第五章、 實驗結果與圖表
第五節 利用西方墨點法(Western blotting)探討香椿萃取液
以西方墨點法分析，香椿萃取液(TSL-1)對HL-60細胞內的細胞週 期相關蛋白質的影響。先前的實驗結果顯示，香椿萃取液(TSL-1)造 成參與調控細胞週期中G0/G1期的停止，為探究其機制接著偵測參與 調控細胞週期相關的G0/G1 期的蛋白有CDKs：CDK 2與CDK 4；
Cyclins：Cyclin D1/2、Cyclin E、Cyclin A、Cyclin B；CDKIs：p15、
p27和p21的蛋白表現量。以β-actin當作internal control。分別以不同濃 度的香椿萃取液(TSL-1)處理HL-60細胞6小時，和以75 μg/mL的香椿 萃取液(TSL-1)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變化，結果發 現隨著濃度上升與時間的延長，CDK 4蛋白表現量下降，CDK 2蛋白 表現量下降，Cyclin D1/2蛋白表現量下降，Cyclin E蛋白表現量下降，
Cyclin A蛋白表現量下降，p15蛋白表現量上升，p27蛋白表現量上升，
p21的蛋白表現量下降，Cyclin B蛋白表現量和CDC2蛋白表現量並無 改變(圖十四、圖十五、圖十六、圖十七)。而Rb和p-Rb蛋白表現量隨 著濃度上升與時間的延長下降(圖十八、圖十九)。
(A) (B)
圖十四、利用西方點墨法觀察G0/G1 phase中的Cyclin D1、CDK4、
Cyclin E、CDK2、cyclin A、cyclin B1、Cdc2的蛋白表現量。
以β-actin為internal control。(A)分別以不同濃度的香椿萃取 液(TSL-1)處理HL-60細胞6小時；(B)以濃度75 μg/mL的香椿 萃取液(TSL-1)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變化。
TSL-1 0 10 25 50 75 75（μg/mL）
Catalase － － － － － 10 (U)
Cyclin D1 36 kDa
CDK4 Cyclin E
Cyclin A
0 2 4 6 （h）
30 kDa 50 kDa
CDK2 35 kDa
55 kDa 55 kDa Cyclin B1
34 kDa Cdc 2
46 kDa β-actin
(A) (B)
Cyclin D
Concentration (μg/mL)
0 10 25 50 75 75 + Catalase
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
CDK2
Concentration (μg/mL)
0 1 2 3 4 5 6 7
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
CDC2
Concentration (μg/mL)
0 10 25 50 75 75 + Catalase
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
圖十五、利用西方點墨法觀察G0/G1 phase中的Cyclin D1、CDK4、
Cyclin E、CDK2、cyclin A、cyclin B1、Cdc2的蛋白表現量 變化的量化圖。以β-actin為internal control。(A)分別以不同 濃度的香椿萃取液(TSL-1)處理HL-60細胞6小時；(B)以濃度 75 μg/mL的香椿萃取液(TSL-1)處理細胞不同時間後，觀察 蛋白表現量變化。數據結果以mean ± SD 値表示，n=3，* p<
0.05 v.s. control；＃p< 0.05 v.s.75 μg/mL。
(A) (B)
圖十六、利用西方點墨法觀察G0/G1 phase中的p15、p21、p27的蛋 白表現量。以β-actin為internal control。(A)分別以不同濃度 的香椿萃取液(TSL-1)處理HL-60細胞6小時；(B)以濃度75 μg/mL的香椿萃取液(TSL-1)處理細胞不同時間後，觀察蛋白 表現量變化。
TSL-1 0 10 25 50 75 75（μg/mL）
Catalase － － － － － 10 (U) 0 2 4 6 （h）
p15
p21 p27
β-actin
15 kDa 27 kDa 21 kDa 46 kDa
(A) (B)
p15
Concentration (μg/mL)
0 10 25 50 75 75 + Catalase
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0
Protein Level (fold)
0
白表現量變化的量化圖。以β-actin為internal control。(A) 分別以不同濃度的香椿萃取液(TSL-1)處理HL-60細胞6小 時；(B)以濃度75 μg/mL的香椿萃取液(TSL-1)處理細胞不同 時間後，觀察蛋白表現量變化。數據結果以mean ± SD 値表 示，n=3，* p< 0.05 v.s. control；＃p< 0.05 v.s. 75 μg/mL。
(A) (B)
圖十八、利用西方點墨法觀察G0/G1 phase中的Rb、p-Rb的蛋白表現 量。以β-actin為internal control。(A)分別以不同濃度的香椿 萃取液(TSL-1)處理HL-60細胞6小時；(B)以濃度75 μg/mL的 香椿萃取液(TSL-1)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變 化。
