第八章、 參考文獻
第五節 利用西方墨點法(Western blotting)探討樟芝發酵液
以西方墨點法分析，樟芝發酵液(AC-10)對HL-60細胞內的細胞週 期相關蛋白質的影響。先前的實驗結果顯示，樟芝發酵液(AC-10)造 成參與調控細胞週期中G0/G1期的停止，為探究其機制接著偵測參與 調控細胞週期相關的G0/G1 期的蛋白有CDKs：CDK2與CDK4；
Cyclins：Cyclin D1/2、Cyclin E、Cyclin A、Cyclin B；CDKIs：p15、
p27和p21的蛋白表現量。以β-actin當作internal control。分別以不同濃 度的樟芝發酵液(AC-10)處理HL-60細胞24小時，和以60 μg/mL的樟芝 發酵液(AC-10)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變化，結果發 現隨著濃度上升與時間的延長，CDK4蛋白表現量下降，CDK2蛋白 表現量下降，Cyclin D1/2蛋白表現量下降，Cyclin E蛋白表現量下降，
Cyclin A蛋白表現量下降，p15蛋白表現量上升，p21蛋白表現量上升，
p27蛋白表現量下降，Cyclin B蛋白表現量和Cdc2蛋白表現量並無改 變(圖三十七、圖三十八、圖三十九、圖四十)。而Rb和p-Rb蛋白表現 量隨著濃度上升與時間的延長下降(圖四十一、圖四十二)。
(A) (B)
圖三十七、利用西方點墨法觀察G0/G1 phase中的Cyclin D1、CDK4、
Cyclin E、CDK2、cyclin A、cyclin B1、Cdc2的蛋白表現量。
以β-actin為internal control。(A)分別以不同濃度的樟芝發酵 液(AC-10)處理HL-60細胞24小時；(B)以濃度60 μg/mL的樟 芝發酵液(AC-10)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變 化。
AC 0 20 40 60 80 （μg/mL） 0 4 8 12 18 24 （h）
Cyclin D1 36 kDa
CDK4 Cyclin E
Cyclin A
30 kDa 50 kDa
CDK2
55 kDa 55 kDa Cyclin B1
34 kDa Cdc 2
46 kDa β-actin
35 kDa
(A) (B)
Cyclin D1
Concentration (mg/mL)
0.0 12.5 25.0 37.5 50.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
CDK2
Concentration (μg/mL)
0.0 12.5 25.0 37.5 50.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
CDC 2
Concentration (μg/mL)
0.0 12.5 25.0 37.5 50.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
圖三十八、利用西方點墨法觀察G0/G1 phase中的Cyclin D1、CDK4、
Cyclin E、CDK2、cyclin A、cyclin B1、Cdc2的蛋白表現 量變化的量化圖。以β-actin為internal control。(A)分別以
(A) (B)
圖三十九、利用西方點墨法觀察G0/G1 phase中的p15、p21、p27的 蛋白表現量。以β-actin為internal control。(A)分別以不 同濃度的樟芝發酵液(AC-10)處理HL-60細胞24小時；(B) 以濃度60 μg/mL的樟芝發酵液(AC-10)處理細胞不同時間 後，觀察蛋白表現量變化。
AC 0 20 40 60 80 （μg/mL） 0 4 8 12 18 24 （h）
p15
β-actin
15 kDa
46 kDa P27
P21
27 kDa 21 kDa
(A) (B)
p15
Concentration (μg/mL)
0.0 12.5 25.0 37.5 50.0
Protein Level (fold)
0
Protein Level (fold)
0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
白表現量變化的量化圖。以β-actin為internal control。(A) 分別以不同濃度的樟芝發酵液(AC-10)處理HL-60細胞24小 時；(B)以濃度60 μg/mL的樟芝發酵液(AC-10)處理細胞不同 時間後，觀察蛋白表現量變化。數據結果以Mean ± SD 値表 示，n=3，* p< 0.05。
(A) (B)
圖四十一、利用西方點墨法觀察G0/G1 phase中的Rb、p-Rb的蛋白表 現量。以β-actin為internal control。(A)分別以不同濃度的 樟芝發酵液(AC-10)處理HL-60細胞24小時；(B)以濃度60 μg/mL的樟芝發酵液(AC-10)處理細胞不同時間後，觀察蛋 白表現量變化。
AC 0 20 40 60 80 （μg/mL） 0 4 8 12 18 24 （h）
Rb
p-Rb β-actin
110 kDa
110 kDa 46 kDa
(A) (B)
Rb
Concentration (μg/mL)
