVDF membrane)：先將 PVDF membrane 及 3M paper 裁剪與膠片大小相同。於 PVDF membrane. 41.

(54) 標記上膠片之蛋白質 Marker 的位置，方便偵測蛋白質訊號時比對分子量大小位置。將轉漬夾打開後黑色面朝下放，取出一片海綿墊片浸泡 Transfer buffer 後放於其上面，並依序在海綿片上放上 3 MM paper、SDS-PAGE gel、PVDF membrane (先用 100%甲醇濕潤 5 秒、再放於 transfer buffer 中浸潤)、3 MM paper，最後再放上一片海棉墊片後夾上轉漬夾(如圖)，並使用玻棒壓一壓以去除氣泡(夾層中間切勿有氣泡)，放入濕式 transfer machine 中並將 transfer buffer 倒入電泳槽中，置於 4 ℃冰箱，以 35 伏特的電流轉印 14 小時(由負極到正極)，使蛋白質轉印到 PVDF 上。轉印後，將 gel 取出，浸在 0.05% Commassin Brilliant Blue R250 染色 20 分鐘，再浸在 destain solution 中脫色，觀察是否 transfer 完全； PVDF 則進行西方點墨法。. （＋）. 白海棉墊片 3M paper PVDF 膜膠 3M paper 海棉墊片. 黑（－）. 42.

(55) (g)西方點墨法 (Western blotting)：將 PVDF 用 PBS 清洗一下，並以 Blocking solution(2％)振盪 15 min，再以 Blocking solution(2％) 作為溶劑分別將欲測之一次抗體 (β-actin、caspase 8、Fas、Fas-L、 Bid、caspase 9、Cyclin D1、CDK4、Cyclin E、CDK2、Cyclin A、 Cyclin B、CDC2、Rb、P-Rb、P15、P27、P21、SOD、Catalase) 稀釋至適當的濃度，加到 PVDF membrane 使其均勻的覆蓋於 Membrane 上，並置於水平式旋轉器上室溫振盪 2 小時，此時蛋白為接上一級抗體。先用 PBS 清洗一次，再用 PBST 洗三次，每次 10 分鐘轉速為 100 rpm。再以 Blocking solution(5％)作為溶劑加入二次抗體稀釋至適當的濃度，加到 PVDF membrane 使其均勻的覆蓋於 Membrane 上，並置於水平式旋轉器上室溫振盪 2 小時，先以 PBS 清洗一次，再用 PBST 洗三次，每次 10 分鐘轉速為 100 rpm，以清洗未結合上的二次抗體，同時也可以低背景值。將 PVDF membrane 加入 SuperSignal 振盪 1 分鐘，去除多餘的水份，將 PVDF membrane 用保鮮膜包起來，感光夾內依序放 PVDF membrane、感光底片進行壓片(依訊息的強弱調整壓車時間的長短)，將底片依序放入顯影劑、水、定影劑，最後再至入水中清洗淨。利用此法檢視細胞內各個蛋白的變化【23】。. 43.

(56) 十、實驗統計實驗結果數據皆以平均值 ± 標準差(Mean ± SD)表示(n=3~4)。動物實驗結果數據皆以平均值 ± 標準偏差(Mean ± SE)表示(n=6)。SPSS 系統進行變異性分析 (ANOVA)，並以 Duncan’s multiple range test 做組間差異比較。P＜0.05 代表有顯著性差異。. 44.

(57) 第二部分：探討香椿成分 TSL-1 在活體動物抗癌作用。一、人類急性骨髓血癌細胞(HL-60)培養 1.試劑：（2） RPMI-1640(1 升)： RPMI-1640 (9.5 g) 粉狀培養基溶於 900 mL 的二次水中，加入 2 g NaHCO3，一起混合均勻，溶解後調 PH 值至 7. 4，最後體積定量至 1 升。利用 pump 通過孔徑 0. 22 μM 的無菌過濾謨過濾，再加入 1％抗生素(PS；penicillin-streptomycin)，混合後保存於 4℃。 (2)0.4％ Trypan blue：取 0.04g Trypan blue 溶於 10 mL 1X PBS 中，通過孔徑 0.45μM 的濾膜，濾除雜質，室溫保存。 2.細胞株來源及培養條件：將人類血癌細胞株(HL-60)培養於 RPMI-1640 培養液中(含 10％ foetal bovine serum 、 2 mM L-glutamine 、 1% penicillinstreptomycin)，置於 37℃、5% CO2 的培養箱中培養。 3.繼代培養(secondary culture)：平常使細胞密度維持在 2～5×105 cells/mL。繼代培養時，將培養液收集至離心管中，離心 1200 rpm，5 分鐘，吸掉上清液，在將細胞打散加入新鮮培養液培養。 4.解凍細胞：自液態氮桶將HL-60細胞取出後，立即移置於37 ℃水浴槽中，在 30 秒內急速解凍，再將細胞冷凍保存液 (Cell culture freezing medium-DMSO)吸到已加好培養液無菌離心管內稀釋，經離心，去除 45.

