組蛋白去乙醯酶抑制劑抑制肺癌細胞生長之機制探討

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(1)參、文獻總論 1 肺癌 1.1 肺癌之流行病學概述根據行政院衛生署最新統計資料 (中華民國九十四年台灣地區死因統計結果，2007 年 5 月查詢) 顯示：惡性腫瘤為民國 94 年國人十大死亡原因之首，因癌症而死亡的人數為 37,222 人，佔總死亡人數的 26.8％。而癌症死亡原因的首位即為肺癌，民國 94 年因肺癌而死亡的人數為 7,302 人，佔癌症死亡率的 19.16％；依性別區分，肺癌為男性癌症死亡原因的第二位，共 5,083 人死亡，佔男性癌症死亡率的 21.8％；肺癌則為女性癌症死亡原因的第一位，共 2,219 人死亡，佔女性癌症死亡率的 19.9％ (1)。肺癌依組織學可以被區分為兩大類型：小細胞肺癌 (Small cell lung cancer, SCLC) 與非小細胞肺癌 (Non-small cell lung cancer, NSCLC)；其中，非小細胞肺癌又可再區分為肺腺癌 (adenocarcinoma)、麟狀上皮細胞肺癌 (squamous cell carcinoma)、大細胞肺癌 (large cell carcinoma) (2)。臺灣以肺腺癌及鱗狀上皮細胞肺癌較多，各約佔 35-40%；而肺腺癌有日漸增多的趨勢，無吸煙者所罹患肺癌者常為此類。小細胞肺癌則 (約佔 10-15%) 及鱗狀上皮細胞肺癌與病患長期吸煙有密切的關係，而鱗狀上皮細胞肺癌常見於男性吸煙者 (1)。 5.

(2) 除了台灣，肺癌在美國也是癌症死亡的首要原因；2006 年，美國共有超過 158,000 人死於肺癌。儘管癌症的治療已經有所進步，但病人的五年存活率只有 15％，依舊很低 (2)。肺癌重要的危險因子 (risk factor) 有很多：如抽菸、二手菸、家族史、空氣污染、曝露在含有致癌因子的環境下，如：放射性的鈾、氡，礦物性的石綿、焦油，金屬的镍、砷等 (3-5)、患有慢性支氣管炎與肺結核等肺部慢性疾病的病人、常吸入高溫油炸時的油煙…等，皆易導致肺癌的發生。. 1.2 肺癌的分期與治療方法非小細胞肺癌的分期. (stage) 依腫瘤 - 淋巴節 - 轉移. (tumor-nodes-metastasis, TNM) 的分期系統法可分為：局部 (Local)： IA 期、IB 期及 IIA 期；局部的後期 (Locally advanced)：IIB、IIIA 期及 IIIB 期；後期 (Advanced)：IIIB 期及 IV 期等，總共四期。其中第一期的癌細胞還位於肺部，尚未轉移至淋巴結；第二與第三期的癌細胞已轉移至淋巴結；第四期病人的癌細胞則發生遠端轉移的現象 (2, 6, 7)。小細胞肺癌則分為：有限期疾病 (limited stage disease)，病人癌細胞還位於同一側的肺部；廣泛期疾病(extensive stage disease)，病人癌細胞發生轉移的現象 (2, 6, 7)。 6.

(3) I 期~IIIA 期的非小細胞肺癌病人可利用外科手術的方法切除腫瘤 (8)，外科手術為肺癌最好的根治方法。最近的文獻顯示，非小細胞肺癌病人，在手術前先進行化學治療 (neoadjuvant chemotherapy) 把一些未被發現的癌細胞殺死，接著再進行外科手術，如此可降低病人的復發率，增加病人的存活率 (9)。若外科手術前未進行化學治療，則手術後輔佐化學治療 (adjuvant chemotherapy) 也是目前治療的標準模式 (2)。但 IIIA 期~IV 期的非小細胞肺癌病人由於腫瘤已經過大且發生轉移的現象，因此較不考慮使用外科手術切除腫瘤而使用其他治療方法，包括有：放射線治療、化學治療或混合療法等方法；而小細胞肺癌則主要靠化學治療 (於 limited stage disease 時並搭配放射線治療) (2, 8)。由於肺癌的早期症狀不明顯，因此當肺癌病人發現自己罹患肺癌時往往肺腫瘤已經生長較大甚至發生癌細胞淋巴腺轉移或遠端轉移的現象，無法利用外科手術的方法切除治療肺部腫瘤。此時，病人只能仰賴傳統的化學治療或是目前的新興療法---標靶治療 (targeted therapy )，並且佐以放射線治療。因此，發現與合成新穎的肺癌化學治療與標靶治療抗癌藥物是刻不容緩的工作。. 7.

(4) 1.3 傳統化學治療 (Chemotherapy) 藥物目前臨床上具有多種化學治療藥物可以有效的治療小細胞肺癌及非小細胞肺癌，藥物可區分為鉑類化療藥物 (Platinum agents) 及非鉑類化療藥物 (Nonplatinum agents)，而鉑類藥物被認為是最有效的化療藥物 (7)。鉑類化療藥物包含有 Cisplatin (Platinol, 商品名：順鉑) 與 Carboplatin (Paraplatinl, 商品名：碳鉑)，Cisplatin 為最常用的化療藥物之一，可以單一使用或是合併搭配其他化療藥物使用 (10) 。 Cisplatin 會攻擊 DNA 親核的位置 (nucleophilic sites) 並與 DNA 連結共價形成股內 (intrastrand) 和股間 (interstrand) 的 monoadducts，抑制 DNA 複製、轉錄、轉譯與 DNA 修補，而導致細胞死亡 (7, 11, 12)。Carboplatin 為 Cisplatin 的類似物，部分文獻指出 Carboplatin 與 Cisplatin 同樣有效，但其副作用較小 (7)。非鉑類的化療藥物則包含有：Etoposide (VePesid, VP-16)、Topotecan (商品名：Hycamptin，癌康定)、Irinotecan (商品名：Camptosar，抗癌妥)、 Doxorubicin (Adriamycin ，俗稱：小紅莓 ) 等拓樸異構酶抑制劑 (Topoisomerase inhibitors)； Paclitaxel (商品名：Taxol，太平洋紫杉醇)、Docetaxel (商品名：Taxotere，剋癌易、歐洲紫杉醇)、Vinorelbine (商品名：Navelbine，溫諾平)、Vincristine (商品名：Oncovin，安可平)、等微管抑制劑 (Microtubule inhibitors)。. 8.

(5) 拓樸酵素 (Topo enzyme) 在DNA的轉錄、複製與修補扮演很重要的角色。在細胞的新陳代謝過程，Topo 酵素藉著打斷與釋放 cDNA 而降低DNA間的扭壓力衝突中，以負責調節與維持 DNA 的拓樸學 (13)。Topo 酵素對於增生 (proliferating) 的細胞，如：癌細胞，非常的重要；而 Topo 酵素抑制劑即可專一抑制 Topo 酵素，例如：抑制 Topo-DNA 間可逆的結合，促使 Topo 酵素不可逆的卡在 DNA 上，導致DNA的雙股螺旋結構斷裂而抑制癌細胞生長 (11)。微管 (Microtubules) 是細胞的主要結構成分之一，因此發展出了許多針對微管做目標的抗癌藥物。微管由微管蛋白 (tubulin) 以動力學的方式組合而成，在細胞中其可快速的聚合 (polymerize)與去聚合 (depolymerize)。微管動力學的組合對於細胞分裂時染色體分離至新的細胞是很重要的過程。微管抑制劑類的抗癌藥物可分為兩類，一類是抑制微管的聚合進而抑制細胞的有絲分裂 (mitosis)，且誘導了細胞凋亡 (apoptosis) 的發生，這類的微管抑制劑包含有：Vinca alkaloids、 cryptophycins、halichondrins、estramustine以及colchicine等 (14)。另一類的微管抑制劑則是去刺激微管的聚合作用，並且穩定微管的生成，這類的抑制劑包含有：Taxol、Taxotere、eleutherobins、epothilones、 laulimalide、sarcodictyins 以及 discodermolide 等 (14, 15)。這些微管抑制劑可以藉著結合上微管蛋白上或微管中不同的位置，而對微管動. 9.

