12)。但是若先將細胞處理低劑量的 HDAC-44 作用 48 小時後，移

除含有藥物的培養液，再處理肺癌細胞低劑量的 cisplatin 作用 4 個 小時後，換回不含有任何藥物的培養液讓細胞回復生長 48 小時，接 著利用 Trypan Blue exclusion assay 評估藥物對細胞的毒殺性。可以 發現細胞的存活率大大的降低成 22.2% (CL1-1) 與 50.6% (A549)，

有毒殺肺癌細胞的加成功效 (Fig. 12)。

六、HDAC-44、HTPB 以及 SAHA 等 HDAC 抑制劑，皆可以有 效促使細胞週期停止於 G2/M 期，並且導致細胞凋亡

經以上的實驗證實，新穎的 HDAC 抑制劑，HDAC-44 及 HTPB 的確可以有效的抑制肺癌細胞的生長，因此我們希望了解其原因為 何。首先我們進行細胞週期的檢測：以 DMSO 控制組、2.5 μM HDAC-44、5 μM HTPB 以及 5 μM SAHA 處理 A549 與 H1299 等肺 癌細胞株作用 48 小時後，利用 flow cytometry 觀察其細胞週期變 化，並且利用 Modfit 軟體分析細胞週期分佈比例。A549 細胞株經 HDAC 抑制劑處理 48 小時後，其 G2/M 期由 6.24% 增加到 20%

~ 31%，而代表細胞有凋亡現象的 sub-G1 期則由 4.55% 增加到 41%~54%

(Fig. 13A)

。H1299 細胞株經藥物處理 48 小時後，其 G2/M 期 則 由 12.45% 增 加 到 31% ~ 38%， 而 sub-G1 期則由 1.96% 增加到 10% ~ 22% (Fig. 13B)。可以發現 HDAC-44、HTPB 及 SAHA 皆可以有效的促使不同的肺癌細胞珠 A549 或 H1299 的 細胞週期停止於 G2/M 期無法分裂生長，此外細胞分佈於 sub-G1 的比例也明顯增加，顯示 HDAC 抑制劑有促進細胞凋亡的現象 (Fig.

13)。

此外，利用 2.5 μM HDAC-44 處理 A549 或 H1299 細胞株 24

G2/M 期由 12.24% 增加到 42.56%，但其 sub-G1 期則沒有明顯增 加，必須等至藥物處理 48 小時後其 sub-G1 才由 0.69% 增加到 26.3% (Fig. 14A)。類似的現象也在 H1299 肺癌細胞株出現，H1299

細胞株經藥物處理 24 小時後，其 G2/M 期由 12.24% 增加到 24.3%，但其 sub-G1 期則沒有明顯增加，必須等至藥物處理 48 小 時後其 sub-G1 才由 1.41% 增加到 16.16%

(Fig. 14B)。可以發現細

胞在經 HDAC-44 處理 24 小時後，即會導致細胞週期開始停止在 G2/M 期，但必須等至 48 小時之後才會出現明顯的 sub-G1，發生 細胞凋亡

(Fig. 14)。

七、HDAC-44、HTPB 與 SAHA 等 HDAC 抑制劑皆可有效的促使 肺癌細胞產生 DNA ladder 以及 Bcl-2 表達下降等細胞凋亡的現象

除了細胞週期檢測外，我們更進一步的進行其他細胞凋亡現象的 檢測：DNA ladder 的產生與抗細胞凋亡蛋白 Bcl-2 表達情形。在 DNA ladder 的實驗中，我們以 DMSO 作為控制組，利用 5 μM HDAC-44、10 μM HTPB、或 10 μM SAHA 處理 A549 肺癌細胞株 作用 48 小時後，利用膠體電泳分析細胞凋亡的特徵 DNA ladder。

發現三種 HDAC 抑制劑的個別處理下，肺癌細胞皆會出現細胞凋亡 的特徵 DNA ladder；而在 DMSO 控制組，則只能看到完整而未受

切割的基因組 DNA，不會有 DNA ladder 現象的產生

(Fig. 15A)。

此外，以 2.5 μM HDAC-44、5 μM HTPB、或 5 μM SAHA 處理 A549 及 CL1-1 等肺癌細胞株作用 0、6、12、24、48 小時後，進 行蛋白質萃取以及定量後，利用西方點墨法分析。可發現在 A549 及 CL1-1 其抗細胞凋亡 (anti-apoptosis) 之蛋白質分子 Bcl-2，隨著藥物 處理時間的增加，Bcl-2 蛋白表達有逐漸下降的趨勢

(Fig. 15B)。

八、藉由細胞免疫染色再次證實，HDAC-44、HTPB 及 SAHA 可 有效促使細胞週期停止於 G2/M 期、染色質分裂抑制、細胞凋亡與 細胞骨架不正常等現象

利用 DMSO 或 2.5 μM HDAC-44 處理肺癌細胞株 H1299、

A549 與 CL1-1 作用 48 小時後，進行細胞免疫染色。利用 α-tubulin 抗體染細胞骨架蛋白（呈綠色），DAPI 染細胞核（呈藍色）。可發現 三株肺癌細胞皆出現細胞質無法分裂的雙核或多核（紅色箭頭）現 象，以及細胞週期停止於 G2/M 期（細胞核變大）等現象。而在 H1299 與 CL1-1 等肺癌細胞株，發現其細胞骨架呈現不正常分布（綠色箭 頭）。此外在 A549 與 CL1-1 更發現有細胞核濃縮 (condensation)、

與破碎 (fragmentation)（藍色箭頭）等細胞凋亡現象

(Fig. 16)。

九、ChIP-on-chip data 顯示 HDAC 抑制劑可促使三株肺癌細胞株共

52 個基因座之組蛋白乙醯化程度上升，且共參予 38 條路徑

ChIP-on-chip 分析的結果初步顯示，HDAC-44 可以專一性的促 使肺癌細胞某些基因座上的組蛋白乙醯化：A549 共有 602 個基因 其組蛋白會被HDAC-44 乙醯化；CL1-1 共有 1046 個基因其組蛋白 會被 HDAC-44 乙醯化；H1299 共有 502 個基因其組蛋白會被 HDAC-44 乙醯化。將三株肺癌細胞株皆受 HDAC-44 影響的基因取

交集，共有52 個基因其組蛋白會被 HDAC-44 乙醯化(Fig. 17A)。此 52 個 基 因 ， 利 用 網 站 CrossPath (http://ibs.sinica.edu.tw/~chenyian/crosspath/) 進 行 路 徑 (pathway analysis) (KEGG)，發現其中有 13 個基因共參予 38 個路徑 (Fig.

17B)。本研究未來將進行

ChIP-PCR 分析，以確定這些基因組蛋白會

否會被 HDAC-44 乙醯化，並且將進一步探討 HDAC 抑制劑的抗癌 機制之目標基因群。

在文檔中 組蛋白去乙醯酶抑制劑抑制肺癌細胞生長之機制探討 (頁 44-49)