(58) 上清液，再加入培養液，將細胞均勻打散後，移到培養瓶(T75 Flask)，於含5% CO2的37℃培養箱中生長，並且需定期更換培養液。 5.冷凍細胞：將生長狀態良好的細胞自培養瓶移至50 mL 離心管，1200 rpm， 5分鐘，吸掉上清液，再加入freezing medium(5% DMSO和95% FBS) 充分混合後，置於入2 mL冷凍小管內，此時每個冷凍小管的細胞密度為1～5×106 cells/mL。先將內含有細胞freezing medium的冷凍小管放在4 ℃ 15分鐘，再移至- 20 ℃ 15分鐘，之後移到- 80 ℃ overnight，最後放入液態氮中保存。 6. 細胞計數(Cell count)：先將細胞培養液吸至50 mL離心管，離心1200 rpm 5分鐘，倒去上清液後，加入細胞培養液將細胞打散，最後再取適量體積與trypan blue 做均勻混合後(含有細胞的培養液：trypan blue = 1：1)，吸至細胞計數盤(counting chamber / Hamacytometer)，在顯微鏡下計數。. 二、實驗動物：本研究將用BALB/c-nu nude mice (6～8 weeks old) 裸鼠(雄性9 隻；雌性9隻)，購自台灣醣聯生技醫藥股份有限公司，將它們飼養之溫度維持在25±2℃、相對濕度在65±5%，為一無塵自動控制室。並以自動定時器控制光照週期，06:00~18:00屬於光照期(light period)， 18:00~06:00屬於黑暗期(dark period)。飼養於乾淨之鼠籠中並以乾淨的鼠糧與水餵食。實驗進行之前動物先經7天之適應期。. 三、裸鼠異位移植腫瘤 (nude mice xenograft tumor model)模式：待HL-60細胞生長狀態良好時，將細胞培養液吸至50 mL離心管，離心1200 rpm 5分鐘，倒去上清液後，加入細胞培養液將細胞打 46.

(59) 散，最後再取適量體積與trypan blue 做均勻混合後(含有細胞的培養液： trypan blue = 1 ： 1) ，吸至細胞計數盤 (counting chamber / Hamacytometer)，在顯微鏡下計數。最後將HL-60細胞(106/隻)以皮下注射的方式將HL-60細胞植入裸鼠背部右側，每天觀察腫瘤生長情形，約需一週腫瘤體積生長即開始隨機分組。腫瘤誘發期間每週兩次會測量老鼠的體重及腫瘤體積大小變化並紀錄。腫瘤體積以(長徑×短徑2)/2求得【16】。. 四、給藥之方式：每組六隻裸鼠(雄性3隻；雌性3隻)，採用腹腔注射，每週注射三次。劑量範圍給予：第一組高劑量組(10 mg/kg)；第二組低劑量組(7.5 mg/kg)；第三組控制組(PBS給予)。. 五、活體觀察：每天觀察動物的生長情形。每週記錄三次觀察腫瘤的生長狀況，利用遊標卡尺測量腫瘤的體積大小。實驗開始前，測量動物體重一次，之後期間每週測量三次。. 六、組織包埋和切片： 1.材料： Maxwell’s Embedding Wax (邁克斯威爾氏包埋石臘)：Paraffin 100 g + Hance’s Rubber 母液 4 g + Bayberry Wax 7 g + 蜂臘 1 g。. 2.方法：組織放入 10% 的福馬林固定後，利用石蠟包埋。. 47.

(60) a.包埋 (1)選取適當的金屬製底模，注入石蠟。 (2)夾取組織埋入石蠟。 (3)以包埋匣底部壓蓋組織片，再注入石蠟。 (4)放在室溫下，使它冷卻數分鐘，石蠟組織塊可輕易自底模剝離。. b. 切片 (1)剃除組織塊周圍多餘的蠟(粗切)。 (2)將蠟塊置於切片機上固定，調整切片厚度 (5 μm)。 (3)進行切片，邊以針頭協助調整切片。 (4)切完後將組織片放入溫水中伸展。 (5)數分鐘後，用載玻片將組織片撈起，並放置 37 ℃ 烘箱 1 天備用。. 七、病理 H&E 染色法： 1.材料：二甲苯 (xylene) 100% 酒精 95% 酒精 80% 酒精 70% 酒精 a.Hematoxylin solution 之配製銨礬或鉀礬(Ammonium or potassium aluminum sulfate). 50 g. hematoxylin crystals. 1g 48.