(6) 力學有不同的影響。但微管抑制劑普遍的機制皆為抑制微管動力學，進而抑制細胞有絲時中期 (metaphase) 轉變為後期 (anaphase) 的過程，因而誘導了細胞死亡 (14, 15)。以上所述之化療藥物對於細胞的毒殺較不具有選擇性，因此不論是正常細胞或是癌細胞皆會受到藥物的影響而死亡。造成病人承受很強的藥物副作用，如：噁心、嘔吐、掉髮、骨髓抑制 (如：貧血、白血球減少、血小板減少等)、腎臟毒性、神經毒性、心臟毒性聽力喪失、電解質不平衡等 (7, 16)，或是藥物無法口服使用等缺點。除此之外，病人在施予化療藥物後，有出現抗藥性的現象，腫瘤又再度復發 (10, 17)。根據研究顯示，化學治療藥劑會導致一些基因突變進而促使抗藥性的發生，如：在 cisplatin 化學治療中，ERCC1 (excision repair cross-complementing gene) 發生突變；gemcitabine 導致染色體 11p15.5 發生缺失 (18)。因此，近年來發展出一種新興的癌症治療法 ---標靶治療 (targeted therapy)，以專一性的殺死癌細胞。. 1.4. 新興標靶治療 (targeted therapy) 藥物隨著對於癌症發生 (carcinogenesis) 過程的了解，可以將癌細胞的特徵歸類為六點： (1) 對生長訊號的自給自足 (Self-sufficiency)； (2) 對抗生長訊號的不敏感 (Insensitivity to antigrowth signals)；(3) 逃 10.

(7) 避細胞凋亡 (Evading apoptosis)；(4) 無限的複製能力 (Limitless replicative potential)；(5) 維持血管新生 (Sustained angiogenesis)；(6) 組織侵害及轉移 (Tissue invasion and metastasis)等 (19)。因此根據癌細胞獨特的特徵，衍生出了標靶治療 (targeted therapy) --- 其被設計專一性的抑制癌細胞不正常的特徵，如:干擾癌細胞的不正常增生與細胞週期、促進癌細胞凋亡、抑制血管新生及癌細胞轉移…等，以選擇性的抑制癌細胞生長，卻不會對正常細胞造成影響。目前已發展出的標靶藥物有上皮生長因子接受器酪氨酸激酶抑制劑 (epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR TKIs)，如： gefitinib (ZD 1839，商品名：Iressa，艾瑞莎) 與 erlotinib (OSI 774，商品名：Tarceva) 等，兩者皆可口服使用，可以選擇性的抑制在許多不同種的癌細胞中皆過度表達或具有不正常活性的 EGFR (18, 20)，進而阻斷 EGFR 活化的下游訊息傳遞，以達到抑制癌細胞的不正常增生、侵略、能動性並且促使細胞凋亡 (20)。根據目前的研究顯示，腫瘤中組蛋白去乙醯酶 (Histone deacetylases, HDACs) 的表達或活性具有不正常增加的現象 (21)，導致組織蛋白的低乙醯化 (hypoacetylation) (22)，與癌症的形成有強烈關聯。因此引伸出針對 HDAC 專一性抑制的想法而發展出 HDAC 抑制劑，希望尋找或合成出更多新穎的抗癌藥物。 11.

(8) 2. 染色質修飾 (Chromatin modification) 與組蛋白去乙醯酵素 (Histone deacetylases, HDACs) 在癌症的形成過程中具有很多種原因，其可粗分為基因體 (genome) 的改變以及表基因體 (epigenome) 的改變。Genome 的改變也就是突變 (mutation)，包含有：染色體的易位、鹼基的取代、插入、缺失…等原因。Epigenome 的改變，主要為 DNA 的不正常甲基化 (methylation) 與染色質 (chromatin) 中的組蛋白 (histone) 不正常的被修飾所導致。染色質上組蛋白的修飾與該染色質區域所含基因的表達有關，而 HDACs 在染色質的修飾上扮演重要角色，其可以維持染色質的乙醯化 (acetylation) 與去乙醯化 (deacetylation) 的平衡狀態，以分別調節基因的表達與不表達 (23)。. 2.1 染色質修飾 (Chromatin modification) 在細胞核中，染色質具有兩種形式：異染色質 (heterochromatin) ，其染色質結構緊密且轉錄不活化；常染色質 (euchromatin)，其染色質結構疏鬆而 RNA 聚合酶可接近，促使轉錄進行且基因表達。染色質由規律而重複的核小體 (nucleosomes) 組成，而核小體由帶負電的 146 DNA 鹼基對 (base pair, bp) 纏繞帶正電的核心組蛋白八體而成，核心組蛋白由兩重複的 H2A、H2B、H3、. 12.

(9) H4 所組成，其 N 端 (amino-terminal) 上具有許多 lysine 氨基酸，故帶正電 (Fig. 1A)。染色質的後轉譯修飾 (post-translation) 包含有：lysine 氨基酸上乙醯化與去乙醯化、 lysine 或 arginine 氨基酸的甲基化、serine 氨基酸的磷酸化 (phosphorylation) 與 lysine 的泛素化 (ubiquitylation) 等化學修飾 (23-25)。組蛋白最主要的修飾為在其 N 端的末端乙醯化與去乙醯化，這分別是藉由組蛋白乙醯轉移酶 (histone acetyltransferases, HATs) 與 HDACs 所調控。HATs 可以增加 lysine 乙醯化程度，而 HDACs 則可減少組蛋白 N 端之 lysine 氨基酸之乙醯化程度 (Fig. 1A)。以 HDACs 為例，當 HDACs 促使組織蛋白末端之 lysine 氨基酸被去乙醯化而帶有正電時，會與帶負電之 DNA 互相吸引而使得染色質的結構緊密，進而導致一些像是轉錄因子、調節因子與 RNA 聚合酶等無法接近 DNA，而促使轉錄不活化，而 HAT 則相反，可促使 lysine 氨基酸被乙烯化而不帶有正電，造成染色質結構疏鬆，轉錄活化 (Fig. 1B) (23, 25)。故當該基因位置的組蛋白被高度乙醯化時，該基因為轉錄活化；當該基因位置上的組蛋白為低乙醯化時，該基因不表達。因此，根據此原理，我們可以利用 Anti-acetyl-Histone H3 抗體沉澱下被乙醯化的基因，並進行染色質沈澱晶片分析. 13.

