染色質沈澱晶片分析（ChIP-on-chip assay）

上述 ChIP 的方法可以用 anti-acetyl histone H3 專一性抗體選 擇性地將乙醯化的組蛋白所結合之核染色質 DNA 沈澱並純化出 來，再以 CpG 島群庫 (CpG island library) 的 DNA 所點製的微矩 陣晶片 microarrays (Agilent Technologies, USA)，即可以全基因體層 次 (genome-wide level) 調查乙醯化的組蛋白所結合之核染質 DNA 基因為何。步驟概述如下：

Blunt the DNA ends：

ChIP 所沈澱下來的 DNA (IP DNA) 進行過 sonication，因此有 些 DNA 片段的末端會有 overhang end，為了將 DNA 接上 linker 進 行 PCR，必須將所有 DNA 片段的末端變成 blunt end。取 ChIP 所

沈澱下來的DNA 200ng，10X NE Buffer 2 (NEB) 11 μL、10 μg/μL BSA (NEB) 0.5 μL、dNTP (10mM) 1.1 μL、3U/μL T4 DNA polymerase (NEB) 0.5 μL，加 ddH2O 至總體積為 110 μL，將樣本放入 PCR 機器中，進 行 12℃ 40 分鐘處理，之後置於冰上，加入 3M sodium acetate 11.5 μL 及 20 μg/μL glycogen 0.5 μL ， 混 合 均 勻 後 加 入 120 μL Phenol:Chloroform 進行純化，並利用 isopropanol 進行 DNA 沈澱，

之後溶於 25 μL ddH2O。

Prepare linkers for ligation mediated PCR (LM-PCR)：

ChIP 所沈澱下來的 DNA 必須接上 linker 才能進行 PCR 放

大 ， 所 以 必 須 先 利 用 oligo JW102 (5’-GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTC-3’) 及 oligo JW103 (5’-GAATTCAGATC-3’) 進行 linkers 製作。取 Tris-HCl (1M, PH=8.0) 25 μL、JW102 (100 μM) 15 μL、JW103 (100 μM) 15 μL 及 ddH2O 45 μL，混合後利用 PCR 機器進行下列反應：95℃ 10 分鐘，70℃ 3 分 鐘，然後以每秒 0.4℃ 降溫至 4℃，之後將 linkers 置於 -20℃ 冰 箱保存。

Linker ligation：

為了將 linker 接上 whole cell extract (WCE) DNA 及 ChIP 所

沈澱下來的DNA (IP DNA)，利用下列方法進行：取 WCE DNA 及 ChIP 所沈澱下來的 DNA 各 25 μL 置於不同 tube 中，分別加入 10X T₄ ligase buffer (NEB) 5 μL、15 μM linkers 6.7 μL、400 U/μL T4 DNA ligase (NEB) 0.5 μL 及 12.8 μL 的 ddH₂O，將樣本混合後置於 16℃

中 16 小時，之後加入 3 M sodium acetate 6 μL 及 130 μL isopropanol 進行 DNA 沈澱，乾燥後加入 25μL ddH₂O 回溶。

Amplify the IP and WCE sample (LM-PCR)：

為了將樣本進行 PCR 放大，故取經過 liker ligation 的 WCE

DNA 及 ChIP 所沈澱下來的 DNA 各 25 μL 置於不同 tube 中，分 別加入 10X Thermopol buffer (NEB) 5 μL、dNTP (2.5 mM) 5 μL、oligo JW102 (40 μM) 1.25 μL、2 U/μL Deep VentR (exo^-) DNA polymerase 1 μL 及 12.75 μL 的 ddH2O，進行下列的第一次 PCR 反應：55℃ 4 分 鐘、72℃ 3 分鐘、95℃ 2 分鐘，之後進行 15 cycles 的下列反應：

95℃ 30 秒、60℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘，最後進行 72℃ 5 分鐘。將 50 μL PCR 產物轉移至 1.5 mL 的 tube 中，加入 475 μL 的 ddH2O，混勻後取 5 μL 進行第二次 PCR。5μL 一次 PCR 產物加入 10X Thermopol buffer (NEB) 5 μL、dNTP (2.5 mM) 5 μL、oligo JW102 (40 μM) 1.25 μL、2 U/μL Deep VentR (exo^-) DNA polymerase 1 μL 及 33.25 μL 的 ddH2O，PCR 溫度如下：95℃ 2 分鐘，25 cycles 的 95℃ 30 秒、60℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘，72℃ 5 分鐘，之後將 PCR 產物轉移 至 1.5 mL tube，加入 7.5 M Ammonium acetate 25μL 及 99.5%

Ethanol 225 μL 進行 DNA 沈澱，最後溶於 50 μL 的 ddH2O，並將 DNA 濃度定量至 100 ng/μl。

Label the IP and WCE sample with CyDye：

使用Invitrogen CGH kits (Invitrogen, USA, catalog #18095-011) 進行螢光標定。取LM-PCR 產物 (100 ng/μL) 20 μL，加入 2.5X random

快速置於冰上，靜置 5 分鐘後加入 10X dUTP nucleotide mix 8.2 μL、ddH2O 1.8μL、IP 及 WCE 樣本分別加入 1 mM 的 Cy5- 及 Cy3-dUTP 1.5 μL，最後加入 40 U/μl Klenow 1.5 μL，置於避光的 37℃

水浴槽中 3 小時。之後分別加入 9 μL 的 stop buffer 至各樣品中，

然後用 Invitrogen’s CGH column 進行樣品純化，最後得到 50 μL 螢 光標定之樣品。使用分光光度計進行螢光標定量及 DNA 濃度測量，

Cy3 的樣本標定量要大於 3.5 pmol/μL，Cy5 的樣本標定量要大於 2.5 pmol/μL，而每個樣本的 DNA 總濃度要大於 5 μg。

Hybridize the microarray：

利用 Agilent Human CpG Island ChIP-on-Chip Set 244K (Catalog

#G4492A)晶片進行雜合反應。取 Cy3 及 Cy5 標定樣品各 5 μg 混 合，加入 ddH₂O 定量至 150 μL，並加入 50 μL Human Cot-1 DNA (1.0 mg/mL) 、 10X Agilent blocking agent 50 μL 及 2X Agilent hybridization buffer 250 μL，將樣品置於 95℃ 加熱器中 3 分鐘，之 後於 37℃ 水浴槽中反應 30 分鐘，取 490μL 樣本與晶片進行雜合 反應，將晶片放入 Agilent Hybridization chamber (Catalog #G2534A) 中，置於烘箱的旋轉架上，旋轉速度為 10~20 rpm，65℃ 反應 40 小 時。以上所有反應皆須避光進行。

Wash and scan the slides：

在 室 溫 的 Agilent oligo aCGH/ChIP-on-chip wash buffer 1 (Catalog #5188-5221) 中，將晶片與蓋玻片分離，換至另一缸的 wash buffer 1 中，室溫洗 5 分鐘，之後置入預先加熱至 31℃ 的 Agilent oligo aCGH/ChIP-on-chip wash buffer 2 (Catalog #5188-5222) 中，洗 5 分鐘，之後利用離心機 1800 rpm，2 分鐘來去除晶片上的 buffer。

以上所有反應皆須避光進行。清洗後的晶片，使用 Axon GenePix 4000B scanner，以 5 μm 解析度進行掃瞄，並利用 Agilent Feature Extraction 9.5 軟體進行影像量化及校正，最後運用 Agilent Launch ChIP Analytics 1.3 軟體進行資料分析。