(61) 碘酸鈉(sodium iodate). 0.2 g. 檸檬酸(citric acid). 1g. 水化氯醛(chloral hydrate). 50 g 1000 mL. 蒸餾水 b.Eosin solution 之配製 Eosin Y. 1g. 95%酒精. 300 mL 1000 mL. 蒸餾水. 2.方法：將玻片放於Xylene中脫蠟3次、每次2分鐘，再依序置放在100% 酒精中2次，每次作用10秒、 95% 酒精中10秒、80% 酒精中10秒、 70%酒精中10秒的水化流程，再用蒸餾水洗20秒，之後用Hematoxylin solution染30至50秒，再浸在0.1% 醋酸水中作用20秒，用流水洗7分鐘，再用Eosin染1分40 秒，然後進行脫水的流程，依序置放在80% 酒精中30秒、95% 酒精中30秒、95% 酒精中20秒、100%酒精中20 秒、100%酒精中30 秒，最後再用Xylenee共澄清3次，前2次每次20 秒，然後1次1分鐘，並以Histoclad封片【130】。. 49.

(62) 第六章實驗結果與圖表. 50.

(63) 第一部分：探討香椿成分TSL-1對人類急性前骨髓血癌細胞株(HL-60) 的抑癌影響。. 51.

(64) 第一節香椿萃取液(TSL-1)在HL-60細胞株對細胞存活的影響與細胞型態上的改變情形. 加入不同濃度的香椿萃取液(10、25、50、75μg/mL)作用於HL-60 (2×105cells/mL)中，於6小時的時間點觀察 HL-60 生長的情形。在6 小時中發現，相對於未經香椿萃取液處理之控制組，隨著香椿萃取液劑量的增加，HL-60 細胞存活率有明顯的下降趨勢，而在高濃度 (75μg/mL)下，此結果更是顯著，其存活率就只剩下25％，呈現劑量效應關係。也發現在高濃度(75μg/mL)的香椿萃取液加入 Catalase (10 U)之後，存活率就沒下降與控制組的存活率一樣。因此，香椿萃取液對 HL-60 具有細胞毒性，會抑制 HL-60 的生長(圖六)。而利用流式細胞儀 (flow cytometry) 評估細胞凋亡情形，結果發現加入不同濃度的香椿萃取液之後，細胞凋亡的百分比隨著濃度的上升而增加，分別是0%、20%、34%、63% (圖七)。利用倒立式相位差顯微鏡觀察細胞的型態，加入不同濃度的香椿萃取液處理6小時後，發現細胞數目有明顯下降的情形，且有細胞型態不完整、細胞膜皺縮、與空泡化的現象。而高濃度(75μg/mL)的香椿萃取液加入 Catalase(10 U)之後，顯微鏡觀察細胞的型態及數目與控制組一致(圖八)。. 52.

(65) 120. Cell Viability (% of control). IC50：50 μg/mL. #. 100. 80. *. *. 60. *. 40. 20. 0. TSL： Catalase：. 0. 10. 25. 50. 75. 75 (μg/mL). －. －. －. －. －. 10. (U). ＃圖六、以不同濃度的香椿萃取液處理HL-60細胞株6小時後細胞存活. 率的影響。數據結果以mean ± SD 値表示，n=3。* p< 0.05 v.s. ＃. control； p< 0.05 v.s. 75 μg/mL。. 53.

(66) (A) Control. (B) 10 μg/mL 1000. Debris Aggregates Apoptosis Dip G1 Dip G2 Dip S. 400. 0 ％. 0. 0. 200. 200. 400. 0 ％. 600. Number. Number. 600. 800. 800. Debris Aggregates Apoptosis Dip G1 Dip G2 Dip S. 0. 0. 20. 40. 60. 80. 100. 20. 40. 60. (D) 50 μg/mL 2400. A. 34 ％ 600. A. 1800. Number. Number. T T. 300. 120. Debris Aggregates Apoptosis Dip G1 Dip G2 Dip S. A. 900. 1200. Debris Aggregates Apoptosis Dip G1 Dip G2 Dip S. 20 ％. 600. 100. 1200. (C) 25 μg/mL. 80. Channels (PE-A). 120. Channels (PE-A). 0. 0. A C. 0. 20. 40. 60. 80. 100. 120. 0. 20. 40. Channels (PE-A). 60. 80. 100. Channels (PE-A). (E) 75 μg/mL. (E) 75 μg/mL + Catalase Debris Aggregates Apoptosis Dip G1 Dip G2 Dip S. 600. Number 400. 800. 63 ％. 0 ％. 0. 0. 200. 400. Number. 1200. 800. 1600. Debris Aggregates Apoptosis Dip G1 Dip G2 Dip S. 0. 20. 40. 60. 80. 0. 100. 20. 40. 60. 80. 100. 120. Channels (PE-A). Channels (PE-A). 圖七、利用流式細胞計數儀評估不同濃度的香椿萃取液處理HL-60細胞株6小時後細胞凋亡的情形。. 54.

(67) (A)Control. (D)50 (μg/mL). (B)10 (μg/mL). (E)75 (μg/mL). (C)25 (μg/mL). (F)75 (μg/mL) + 10 U Catalase. (200X) 圖八、不同濃度的香椿萃取液處理HL-60細胞株6小時後細胞型態的變化。放大倍率200 X。. 55.