(10) （ChIP-on-chip assay），以大規模尋找 HDAC 抑制劑促使了哪些基因被乙醯化而轉錄活化 (Fig. 2)。. 2.2 HDACs 的分類與功能目前已經有 18 種 HDACs 被辨識，哺乳動物的 HDACs 根據與酵母菌 HDACs 結構的同源性 (homology)，可被分為四大類 (Class I、 II、III、IV)。第一類 (Class I) 、第二類 (Class II) 與第四類 (Class IV) 其促使基質 (substrate) 去乙醯化的催化活性區 (active site) 所需的輔因子 (co-factor) 為 Zn2+，而第三類 (Class III) 的 HDACs 所需的輔因子為 NAD+。目前發展的 HDAC 抑制劑皆為第一類、第二類與第四類的 HADC 抑制劑 (23, 24, 26)。第一類的 HDACs (與酵母菌的 Rpd3 同源) 包含有 HDAC 1、2、 3 與 8，廣泛的表達於組織中且主要位於細胞核內 (Fig. 3) (23, 26, 27)。第二類的 HDACs (與酵母菌的 Hda1 同源) 依序列的同源性與區域 (domain) 的組成又可次分為 Class IIa (HDAC 4、5、7、9) 與 IIb (HDAC 6 與 10)。其中 IIa 類的 HDACs 其 Carboxyl-terminal (C 端) 的去乙醯酶催化區相較於同源的 yHda1 具有高度的保留性，但 Amino-terminal (N 端) 則沒有；而 IIb 則具有兩個催化區。第二類 HDACs 較大、具有組織特異性且可以自由穿梭於細胞核與細胞質中 14.

(11) (Fig. 3) (23, 26, 28) ，故被認為可以調節細胞核外非組織蛋白 (non-histone) 的去乙醯化作用，如：HDAC 6 可以調節 α-tubulin (29) 與 Hsp90 的去乙醯化 (30)。HDACs 可與大的多種蛋白聚合體產生交互作用以降低基因表達，透過與以下的蛋白連結：輔抑制子 (corepressors)，[如：nuclear receptor corepressor (NcoR) 及 silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor (SMRT) 等]、轉錄因子 (transcription factors)、estrogen receptors (ER)、p53、細胞週期專一的調節者 [如：retinoblastoma (Rb)與 E2F]，且也可以與組蛋白及其接受器直接的相結合，進而調節各種基因表達 (23)。第四類的 HDAC 成員只有 HDAC 11，除了真菌外存在於所以的真核生物中，主要為核蛋白且具組織特異性。第三類的 HDACs 由 sirtuins [silent information regulators (SIRs)] 大家族組成，包含有 SIRT 1-7 (同源於酵母菌的 Sir2/Hst)。其在哺乳類動物中主要負責非組蛋白的蛋白質 (no-histone protein) 或轉錄因子 (如：p53) 的去乙醯化作用 (23, 31)。第三類的 HDACs 不受近來發展出的第一類與第二類的 HDAC 抑制劑所影響。第三類 HDAC 抑制劑為 nicotinamide (Vitamin B3)，其可抑制第三類 HDACs 活性所需之輔因子 NAD+之結合，例如 SIR2α 被抑制而促使 p53 的乙醯化 (23)。. 15.

(12) HDACs 除了可去乙醯化組蛋白外，其也可以去乙醯化非組蛋白的蛋白質，而蛋白的乙醯化修飾在細胞內的多種調控路徑扮演重要角色。根據目前研究顯示，HDACs 可乙醯化多種非組蛋白的蛋白質，包含有：轉錄因子、訊息傳替調節子、微管、分子的 chaperone 等，整理於 (Table 1) (26)。. 2.3 HDACs 與癌症的關連性 Acute promyelocytic leukaemia (APL) 的血癌形成原因為，retinoic acid receptor-α (RAR) 與其他的蛋白 [如：promyelocytic leukaemia (PML)、promyelocytic leukaemia zinc finger (PLZF) 或其他基因] 產生融合蛋白 (fusion protein)。正常的 RAR 為轉錄因子，在缺乏 retinoic acid (RA，為 RAR ligand) 的情況下，RAR 與含有 HDAC 的蛋白聚合體連結，且結合於 RA 調節的基因的 DNA response element 上，導致基因轉錄的不活化。但當細胞接受到 RA 即可促使 RAR 釋放出含有 HDAC 的蛋白聚合體，而改與其他轉錄輔活化子 (包含 HATs) 結合而促使轉錄再度活化。在 APL 血癌中，RAR fusion 蛋白質不受一般生理狀態下濃度的 RA 所影響，因而 RAR fusion 蛋白會一直與含有 HDAC 的蛋白聚合體結合，導致 RA 調節的基因不正常的不表達 (22, 32)。根據目前的研究顯示，將 RA 與 HDAC 抑制劑. 16.

(13) 共同給予 APL 細胞或病人，可以更有效的促使 RA 調節的基因轉錄活化以及癌細胞死亡 (33, 34)。在 B-cell lymphomas 中，致癌基因 (oncogene) BCL6 產生的轉錄的抑制子 (repressor)，其需要招募 (recruit) HDACs 才具有致癌的特性。若 BCL6 被 p300 HAT 乙醯化，會導致 BCL6 無法招募 HDACs 而干擾了 BCL6 致癌的能力。因此，當利用 HDAC 抑制劑抑制了 HADC 的活性，可以促使轉錄抑制子 BCL6 被乙醯化，進而導致 B-cell lymphoma cells 凋亡 (35)。在缺乏 adenomatosis polyposis coli (APC) 腫瘤抑制基因的大腸癌老鼠的腫瘤與組織中，發現 HDAC2 有過度表達的現象。利用 RNAi 調節的 HDAC2 knockdown 方式以及使用 valproic acid HDAC 抑制劑，可以有效的促使癌細胞的死亡及縮小腫瘤 (22, 36)。在食道麟狀細胞癌 (esophageal squamous cell carcinomas) 病人的腫瘤組織切片中，發現 metastasis-associated protein MTA1 有過度表達的現象。 MTA1 會與 HDAC 形成蛋白聚合體，導致組蛋白乙醯化程度降低。高度表達 MTA1 以及組蛋白低乙醯化的病人往往伴隨著淋巴結轉移與很差的預後 (37)。. 17.

(14) 根據目前的研究顯示，許多腫瘤中組蛋白去乙醯酶的表達或活性具有不正常增加的現象 (21) ，導致組織蛋白的低乙醯化 (hypoacetylation) (22)，染色質結構的不正常緊密，促使一些重要的基因，如：腫瘤抑制基因 (tumor suppressor genes, TSGs) 的轉錄不活化 (38)，因而導至細胞不正常的增生，而此現象在正常細胞並不會發生，因此引伸出針對癌細胞 HDACs 專一性抑制的想法，而發展出 HDAC 抑制劑，希望尋找或合成出更多新穎的標靶抗癌藥物 (Fig. 2)。. 3. 組蛋白去乙醯酵素抑制劑 (HDAC inhibitors)作為癌症治療藥物的現況. 3.1 HDAC inhibitors 的分類與分子機制現今，在一些固體的腫瘤或血癌，已有數種 HDAC 抑制劑透過靜脈注射或口服方式進行 Phase I 及 Phase II 的臨床測試 (23)。目前已發展出的 HDAC 抑制劑依其結構可分為四大類 (Fig. 4)，包括有：（1）Short-chain fatty acids 類，如：Butyrate、Phenylbutyrate、Valproic acid、AN-9 (pivaloyloxymethyl butyrate) 等；（2）Hydroxamic acids 類，如：suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)、trichostatin A (TSA)、. 18.