0.0 12.5 25.0 37.5 50.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0 以不同濃度的樟芝發酵液(AC-10)處理HL-60細胞24 小 時；(B)以濃度60 μg/mL的樟芝發酵液(AC-10)處理細胞不同 時間後，觀察蛋白表現量變化。數據結果以Mean ± SD 値
第六節 利用西方墨點法(Western blotting)探討樟芝發酵液(AC-10)對 Casapse-9 蛋白表現量的改變
以西方墨點法分析樟芝發酵液(AC-10)對HL-60細胞內的caspase 蛋白的影響。與計畫性死亡相關的caspase-9。分別以不同濃度的樟芝 發酵液(AC-10)處理HL-60細胞24小時，和以60 μg/mL的樟芝發酵液 (AC-10)處理細胞不同時間後，觀察caspase-9 蛋白表現量變化。結果 發現caspase-9 隨著濃度上升與時間延長而增加(圖四十三)。
(A) (B)
圖四十三、利用西方點墨法觀察有關計畫性死亡路徑中的caspase-9 的蛋白表現量。(A)分別以不同濃度的樟芝發酵液(AC-10) 處理HL-60細胞24小時；(B)以濃度60 μg/mL的樟芝發酵液 (AC-10)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變化。
AC 0 20 40 60 80 （μg/mL） 0 4 8 12 18 24 （h）
47kDa 37kDa 23kDa
Caspase 9
第七節 利用西方墨點法(Western blotting)探討樟芝發酵液(AC-10)對 死亡受器路徑中調控蛋白質表現量的影響
以西方墨點法分析，樟芝發酵液(AC-10)對死亡受器路徑中調控 蛋白質表現的影響。調控死亡受器路徑的蛋白質，包括FAS、FAS Ligand、Caspase-8 及Bid。以β-actin當作internal control。分別以不同 濃度的樟芝發酵液(AC-10)處理HL-60細胞24小時，和以60 μg/mL的樟 芝發酵液(AC-10)處理細胞不同時間後，觀察FAS、FAS Ligand、
Caspase-8 及Bid。結果發現FAS、FAS Ligand 隨著濃度上升與時間 延長而增加(圖四十四、圖四十五)。Caspase-8及Bid 隨著濃度上升與 時間延長而斷裂活化(圖四十六、圖四十七)。
(A) (B)
圖四十四、利用西方點墨法觀察死亡受器路徑中的FAS Ligand、FAS 的蛋白表現量。(A)分別以不同濃度的樟芝發酵液(AC-10) 處理HL-60細胞24小時；(B)以濃度60 μg/mL的樟芝發酵液 (AC-10))處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變化。
AC 0 20 40 60 80 （μg/mL） 0 4 8 12 18 24 （h）
FAS
FAS-L 26~40 kDa
48 kDa
(A) (B)
FAS-L
Concentration (μg/mL)
0.0 12.5 25.0 37.5 50.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0
Protein Level (fold)
0
(A) (B)
圖四十六、利用西方點墨法觀察死亡受器路徑中的 caspase-8、Bid 的蛋白表現量。(A)分別以不同濃度的樟芝發酵液(AC-10) 處理HL-60 細胞 24 小時；(B)以濃度 60 μg/mL 的樟芝發 酵液(AC-10)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變化。
AC 0 20 40 60 80 （μg/mL） 0 4 8 12 18 24 （h）
55 kDa
41 kDa
25 kDa Caspase 8
Bid 22 kDa
(A)
Bid
Concentration (μg/mL)
0.0 12.5 25.0 37.5 50.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
處理HL-60細胞24小時；(B)以濃度60 μg/mL 的樟芝發酵液 (AC-10)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變化。數據 結果以Mean ± SD 値表示，n=3，* p< 0.05。
第八節 利用西方墨點法(Western blotting)探討樟芝發酵液(AC-10)對 SOD 及 Catalase 蛋白質表現量的影響
以西方墨點法分析，樟芝發酵液(AC-10)對 SOD 及 Catalase 蛋白 質表現的影響。以β-actin 當作 internal control。分別以不同濃度的樟 芝發酵液(AC-10)處理 HL-60 細胞 24 小時後，觀察 SOD 及 Catalase。
結果發現 SOD 及 Catalase 隨著濃度上升而增加(圖四十八、圖四十 九)。由結果發現這些抗氧化酵素隨著樟芝發酵液作用的濃度增加而 表現量有明顯的增加，與香椿結果不一樣。推測可能是樟芝發酵液 (AC-10)增加細胞內的抗氧化酵素，尤其是 SOD 表現量，由於 SOD 量增加引起 H2O2產生增多，雖然 Catalase 量也增加，但不及去清除 大量的H2O2，進而造成細胞凋亡。