TSL-1 0 10 25 50 75 75（μg/mL）
Catalase － － － － － 10 (U) 0 2 4 6 （h）
Rb p-Rb β-actin
110 kDa 110 kDa 46 kDa
(A) (B)
Rb
Concentration (μg/mL)
0 10 25 50 75 75 + Catalase
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
第六節 利用西方墨點法(Western blotting)探討香椿萃取液(TSL-1)對 Casapse-9 蛋白表現量的改變
以西方墨點法分析香椿萃取液(TSL-1)對HL-60細胞內的caspase 蛋白的影響。與計畫性死亡相關的caspase-9。分別以不同濃度的香椿 萃取液(TSL-1)處理HL-60細胞6小時，和以75 μg/mL的香椿萃取液 (TSL-1)處理細胞不同時間後，觀察caspase-9蛋白表現量變化。結果發 現caspase-9隨著濃度上升與時間延長而增加(圖二十)。
(A) (B)
圖二十、利用西方點墨法觀察有關計畫性死亡路徑中的caspase-9 的 蛋白表現量。(A)分別以不同濃度的香椿萃取液(TSL-1)處 理HL-60細胞6小時；(B)以濃度75 μg/mL的香椿萃取液 (TSL-1)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變化。
TSL-1 0 10 25 50 75 75（μg/mL）
Catalase － － － － － 10 (U) 0 2 4 6 （h）
Caspase 9
47 kDa 37 kDa 35 kDa 23 kDa
第七節 利用西方墨點法(Western blotting)探討香椿萃取液(TSL-1)對 死亡受器路徑中調控蛋白質表現量的影響
以西方墨點法分析，香椿萃取液(TSL-1)對死亡受器路徑中調控 蛋白質表現的影響。調控死亡受器路徑的蛋白質，包括FAS、FAS Ligand、Caspase-8及Bid。以β-actin當作internal control。分別以不同 濃度的香椿萃取液(TSL-1)處理HL-60細胞6小時，和以75 μg/mL的香 椿萃取液(TSL-1)處理細胞不同時間後，觀察FAS、FAS Ligand、
Caspase-8及Bid。結果發現FAS、FAS Ligand隨著濃度上升與時間延 長而增加(圖二十一、圖二十二)。Caspase-8及Bid隨著濃度上升與時 間延長而斷裂活化(圖二十三、圖二十四)。
(A) (B)
圖二十一、利用西方點墨法觀察死亡受器路徑中的FAS Ligand、FAS 的蛋白表現量。(A)分別以不同濃度的香椿萃取液(TSL-1) 處理HL-60細胞6小時；(B)以濃度75 μg/mL的香椿萃取液 (TSL-1)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變化。
TSL-1 0 10 25 50 75 75（μg/mL）
Catalase － － － － － 10 (U) 0 2 4 6 （h）
FAS
FAS-L 26~40 kDa
48 kDa
（A） (B)
FAS-L
Concentration (μg/mL)
0 10 25 50 75 75 + Catalase
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0 取液(TSL-1)處理HL-60細胞6小時；(B)以濃度75 μg/mL的 香椿萃取液(TSL-1)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量
(A) (B)
圖二十三、利用西方點墨法觀察死亡受器路徑中的 caspase-8、Bid 的蛋白表現量。(A)分別以不同濃度的香椿萃取液(TSL-1) 處理HL-60 細胞 6 小時；(B)以濃度 75 μg/mL 的香椿萃取 液(TSL-1)處理細胞不同時間後，觀察蛋白表現量變化。
TSL-1 0 10 25 50 75 75（μg/mL）
Catalase － － － － － 10 (U) 0 2 4 6 （h）
Caspase 8
Bid
55 kDa 41 kDa
22 kDa
(A)
C oncentration ( μg/mL )
0 10 25 50 75 75 + C atalase
Protein Level ( fold )
0.0
Protein Level ( fold )
0.0
第八節 利用西方墨點法(Western blotting)探討香椿萃取液(TSL-1)對 SOD 及 Catalase 蛋白質表現量的影響
以西方墨點法分析，香椿萃取液(TSL-1)對 SOD 及 Catalase 蛋白 質表現的影響。以β-actin 當作 internal control。分別以不同濃度的香 椿萃取液(TSL-1)處理 HL-60 細胞 6 小時後，觀察 SOD 及 Catalase。
結果發現 SOD 及 Catalase 隨著濃度上升而減少(圖二十五、圖二十 六)。推測可能因為 HL-60 細胞經香椿萃取液(TSL-1)刺激後，便產生 大量的 ROS，為了抗衡而消耗 HL-60 細胞內的抗氧化酵素 SOD 及 Catalase。