(15) LAQ-824、Proxamide、oxamflatin、tubacin 等；（3）Benzamides 類，如 MS-275、CI-994 (N-acetyl dinaline) 等；（4）Cyclic peptides 類，如： Depsipeptide (FK228)、Apicidin、AOE、TPX 等 (23, 26, 39)。大部分的 HDAC 抑制劑對於 HDACs 的各種同功酶不具有專一性的抑制，但最近研究發現，tubacin 可以選擇性的結合 HDAC6 兩個催化區中的其中一個負責執行 α-tubulin 去乙醯化的區域，進而專一性的促使 α-tubulin 的乙醯化，但並不會影響組蛋白乙醯化程度、基因表達與細胞週期。發展專一性的 HDAC 同功酶抑制劑，對於臨床上的癌症治療極具有價值 (40)，但部分藥物仍有其缺點。. 3.2 現今 HDAC inhibitors 的缺點雖然現今已有有眾多 HDAC 抑制劑，但也面臨幾種問題，如： Short-chain fatty acids 這類的抑制劑，其病人的忍受性雖然很好，但其很容易被快速代謝導致半衰期短，此外在治療時也需使用較高的劑量；天然的 TSA 為第一個 Hydroxamic acids 這類的 HDAC 抑制劑，其可以廣泛的有效抑制第一類與第二類的 HDACs，但由於其對細胞的毒性太強，因此臨床上無法使用；FK228 為 Cyclic peptides 類的 HDAC 抑制劑，其雖已進入臨床上 phase I 與 phase II 的檢測，但顯示其對心血管造成毒性 (26)。而多種 HDAC 抑制劑進入臨床上. 19.

(16) 的檢測後，也顯示各種副作用 (Fig. 5) (22, 39)，因此合成新穎 HDAC 抑制劑是刻不容緩的。綜合目前研究顯示，HDAC 抑制劑可有效的促使組蛋白與非組蛋白的蛋白質乙醯化。此外，其也可以藉著抑制 HDACs，導致 HDAC-PP1 (protein phosphatase 1) 的蛋白質聚合體分離而釋放出 PP1，而自由的 PP1 可以促使一些與訊息傳遞 (如：AKT) 有關的蛋白去磷酸化 (dephosphorylation)，進而抑制了與細胞增生有關的訊號傳遞路徑 (26, 41)。. 3.3 新穎 HDAC inhibitors 的設計與製備利用 X-ray 結晶學 (crystallographic) 分析，可以得知細菌的 HDAC 同源蛋白 histone deacetylase-like protein (HDLP) 與 SAHA 或 TSA 等 HDAC 抑制劑結合的情況。HDAC 催化區由一個窄的、管狀的口袋所組成，其長度大約為 4-6 個碳；而在催化區的口袋接近底部處有一個鋅離子 (Zn2+) 當輔因子 (cofactor)，此外具有兩個 His-Asp charge-relay system 以輔助去乙醯的催化。多種 HDAC 抑制劑 (如：TSA、SAHA、MS-275) 的結構可分為三部份，以 TSA 為例，其可分為：Zn2+ 螯合的 (chelating) 的 motif (hydroxamic acid)、一段脂肪鏈當作連結者 (linker) 與一個具有極性的蓋子 (cap) (Fig. 20.

(17) 6A)，這三個部份分別與 HDAC 催化區的不同部分作用 (26)，促使 TSA 有效的抑制 HDAC 的活性。根據 TSA 的模型 (cap group－ linker－Zn2+-chelating motif)，推測短鏈脂肪酸類的 HDAC 抑制劑與 HDACs 相結合的方式是透過微弱、不穩定的非專一性的疏水性 (hydrophobic) 作用於 HDACs 催化區入口處的氨基酸或是 HDACs 管狀的口袋中的氨基酸。因此，短鏈脂肪酸類的 HADC 抑制劑其抑制 HDACs 的能力很差 (需要mM的濃度)。故推測若將短鏈脂肪酸類的 HDAC 抑制劑透過疏水性的 linker 接上 Zn2+ -chelating motif，可以大大的加強抑制 HDACs 的活性。根據此推測，美國俄亥俄州州立大學陳慶士教授設計出兩種新穎的 HDAC 抑制劑， N-Hydroxy-4-(4-phenyl. butyrylamino)benzamide. (HTPB). 與. 4-(2,2-Dimethyl-4-phenyl-butyrylamino)-N-hydroxy-benzamide (HDAC-44) 。其中 HTPB 即是將 phenylbutyrate 透過芳香族 (aromatic) 的氨基酸鏈當 linker 接上 hyroxamate 而合成；進一步的再置換了 HTPB 的 phenylbutyryl 骨架而衍生出 HDAC-44 (26, 42-44)。. 21.

(18) 肆、研究目的. 本研究利用兩種新穎的 HDAC 抑制劑 (HTPB and HDAC-44) (由陳慶士教授所提供) 與本實驗室的數種肺癌細胞及正常肺細胞，探討 HDAC 抑制劑其抑制癌細胞生長的作用機轉，並且評估新穎的 HDAC 抑制劑 (HTPB and HDAC-44) 是否有潛力成為肺癌的新穎臨床用藥。. 本實驗主要分為兩大部分：. （1）了解新穎 HDAC inhibitors 影響細胞生物功能：以 CL1-1、 H1299、A549 等肺癌細胞，分別處理 HTPB、HDAC-44 等 HDAC 抑制劑，進行細胞生物方面的檢測，如： [1] 細胞毒殺性測試 (cytotoxicity analysis)，以檢測 HDACIs 單獨對肺癌細胞的毒殺性，以及共同處理 HDAC-44 與 cisplatin 傳統臨床用藥於肺癌細胞，觀察是否能加成抑制癌細胞生長；[2] 細胞週期分析 (Cell cycle analysis) 以觀察新穎 HDAC 抑制劑是藉由影響細胞週期的 G1、S、G2、M 哪個階段而達到抑制癌細胞生長的功能； [3] 細胞凋亡分析 (Cell apoptosis assay) 例如 DNA 片斷化分析 (DNA ladder assay)，於細胞凋亡的晚期，細胞的內切酶會切斷在核小體間的 DNA 而產生約 22.

(19) 180-200bp 的 DNA 片段，而利用膠體電泳分析後即出現 DNA ladder 的現象；[4] 細胞免疫染色 (Immunocytochemical analysis) 利用 DAPI 染細胞核，並且使用 α-tubulin 細胞骨架的抗體以觀察新穎 HDAC 抑制劑是否會導致不正常的細胞骨架。[5] 反轉錄的聚合酶鏈鎖反應 (RT-PCR)，在 RNA 層次 HDAC 抑制劑是否促使基因轉錄的活化；及 [6] 西方點墨法 (Western blot) 以觀察 HDAC 抑制劑是否促使蛋白質的乙醯化以及表達。. （2）了解新穎 HDAC 抑制劑是否影響基因體泛染色體緊密度 (Genome-wild analysis) ：利用染色質免疫沈澱晶片分析 (chromatin-immunoprecipitation, ChIP-on-chip analysis) 大規模尋找 HDAC 抑制劑所影響的基因為何，希望能建構出 HDACs 所影響之基因體表現圖譜。. 23.

(20) 伍、研究材料與方法. 一. 研究材料. 1. 肺癌細胞株 A549 (p53 +/+)、CL1-1 (p53 突變)、H1299 (p53 -/-) 等肺癌細胞株利用包含有 10% fetal bovine serum (FBS, GIBCO)，1% 抗生素 (penicillin-streptomycin; GIBCO)的 DMEM 培養液，培養在 37℃，5% CO2 培養箱中。. 2. 傳統常用臨床化療藥物 Cisplatin 由 Bristol-Myers Squibb Caribbean Company (Mayaguez, Puerto Rico 00708, USA) 購得。. 3. HDAC 抑制劑 SAHA (Suberoylanilide hydroxamic acid) 由 (Cashmere, Taiwan) 購得。HTPB、HDAC-44 初步由美國俄亥俄州州立大學陳慶士教授. 24.

