一、新穎 HDAC 抑制劑，HDAC-44 及 HTPB，可與 HDAC8 活性區結合
本研究所取得之兩種新穎的HDAC抑制劑是由美國俄亥俄州州
立 大 學 陳 慶 士 教 授 設 計 出 ， N-Hydroxy-4-(4-phenyl butyrylamino)benzamide (HTPB) 與 4-(2,2-Dimethyl-4-phenyl- butyrylamino)-N-hydroxy-benzamide (HDAC-44)；此二種化合物更進一 步由師大化學系陳建添教授簡化成 2-step合成法製備（請見「材料方 法」）。由於現今研究以及NCBI資料庫中只有唯一一種人類HDAC蛋 白質，HDAC 8，與HDAC抑制劑進行結合分析；因此我們請中興大 學徐駿森教授進行 HTPB 和 HDAC-44 等新穎 HDAC 抑制劑與 HDAC8 的分子模擬分析 (Molecular docking anaylsis)
(Fig. 6B)
，推測 這兩種新穎 HDAC 抑制劑的確可以有效的與 HDAC8 結合以抑制 其活性。二、新穎 HDAC 抑制劑，HDAC-44 與 HTPB，皆可有效促使組蛋 白 H3 和 H4 以及非組蛋白 p53 的乙醯化
接著我們想確認新穎的 HDAC 抑制劑，HDAC-44 與 HTPB，
是否在短時間內，即可以有效的抑制HDACs 的活性，以促使蛋白質
的乙醯化。
首先，我們將 CL1-1 肺癌細胞處理不同濃度的 HDAC-44、
HTPB 與 SAHA 作用 6 小時後，萃取蛋白質並且定量，利用西方點 墨法分析組織蛋白 H3 和 H4，以及非組織蛋白 p53 的乙醯化程 度。發現於短時間 6 小時內，CL1-1 隨著處理的 HDAC-44、HTPB 與 SAHA 藥物劑量的升高，其組織蛋白 H3 和 H4，以及非組織蛋 白 p53 的乙醯化程度有上升的趨勢
(Fig. 7A)。此外，利用軟體定量
各蛋白質訊號表達程度並繪圖，可發現相較於 SAHA 與 HTPB，HDAC-44 可以最有效的促使組織蛋白 H3 和 H4，以及非組織蛋白 p53 的乙醯化
(Fig. 7B)。
接著，我們將 CL1-1、A549 與 H1299 處理 2.5 μM HDAC-44、
5 μM HTPB 或 5 μM SAHA 作用 0、6、12、24、48 小時後，進行
蛋白質萃取以及定量後，並利用西方點墨法分析。CL1-1 與 A549 肺 癌細胞株經 HDAC 抑制劑處理六小時後，p53、組織蛋白 H3 與 H4 乙醯化程度皆明顯的上升，組織蛋白 H3 與 H4 乙醯化程度可持續 增加至 24 ~ 48 小時，但 p53 乙醯化程度於 6 ~ 12 小時 (CL1-1) 或 24 小時 (A549) 達到高峰，之後則有乙醯化程度下降的趨勢
(Fig.
8A)
。而 H1299 (p53 null) 的肺癌細胞株經藥物處理 6 小時後，其組 織蛋白 H3 與 H4 乙醯化情形也可維持或持續增加至 24 ~ 48 小時(Fig. 8A)。但是此三株細胞的 HDAC1 與 HDAC6 的蛋白表達量則
不受 HDAC 抑制劑影響
(Fig. 8A)
。此外，利用軟體定量各蛋白質訊 號表達程度並繪圖，可發現 CL1-1 細胞處理 HDAC-44 作用不同的 時間點後，其可以最有效的促使組織蛋白 H3 和 H4，以及非組織蛋 白 p53 的乙醯化(Fig. 8B)。
三、新穎 HDAC 抑制劑， HDAC-44 與 HTPB，皆可有效促使
p21WAF1/Cip1與 Tissue inhibitor of metalloproteinase-3 (TIMP3) 的基 因轉綠活化
我們將 CL1-1、A549 與 H1299 處理 2.5 μM HDAC-44、5 μM HTPB 或 5 μM SAHA 作用 0、6、12、24、48 小時後，萃取 RNA，
進行 RT-PCR，利用膠體電泳分析結果；或是將細胞萃取物進行西方 點墨法分析。可以發現隨著藥物處理細胞時間的增加，CL1-1 (p53 mutant)、A549 (p53 wild type) 以及 H1299 (p53 null) 等肺癌細胞 株，其p21WAF1/Cip1 mRNA (Fig. 9A) 與蛋白質
(Fig. 9B) 皆有表達上升
的趨勢；而 TIMP3 mRNA 也有轉綠活化的現象(Fig. 9A)。進一步
的 ， 將 A549 處 理 不 同 HDAC 抑 制 劑 之 RNA 進 行 real-time RT-PCR，可以發現相較於 HTPB 與 SAHA，HDAC-44 其可最有效 的增加 p21WAF1/Cip1 mRNA 的表達(Fig. 9)。此外，將 H1299 細胞萃取物進行西方點墨法分析，意外發現其 Bcl-2 蛋白表達量有上升的 趨勢
(Fig. 9B)
，與 CL1-1 及 A549 其 Bcl-2 蛋白表達量下降的現象不 同(Fig. 15B)。
四、藥物 HDAC-44 與 HTPB 可有效率的導致肺癌細胞死亡
由以上的實驗確定新穎 HDAC 抑制劑確實可以效促使蛋白質乙 醯化且促使基因轉錄的活化；因此進而評估新穎 HDAC 抑制劑，
HDAC-44 與 HTPB，相較於已知的 HDAC 抑制劑 SAHA 下，他們 毒殺 CL1-1 (p53 mutant)、A549 (p53 wild type) 以及 H1299 (p53 null)
等肺癌細胞株的能力，以及他們對 IMR90 正常肺細胞的影響。以不 同濃度（0.5 μM 至 10 μM）之 HDAC-44、HTPB 和 SAHA，處理 A549、CL1-1、H1299 以及 IMR90 等四株細胞 48 小時後，利用 Trypan Blue exclusion assay 評估藥物對細胞的毒殺性。這三種 HDAC 抑制劑皆顯示對 A549、CL1-1 與 H1299 等肺癌細胞株的存 活率有明顯地抑制，但是對於 IMR90 正常肺細胞株的存活率卻沒有 明顯的影響 (Figs. 11A-C)。將結果以回歸曲線推算其 IC50 (Fig.