圖二十五、利用西方點墨法觀察SOD 和 Catalase 的蛋白表現量。分 別以不同濃度的香椿萃取液(TSL-1)處理 HL-60 細胞 6 小時 後，觀察蛋白表現量變化。
TSL-1 0 10 25 50 75 （μg/mL）
SOD Catalase
16 kDa
60 kDa
SOD
Concentration (μg/ml)
0 10 25 50 75
Protein Level (fold)
0.0
Protein Level (fold)
0.0
第二部分
探討香椿成分 TSL-1 在活體動物抗癌及防癌作用
第一節 香椿萃取液 (TSL-1) 可抑制血癌 (HL-60) 腫瘤的 生長
建立裸鼠異位移植腫瘤 (nude mice xenograft tumor model)模式 後，以TSL-1 進行抑制血癌 (HL-60) 腫瘤的實驗。裸鼠腹腔注射投 予TSL-1 作為實驗組，分為低劑量組 (7.5 mg/kg) 和高劑量組 (10 mg/kg) ，而腹腔注射投予PBS 作為控制組，實驗進行三週。測量各 裸鼠腫瘤重量之變化，結果發現TSL-1高劑量組(0.08 ± 0.06 g) 抑制腫 瘤最為明顯，而低劑量組 (0.69 ± 0.31 g) 相較於控制組 (2.71 ± 0.52 g) 也 同 樣 有 顯 著 抑 制 腫 瘤 生 長 效 果 。 腫 瘤 抑 制 率 分 別 是 低 劑 量 組 (74.54%) 和高劑量組 (97.05%)。而在體重方面，結果發現實驗組和 控制組體重的變化在實驗前及在實驗後並沒有影響(表一、圖二十 七)。
表一、香椿萃取液 (TSL-1) 可有效抑制血癌 (HL-60) 腫瘤的生長。 Weight of tumour
(g)
控制組 低劑量組(7.5 mg/kg) 高劑量組 (10 mg/kg) 體積之變化。結果發現TSL-1組(7.5 mg/kg.和10 mg/kg)有效地抑制
D a y t r e a t e d b y d r u g s
0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1
Volume of tumour (cm3 )
0 . 0
腫瘤的生長。數據結果以mean ± SE. 値表示，n=6，* p< 0.05。
(A)
圖二十八、. Histopathological changes of tumor masses of nude mice in the control group. A. Tumor masses showed massive coagulative necrosis (N), focal to massive, acute to subacute, (C-1, male, 20x). The growing tumor cells (T) are located around the peripheral and/or central area of masses (C-1, male, 40x).
C and D are magnified from A and B (100x,200x, H&E stain). E. Tumor cells expressed single oval round cells with predominant nucleolus, resemble as lymphoblast cells, leukemia with high mitotic figures (arrow), F.with blood vessels infiltration (arrow) (C4, male, 400x) H&E stain.
A
B
C
D
E
F
N
T
N
T
T
N
T
T
N
A
B
C
D
IT T
圖二十九、 Histopathological changes of tumor masses of nude mice in the TSL-treated group. A. Tumor masses (T) showed smaller than control (20x), B. numerous inactive tumor cells (IT) were observed in the mass (200x). C. Most of these tumor cells displayed condensate and shrinkage (TSL-200-1, female, 400x). D. No tumor cells infiltration was found in the adjacent lymph node (200x), H&E stain.
第七章討論
自 1982 年起，癌症即躍居台灣十大死因之首位，但目前治療癌 (HL-60)是否會造成細胞週期停止(cell cycle arrest)的現象。(4)以香椿 萃取液處理人類血癌細胞(HL-60)對於活性氧化物(reactive oxygen species)、粒線體膜電位改變(mitochondrial membrane potential)的影 響。(5)以香椿萃取液處理人類血癌細胞(HL-60)造成細胞凋亡和細胞 週期停止的機制。(6)藉由動物實驗探討腹腔注射香椿萃取液是否抑 制人類血癌腫瘤的生長。
由結果得知：香椿萃取液在對正常內皮細胞無傷害的情況下，對 HL-60 細胞具有毒殺性，且隨著香椿萃取液處理劑量與作用時間增
加，HL-60 細胞存活率及生長情形均有下降的情況，而在顯微鏡的觀