(21) 所提供，接著由台灣師範大學化學系陳建添教授提供。SAHA、HTPB 及 HDAC-44 皆溶解於 DMSO 中，配至為 10 mM 並儲存於 -20℃ 冰箱中保存。. 3.1 HTPB 與 HDAC-44 合成方式圖解 (由台灣師範大學化學系陳建添教授提供). R. R OH O. i ii. R. R. H N. R. R. iii. O. H N. O. OH. N O. O 1(a,b). H. 3(a,b). 2 (a,b). a) R =H b) R=Me. i) Oxalyl chloride, CH2Cl2 ii) Paraaminobenzoic acid, TEA, CH2Cl2, iii) PyBOP, TEA, Hydroxylamine Hydrochloride 實驗合成部份 (1b) 2, 2,-Dimethyl-4-phenylbutyric acid 在Isobutyric acid (1.4 mL)中加入diisopropylamine (2.2 mL, 0.015 mol) 與溶於礦物油 (mineral) 中的 54% sodium hydride (0.74 g, 0.0165 mol) 混合液，於 Tetrahydrofuran (40 mL) 逆流 (refluxed) 作用 15 分鐘。將溶液冷卻至 0℃ 後，將溶於 heptane 的 n-butyllithium (1.45 mmol/mL; 9.4 mL) 加入溶液中。在 0℃ 下作用 25. OH.

(22) 20 分鐘後，進而加熱至 30-35℃ 15 分鐘，接著再冷卻至 0℃，將 (2-bromoethyl)-benzene (2.8 mL, 15 mmol) 加入反應的混合液中作用至少 20 分鐘，共冰浴30 分鐘，混合液接著加熱至 30-35℃ 1 小時。當溫度低於 15℃ 時，加入 40 mL 的水至反應混合液中，將水層分離開，並利用 20 mL 的水與 30 mL 的 ethyl ether 混合液沖洗有基層，將水層彼此混合。接著回去再萃取 20 mL ethyl ether，利用 1 N 的 hydrochloric acid 酸化，並且利用 30 mL 的 ethyl ether 再萃取兩次。將結合的有基層利用 20 mL 的飽和鹽水沖洗，利用 Na2SO4 乾燥與真空濃縮。此時加入Hexane與有基層產生 1.1 克的白色固體 1b。 1b)1H NMR (CDCl3, 400 MHz) 7.30-7.16 (m, 5H), 2.65-2.60(m, 2H,), 1.90-1.86(m,2H),1.30(m,6H), 13. C NMR (CDCl3,100MHz):δ184.55,142.08,128.36,128.33,125.84,42.46,42.25,31.44,25.0. (2a) 4-(4-Phenyl-butyrylamino)-benzoic acid. and (2b) 4-(2,. 2-Dimethyl-4-Phenyl-butyrylamino)-benzoic acid 將溶於 dichloromethane (5 mL) 的 acid 1 (a, b) (1 mmol) 冷卻溶液加進 oxalyl chloride (2 mmol)，反應混合物於室溫下攪拌 4 小時。反應完成後，利用抽真空的方式移除溶劑，而殘留物利用 dichloromethane (10 mL) 溶解，並且冷卻至 0℃。接著加入 paraamino 26.

(23) benzoic acid 後，再加入 triethyl amine，將混合液移至室溫並且攪拌隔夜。過濾出固體產物且以冰 dichloromethane 沖洗而得到產物 (2a, b)，其產率為 92 %。 2a). -1. H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 11.19 (s, 1H), 7.86-7.84 (d, 2H, J = 7.9 Hz), 7.68-7.7.66(d, 2H, J = 7.9 Hz), 7.28-7.16(m,5H) 2.62-2.58(t, 2H, J = 7.3 Hz), 2.35-2.32(t,2H, J = 7.9 Hz)1.89-1.85 (m, 2H), 13. CNMR(DMSO,100MHz):δ171.89,167.20,143.45,141.78,130.55,128.53,126.03, 125.10,118.56,54.99,36.03,34.75,26.81. 2b). -1. H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 9.55 (s, 1H), 7.93-7.91 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.82-7.79(d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.30-7.16(m, 5H) 2.52(t, 2H,), 1.95-1.90(m, 2H) 1.30 (m, 6H), 13. CNMR(DMSO,100MHz):δ176.00,167.68,142.96,142.15,129.97,128.29,128.16, 126.52,125.69,119.37,69.77,42.88,42.03,30.81,24.95.. (3a) N-Hydroxy-4-(4-Phenyl-butyrylamino)-Benz amide (HTPB) 與 (3b) 4-(2, 2-Dimethyl-4-Phenyl-butyrylamino)-N-Hydroxy-benzamide (HDAC-44) 將溶於 DMF (5 mL) 的 acid (2a, b) (1 mmol)冰溶液，加入 triethyl amine 後再加入 PyBOP (1.1 mmol)。混合液於室溫下攪伴 4 小時，利用 TLC 監測反應完全後，反應混合液冷卻至 0℃。此時加入 Hydroxylamine hydrochloride (1.2 mmol)至混合液中，接著再加入 Triethyl amine (1.5 mmol)，接著將所有混合液於室溫下攪拌作用隔夜。反應完成後，加入水至反應混合液中，過濾出固體產物且以 27.

(24) column chromatography 方法純化而得到產物 HTPB 與 HDAC-44 (3a, b)，其產率為 80 %。. 3a). - 1. H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 11.07 (s, 1H), 10.08(s, 1H), 8.91 (s, 1H), 7.70-7.63 (m, 4H), 7.30-7.16(m, 5H), 2.64-2.60 (t, 2H,J = 7.5 Hz), 2.36-2.32(t,2H, J = 7.5 Hz)1.93-1.85 (m, 2H), 13. CNMR(DMSO,100MHz):δ171.28,163.93,141.79,141.59,128.30,128.28,127.60, 126.95,125.77,118.26,35.76,34.55,26.57 3b) 1H NMR (DMSO, 400 MHz) δ 11.09 (s, 1H), 9.44 (s, 1H), 8.94 (s, 1H), 7.74-7.69 (m, 4H), 7.28-7.13(m, 5H), 2.4 (m, 2H), 1.91-1.87 (m, 2H), 1.21 (s, 6H). 13. CNMR(DMSO,100MHz):δ175.96,164.02,142.15,141.91,128.30,128.16,127.40, 127.23,125.70,119.57,42.84,42.11,30.82,24.97.. 二、研究方法. 1. 模擬分子對接 (molecular docking) 先由蛋白質結構資料庫(Protein Data Bank, http://www.rcsb.org) 下載數個已由 X 光繞射法解出之 HDAC8 與 SAHA 複合體 (PDB code: 1T69)，作為分子對接實驗之蛋白質標的物(target)；將 HTPB 及 HDAC-44 自行以 2D 化學式轉換成 3D 構形，當成實驗中的 ligand。在套裝軟體 DS-Modeling 中根據 HDAC8/SAHA 複合體的資訊，以 SAHA 結合區域為基準定義 ligand 可能的結合區塊。分子對接實 28.

(25) 驗利用軟體中的 Lig_fit 模組，首先會先以 ligand 可旋轉的鍵角，產生數千個以上的分子構形，以蒙地卡羅演算法根據隨機的方式將不同構形的 ligand 塞入起初於蛋白質標的物上定義之結合區塊。根據 ligand 與結合區塊的形狀比對，以及 ligand 方向的變更，計算何種構形可以被接受。軟體並計算該構形的內能、該構形與目標蛋白質之間的能量(包括凡得瓦力及靜電力)，之後可評估何種結合模式最為可能。 2. 細胞培養將 A549、CL1-1、H1299、IMR90 等細胞株以其專用培養基培養於 37oC、5% CO2 培養箱中；細胞株以倒立式顯微鏡觀察，當細胞長滿為單層 (monolayer) 時，即可進行繼代培養 (subculture)。在無菌操作台 (laminar flow) 內，以抽氣機吸去上層液，再以 5 ml 1x phosphate-buffered saline (PBS) 洗細胞一次，吸去 1x PBS (10x PBS： 1.36M NaCl，26.8mM KCl，40.2mM Na2HPO4，17.6mM KH2PO4，pH7.4) 並加 1x trypsin-EDTA 1ml，前後左右搖晃培養皿使 trypsin 均勻分散於細胞層，等待約 2~3 分鐘後，搖晃培養皿同時以倒立式顯微鏡觀察，待細胞層脫落並浮起時，取適當比例的細胞於新的培養基中 (total value 10ml)，以十字型搖散細胞，培養在 37℃，5% CO2 培養箱中；約 2-3 天細胞株長滿，即可再行繼代培養。 29.

(26) 3. 細胞毒殺性之 IC50 檢測 3.1. HDAC 抑制劑單獨處理將細胞以 10 cm 培養皿培養於 37oC、5% CO2 培養箱中；於加藥的前一天取定量細胞 (癌細胞：1×105 ；IMR90 正常肺細胞： 5×105)，種於 6 孔培養盤中培養至隔天。隔天以含有不同濃度 HDAC 抑制劑的培養液培養 48 小時。 3.2. HDAC-44 與 cisplatin 傳統抗癌藥物共同處理將細胞以其專用培養皿培養於 37oC、5% CO2 培養箱中；於加藥的前一天取定量細胞 (2×104)，種於 6-well 培養盤中培養至隔天。隔天加入不同濃度 (1/2 倍或 1/4 倍 IC50 濃度) HDAC 抑制劑，於 370C 培養 48 小時後，將培養液移除，利用 1x PBS 清洗兩次，再加入不同濃度 (1/2 倍或 1/4 倍 IC50 濃度 ) 的傳統抗癌藥物 cisplatin 處理 4 小時。隨後用 1x PBS 沖洗兩次，置換成新鮮的培養液培養 48 小時。本實驗共有三組控制組：只處理 DMSO 組、單獨處理 HDAC-44 作用 48 小時、單獨處理 cisplatin 作用 4 小時組。 3.3. Trypan Blue exclusion assay 細胞於藥物作用後，取 20 μl 的細胞液加入 20 μl 的 Trypan 30.

(27) Blue 後，混合均勻。存活的細胞由於具有完整的細胞膜，可阻止染劑進入細胞內，因此呈現亮亮的圓點。之後利用血球計數器計算細胞的存活數，並利用 excel 軟體繪圖且計算出新穎抗癌藥物使肺癌細胞死亡達 50%所需的藥物濃度 (IC50) 為何。. 4. 細胞週期 (Cell cycle) 的檢測取 2×106 個細胞，以 70% 酒精靜置在-20℃冰箱中放置隔夜，以固定細胞，在 4℃ 下 900 rpm 離心 5 分鐘，吸除上清液，將細胞團塊打散，加入 5 ml 1x PBS 清洗細胞兩次。加入 1 ml 1x PBS 染色液 (內含 0.1% Tritonx-X，0.2 mg/ml RNase A，20 μg/ml PI)，將細胞團塊均勻地打散，並旋轉混合，在 37℃ 暗室中作用 15 分鐘。上機前混勻樣品，並以 35-μm 尼龍篩網過濾樣品。以流式細胞儀 (FACScan FLOW cytometry, BD, Mountain View, CA) 偵測細胞中 PI 的螢光強度，估算約兩萬顆細胞的 DNA 含量 (DNA content) 分佈，以界定細胞週期的各個階段，並利用 ModFit LT Version 2.0 計算各週期細胞所佔的比例。若細胞因藥物處理而影響了原本的細胞週期，則機器偵測到的 DNA 分佈含量會與未處理藥物的樣本不同。包括 G1、S、G2 和 M。G1 代表“GAP 1” (細胞間期 1)，S 代表“Synthesis” (合成)，為 DNA 進行複製的階段。G2 代表“GAP 2” (細胞間期 2)， 31.

(28) M 代表“mitosis” (有絲分裂)，為進行核裂 (染色體分離) 和質裂 (cytokinesis，細胞質分裂) 的階段。若在 G1 前期 (sub-G1) 偵測到細胞，則表示細胞可能經歷細胞凋亡而導致 DNA 片斷化的情形。. 5. DNA 片斷化分析 (DNA ladder assay) 取 2×106 個細胞，以 70% 酒精靜置在 -20℃ 冰箱中放置隔夜以固定細胞，在 4℃ 下 900 rpm 離心 5 分鐘，移除酒精，將細胞彈散並加入 50 μl DNA extraction buffer (0.2M phosphate-Citrate buffer, pH 7.8) 到微離心管中，與細胞均勻混合 (vortex)，接著以 37℃ 培養 30 分鐘，以 1500 Xg 離心 10 分鐘，取 40 μl 上淸液至新的微離心管並加入 5 μl DNase-free 的 RNase，以 37℃ 培養 30 分鐘後，再加入 5 μl 20 mg/ml 的 proteinase K，以 37℃ 培養 30 分鐘後，將所有的產物加入 10 倍的 sample buffer loading dye 混合均勻後，進行電泳膠體分析 (2％ agarose gel，50V 約 2 小時 30 分鐘)。. 6. 細胞免疫染色 (Immunocytochemical analysis, ICC) 將細胞種於 6-cm 培養基上操作以下步驟。移除培養液以 1x PBS 沖洗兩次，利用冰甲醇於 -20℃ 固定 20 分鐘，移除甲醇並放. 32.

(29) 於室溫下讓甲醇完全揮發乾燥。接著於室溫下利用 PBS-T (1x PBS, 0.1% tween-20) 復水 10 分鐘兩次，移除 PBS-T，用油性色筆 (Daco pan) 圈選適當的區域。以一級抗體，α-tubulin (1：200，Upstate) 於 37℃ 下作用 1 小時，再以 PBS-T 沖洗兩次，每次 5 分鐘。之後以二級抗體 anti-mouse (1：200) 於 37℃ 下避光作用 30 分鐘。染二級抗體的同時可加入 DAPI 染細胞核。以 PBS-T 沖洗兩次，每次 5 分鐘。利用螢光顯微鏡觀察結果並拍照。. 7. 西方點墨法分析 (Western blotting analysis) 分析藥物 Time-dependent 實驗時，於加藥的前一天取定量細胞種於 10 cm 細胞培養基中培養至隔天後，於不同時間點加入藥物，處理指定時間後，使用細胞刮取器 (scrapper) 收下每盤細胞。分析藥物 Dose-dependent 實驗時，於加藥的前一天取定量細胞種於 10 cm 細胞培養基中培養至隔天後，加入不同指定濃度之藥物，處理固定時間後，使用細胞刮取器 (scrapper) 收下每盤細胞。 7.1. 蛋白質萃取收取藥物處理的細胞，將細胞打散並加入適量的 1x RIPA [50mM Tris pH8.0, 150mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 5mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), 10mg/ml 33.

(30) leupeptin, 20mM sodium phosphate pH7.0] 混合均勻，在 4℃ 下旋轉作用 10 分鐘後，13000 rpm 4℃ 離心 10 分鐘，將上清液移至新的微離心管中，以進行蛋白質定量，剩餘蛋白質存放於 -80℃ 冰箱中保存備用。 7.2. 蛋白質定量採用 Bio-Rad DC (Detergent-Compatible) Protein Assay 之方法定量蛋白質濃度。 7.3. 電泳轉漬取 40μg 蛋白質加入樣品緩衝液 (3 倍 sample buffer，包括 350mM Tris-HCl pH 6.8, 12% SDS, 0.02% bromophenol blue, 35% glycero1, 30% mercaptoethnol) 於 95℃ 煮沸 10 分鐘後，開始進行 SDS-PAGE (4% stacking gel 及 12% running gel) 膠體電泳分析。 SDS-PAGE 先以電壓 80 伏特進行 15~30 分鐘後，再將電壓調至 160 伏特進行電泳 90~120 分鐘。 7.4. 免疫呈色將 SDS-PAGE 上的蛋白質轉漬到先前用甲醇浸潤過的 PVDF 膜上，之後將膜取出並浸泡於 blocking solution (5% skim milk in TBS-T)，室溫下作用 1 小時後，以 TBS-T (Tris Buffered saline-0.1% 34.