6、12、18小時的時間點，G0/G1 期之細胞比例有越來越多的趨勢，
故推測香椿萃取液可能造成細胞週期G0/G1 期的停止。
調控細胞週期機制有Cyclin和Cyclin-dependent kinase (CDK)，它 們在細胞週期中扮演著重要的角色。藉由Cyclin E使CDK2會使G1期 停止活化，而藉由Cyclin A會影響G1-S期的傳輸，而Cyclin B會活化 CDC2 G2M期的停止；故CDK複合物在特殊的細胞週期中會調節檢查 點(checkpoints)。Cyclin D：CDK4/6 複合物為transforming growth factor β的一個特別標的並導致細胞週期的G1期停止，故藉由誘發 p15，CDK4/CDK6的負調節、CDK4的down-regulation，這些情況皆 會導致G1期的停止【65】。藉由Western blotting 技術的方法，觀察 細胞週期的細胞素蛋白表現量，隨著濃度上升與時間的延長p15 蛋白 表現量明顯地增加而抑制Cyclin D1 和CDK4 蛋白質表現量。p27 也 隨著濃度上升與時間的延長蛋白表現量明顯地增加而抑制Cyclin E
和CDK2 蛋白質表現量。因此本研究認為香椿萃取液是藉由上調控 p15 與 p27 這 兩 個 CDK-inhibitors 而 導 致 人 類 血 癌 細 胞 在 G0/G1 phase arrest。
細胞凋亡的機制，主要是藉由細胞凋亡基因和蛋白的調節表現去 調控凋亡的機制，包括多種的瀑布式(Cascade)的反應。結果導致細胞 的裂解和產生凋亡小體。而造成這種自殺機制的主要角色為Caspase 家族蛋白，故我們要對於Caspase 家族蛋白做更進一步的探討【66】。
在死亡受器傳遞路徑中，增加FAS-L/FAS 蛋白表現量，進而活化 Caspase-8。當Caspase-8 活化之後，會切割Bid 使其轉換成truncated Bid(tBid)，接著tBid 會由細胞質移動到粒線體上，可能經由與Bax 或 Bid 作用，進一步促使Cytochrome c 的釋放。也在粒線體傳遞路徑 中，活化Caspase-9 後進而影響粒線體上的Bax、Bid和Bcl-2等蛋白質 的表現，而後釋出Cytochrome c 和其他蛋白，故Bax與cytochrome c 蛋白表現量會增加。而Caspase-3 增加亦是細胞凋亡的一重要指標，
pro-caspase-3 經由apoptosome 刺激活化Caspase-3，而誘發apoptotic substrate【67】。藉由Western blotting 技術的方法結果得知FAS-L/FAS 蛋白表現量增加進而活化Caspase-8，而Caspase-9也被活化，進而減 cytochrome c 或Fe2+會進入DCF 中，形成2’, 7’-dichlorofluorescein (DCF)的螢光產物進入細胞中，故令我們偵測到螢光【68】。結果發
現隨著時間的延長，曲線有右移的趨勢，表示有產生ROS 的現象。
依據ROS量化圖發現，在5 分鐘時候就產生大量的ROS，30分鐘達到 高峰，而後逐漸地下降。可能因此而造成細胞的DNA傷害，細胞內
粒線體膜電位(mitochondrial membrane potential)、Δψm、粒線體滲透 性轉換孔洞(permeability transition pore)的打開和釋出pro-apoptotic factors 如cytochrome c 和經粒線體活化的caspases/IAP 結合蛋白、
low pI(Smac/DIABLO)和AIF在細胞凋亡路徑。粒線體滲透性轉換孔洞 是 一 種 非 特 異 性 離 子 通 道 ， 需 要 電 位 調 控 型 陰 離 子 通 道 (voltage-dependent anion channel)亦需要腺嘌呤核苷酸轉位酶(adenine nucleotide translocase)。當粒線體內膜區域的離子大於外膜時，粒線 體 滲 透 性 轉 換 孔 洞 打 開 ， 而 基 質 會 脹 大 ， 粒 線 體 內 膜 區 域 的 apoptogenic factors就會釋放出來【69～70】。DiOC6 為一種陽離子 親脂性的染劑，為dihexyloxocarbocyanine iodide，通常用於偵測細胞 凋亡的粒線體膜電位的改變【71】。利用流式細胞計數儀評估人類血 癌細胞經由給予75 μg/mL 濃度之香椿萃取液所造成的影響。結果發 現隨時間的延長，曲線有左移的趨勢，尤其是在第6個小時最明顯，
low pI(Smac/DIABLO)和AIF在細胞凋亡路徑。粒線體滲透性轉換孔洞 是 一 種 非 特 異 性 離 子 通 道 ， 需 要 電 位 調 控 型 陰 離 子 通 道 (voltage-dependent anion channel)亦需要腺嘌呤核苷酸轉位酶(adenine nucleotide translocase)。當粒線體內膜區域的離子大於外膜時，粒線 體 滲 透 性 轉 換 孔 洞 打 開 ， 而 基 質 會 脹 大 ， 粒 線 體 內 膜 區 域 的 apoptogenic factors就會釋放出來【69～70】。DiOC6 為一種陽離子 親脂性的染劑，為dihexyloxocarbocyanine iodide，通常用於偵測細胞 凋亡的粒線體膜電位的改變【71】。利用流式細胞計數儀評估人類血 癌細胞經由給予75 μg/mL 濃度之香椿萃取液所造成的影響。結果發 現隨時間的延長，曲線有左移的趨勢，尤其是在第6個小時最明顯，