(31) Tween-20) 清洗 3 次，每次 5 分鐘。分別加入一級抗體 anti-acetyl histone H3 (1: 4000, Upstate Inc.)、anti-acetyl histone H4 (1: 500, Upstate Inc.)、anti-acetyl p53 (1:500, Cell Signaling Technology.)、Total p53 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc) 、 GAPDH (1:2000, Novus Biologicals)、ß-actin (1:1500, Abcam Ltd., Cambridge, UK) (詳細分析濃度及廠牌見Table 2)，4℃ 下作用至隔夜，以 TBS-T 清洗 3 次，每次 5 分鐘，並加入二級抗體 HRP-goat anti-rabbit IgG (1：2000, NOVUS)、anti-mouse (1：5000, NOVUS)，於室溫下作用 1 小時後，再以. TBS-T 清洗. 3 次，每次. 5 分鐘。最後用. ECL. Chemiluminescent Western System (Amersham, Arlington Height, IL, USA) 試劑組加在 PVDF 膜上呈色，利用 LAS3000 (FUJIFILM) 冷光儀照相，並利用 MultiGuauge 軟體定量分析蛋白表達量。. 8. RNA 萃取與反轉錄聚合酶鏈鎖反應 [Reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)] 利用 TRIZOL (GIBCO BRL, Life Technology, USA) 萃取 RNA。再利用 Thermoscript RT-PCR System kit (Invitrogen)，將分離的 mRNA 反轉錄合成 cDNA，並根據 (Table 3) 的引子 (primer)，最後利用目標基因與控制基因之多重聚合反應 (multiplex-PCR) 進行分析。為了定. 35.

(32) 量 multiplex RT-PCR 中基因的表現，以 GAPDH 或 β-actin 基因當作控制基因，以偵測欲偵測之目標基因其 mRNA 表現量是否受到 HDAC 抑制劑的影響。. 9. 即時反轉錄聚合酶鏈鎖反應 (Real-time RT-PCR). 利用即時定量 PCR 系統 [ABI PRISM 7000 (version 1.1 software)]，以測量不同樣本間目標基因之 mRNA 相對的定量值。根據 Table 3 的引子進行 PCR 增幅反應時，SYBR Green 染劑可嵌入擴增的 DNA 中。故當 PCR 產物越多，SYBR Green 染劑嵌入越多 DNA 而釋放出較多的螢光被電腦所即時偵測，得到目標基因之 Ct 值，再將 Ct 值轉換為定量值。本實驗利用 β-actin 基因當作控制基因。將不同樣本間的目標基因之定量值除以 β-actin 基因之定量值，計算出的結果利用 excel 軟體繪圖呈現。. 10. 進行 HDAC 抑制劑所影響的基因體廣泛分析（Genome-wild analysis） 10.1. 染色質沈澱分析法（Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay）. 36.

(33) 利用 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit (upstate, catalog # 17-295) 萃取DNA，方法簡述如下：細胞經藥物處理後，移除細胞培養液，用 5ml 1x PBS 清洗兩次，加入 10 mL 1x PBS，且加入 280 μL 37%的甲醛 (終濃度為1%)，在室溫處理 10 分鐘，目的是將 DNA 與染色質鍵結 (DNA-chromatin crosslinks)。然後透過 0.125 M 之 glycin 於 37℃ 下作用 5 分鐘以終止鍵結反應。移除 1x PBS 且以 1X 冷 PBS 沖洗兩次，再加入適量的 1x PBS ( 內含 2μL/mL proteinase inhibitor cocktail, PIC) 刮取細胞，以1600 rpm，4oC 離心 5 分鐘，將 DNA 與染色質鍵結之細胞收下。加入適量 SDS Lysis Buffer 於冰上作用 10 分鐘。接著以超音波震盪器 (Sonicator) 將細胞核打破，並將染色質 DNA 片斷化成大約 200 bp ~ 1000 bp 的平均長度。4oC 離心 13000 rpm 10分鐘，取含有 DNA 片斷的上清液分至 2 mL 微離心管中 (每管分入 200 μL 上清液) ，並且加入1800 μL ChIP Dilution Buffer ，接著再加入. 75 μL. Protein A. Agarose/Salmon Sperm DNA (50% Slurry) 於 4oC 處理 30 分鐘後， 4oC 離心 5000 rpm，5 分鐘，取上清液並保持一部份上清液以做為未來實驗中總量染色質 (input) DNA之正控制組 (Positive control, P)。再以 5μg anti-acetyl histone H3 (Upstate Inc.) 之專一抗體於 4oC 混和處理至隔夜，另一組則加入 5μg normal rabbit IgG 以做為未來實. 37.

(34) 驗之負控制組 (Negative control, N)。接著，加入60 μL. Protein A. Agarose/Salmon Sperm DNA (50% Slurry) 於 4oC 混和處理 1 小時後，4oC 離心 2000 rpm，5 分鐘，移除上清液。再以 1000 μL 之以下溶液依序旋轉清洗 protein A agarose/antibody/histone complex 5分鐘，4oC離心 2000 rpm，5 分鐘；溶液有：Low Salt Immune Complex Wash Buffer 沖洗一次；High Salt Immune Complex Wash Buffer 沖洗一次；LiCl Immune Complex Wash Buffer 沖洗一次；TE Buffer 沖洗兩次。protein A agarose/antibody/histone complex 沖洗後，加入新鮮現配的 elution buffer (1%SDS, 0.1M NaHCO3)，於室溫下，以每次震盪 (Vortex) 至少 15 分鐘的方式洗提兩次，4oC離心 13000 rpm，5 分鐘，兩次共洗提下約 500 μl。接著，加入 20 μL 5M NaCl，以 65oC 處理 4 小時以打斷 (de-crosslink) 甲醛所造成之DNA與蛋白質鍵結物。500 μL 洗提液 (elutes) 再加入10 μL 的 0.5 M EDTA、20 μL 的 1 M Tris-HCl, pH 6.5 及 2 μL 的 10 mg/mL Proteinase K 等，於 45℃ 下作用 1 小時。最後，以 phenol/chloroform 萃取 DNA，利用冰 isopropanol 於 -20℃ 將DNA沉澱下來，且以 70% 冰酒精沖洗 DNA ，純化沉澱下的 DNA 溶於二次滅菌水中，將繼續進行 ChIP-on-chip 及 ChIP-PCR 分析。. 38.

(35) 10.2. 染色質沈澱晶片分析（ChIP-on-chip assay）上述 ChIP 的方法可以用 anti-acetyl histone H3 專一性抗體選擇性地將乙醯化的組蛋白所結合之核染色質 DNA 沈澱並純化出來，再以 CpG 島群庫 (CpG island library) 的 DNA 所點製的微矩陣晶片 microarrays (Agilent Technologies, USA)，即可以全基因體層次 (genome-wide level) 調查乙醯化的組蛋白所結合之核染質 DNA 基因為何。步驟概述如下： Blunt the DNA ends： ChIP 所沈澱下來的 DNA (IP DNA) 進行過 sonication，因此有些 DNA 片段的末端會有 overhang end，為了將 DNA 接上 linker 進行 PCR，必須將所有 DNA 片段的末端變成 blunt end。取 ChIP 所沈澱下來的 DNA 200ng，10X NE Buffer 2 (NEB) 11 μL、10 μg/μL BSA (NEB) 0.5 μL、dNTP (10mM) 1.1 μL、3U/μL T4 DNA polymerase (NEB) 0.5 μL，加 ddH2O 至總體積為 110 μL，將樣本放入 PCR 機器中，進行 12℃ 40 分鐘處理，之後置於冰上，加入 3M sodium acetate 11.5 μL 及 20 μg/μL glycogen 0.5 μL ，混合均勻後加入 120 μL Phenol:Chloroform 進行純化，並利用 isopropanol 進行 DNA 沈澱，之後溶於 25 μL ddH2O。. 39.

(36) Prepare linkers for ligation mediated PCR (LM-PCR)： ChIP 所沈澱下來的 DNA 必須接上 linker 才能進行 PCR 放大. ，. 所. 以. 必. 須. 先. 利. oligo. 用. (5’-GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTC-3’). 及. oligo. JW102 JW103. (5’-GAATTCAGATC-3’) 進行 linkers 製作。取 Tris-HCl (1M, PH=8.0) 25 μL、JW102 (100 μM) 15 μL、JW103 (100 μM) 15 μL 及 ddH2O 45 μL，混合後利用 PCR 機器進行下列反應：95℃ 10 分鐘，70℃ 3 分鐘，然後以每秒 0.4℃ 降溫至 4℃，之後將 linkers 置於 -20℃ 冰箱保存。 Linker ligation：為了將 linker 接上 whole cell extract (WCE) DNA 及 ChIP 所沈澱下來的 DNA (IP DNA)，利用下列方法進行：取 WCE DNA 及 ChIP 所沈澱下來的 DNA 各 25 μL 置於不同 tube 中，分別加入 10X T4 ligase buffer (NEB) 5 μL、15 μM linkers 6.7 μL、400 U/μL T4 DNA ligase (NEB) 0.5 μL 及 12.8 μL 的 ddH2O，將樣本混合後置於 16℃ 中 16 小時，之後加入 3 M sodium acetate 6 μL 及 130 μL isopropanol 進行 DNA 沈澱，乾燥後加入 25μL ddH2O 回溶。 Amplify the IP and WCE sample (LM-PCR)：為了將樣本進行 PCR 放大，故取經過 liker ligation 的 WCE 40.

(37) DNA 及 ChIP 所沈澱下來的 DNA 各 25 μL 置於不同 tube 中，分別加入 10X Thermopol buffer (NEB) 5 μL、dNTP (2.5 mM) 5 μL、oligo JW102 (40 μM) 1.25 μL、2 U/μL Deep VentR (exo-) DNA polymerase 1 μL 及 12.75 μL 的 ddH2O，進行下列的第一次 PCR 反應：55℃ 4 分鐘、72℃ 3 分鐘、95℃ 2 分鐘，之後進行 15 cycles 的下列反應： 95℃ 30 秒、60℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘，最後進行 72℃ 5 分鐘。將 50 μL PCR 產物轉移至 1.5 mL 的 tube 中，加入 475 μL 的 ddH2O，混勻後取 5 μL 進行第二次 PCR。5μL 一次 PCR 產物加入 10X Thermopol buffer (NEB) 5 μL、dNTP (2.5 mM) 5 μL、oligo JW102 (40 μM) 1.25 μL、2 U/μL Deep VentR (exo-) DNA polymerase 1 μL 及 33.25 μL 的 ddH2O，PCR 溫度如下：95℃ 2 分鐘，25 cycles 的 95℃ 30 秒、60℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘，72℃ 5 分鐘，之後將 PCR 產物轉移至 1.5 mL tube，加入 7.5 M Ammonium acetate 25μL 及 99.5% Ethanol 225 μL 進行 DNA 沈澱，最後溶於 50 μL 的 ddH2O，並將 DNA 濃度定量至 100 ng/μl。 Label the IP and WCE sample with CyDye：使用 Invitrogen CGH kits (Invitrogen, USA, catalog #18095-011) 進行螢光標定。取 LM-PCR 產物 (100 ng/μL) 20 μL，加入 2.5X random primer solution 35 μL 及 20 μL ddH2O，混勻後加熱至 95℃, 5 分鐘， 41.

(38) 快速置於冰上，靜置 5 分鐘後加入 10X dUTP nucleotide mix 8.2 μL、ddH2O 1.8μL、IP 及 WCE 樣本分別加入 1 mM 的 Cy5- 及 Cy3-dUTP 1.5 μL，最後加入 40 U/μl Klenow 1.5 μL，置於避光的 37℃ 水浴槽中 3 小時。之後分別加入 9 μL 的 stop buffer 至各樣品中，然後用 Invitrogen’s CGH column 進行樣品純化，最後得到 50 μL 螢光標定之樣品。使用分光光度計進行螢光標定量及 DNA 濃度測量， Cy3 的樣本標定量要大於 3.5 pmol/μL，Cy5 的樣本標定量要大於 2.5 pmol/μL，而每個樣本的 DNA 總濃度要大於 5 μg。 Hybridize the microarray：利用 Agilent Human CpG Island ChIP-on-Chip Set 244K (Catalog #G4492A)晶片進行雜合反應。取 Cy3 及 Cy5 標定樣品各 5 μg 混合，加入 ddH2O 定量至 150 μL，並加入 50 μL Human Cot-1 DNA (1.0 mg/mL) 、 10X Agilent blocking agent 50 μL 及 2X Agilent hybridization buffer 250 μL，將樣品置於 95℃ 加熱器中 3 分鐘，之後於 37℃ 水浴槽中反應 30 分鐘，取 490μL 樣本與晶片進行雜合反應，將晶片放入 Agilent Hybridization chamber (Catalog #G2534A) 中，置於烘箱的旋轉架上，旋轉速度為 10~20 rpm，65℃ 反應 40 小時。以上所有反應皆須避光進行。. 42.

(39) Wash and scan the slides：在室溫的 Agilent oligo aCGH/ChIP-on-chip wash buffer 1 (Catalog #5188-5221) 中，將晶片與蓋玻片分離，換至另一缸的 wash buffer 1 中，室溫洗 5 分鐘，之後置入預先加熱至 31℃ 的 Agilent oligo aCGH/ChIP-on-chip wash buffer 2 (Catalog #5188-5222) 中，洗 5 分鐘，之後利用離心機 1800 rpm，2 分鐘來去除晶片上的 buffer。以上所有反應皆須避光進行。清洗後的晶片，使用 Axon GenePix 4000B scanner，以 5 μm 解析度進行掃瞄，並利用 Agilent Feature Extraction 9.5 軟體進行影像量化及校正，最後運用 Agilent Launch ChIP Analytics 1.3 軟體進行資料分析。. 43.

(40) 陸、結果. 一、新穎 HDAC 抑制劑，HDAC-44 及 HTPB，可與 HDAC8 活性區結合本研究所取得之兩種新穎的HDAC抑制劑是由美國俄亥俄州州立大學陳慶士教授設計出， N-Hydroxy-4-(4-phenyl butyrylamino)benzamide. (HTPB). 與. 4-(2,2-Dimethyl-4-phenyl-. butyrylamino)-N-hydroxy-benzamide (HDAC-44)；此二種化合物更進一步由師大化學系陳建添教授簡化成 2-step合成法製備（請見「材料方法」）。由於現今研究以及NCBI資料庫中只有唯一一種人類HDAC蛋白質，HDAC 8，與HDAC抑制劑進行結合分析；因此我們請中興大學徐駿森教授進行 HTPB 和 HDAC-44 等新穎 HDAC 抑制劑與 HDAC8 的分子模擬分析 (Molecular docking anaylsis) (Fig. 6B)，推測這兩種新穎 HDAC 抑制劑的確可以有效的與 HDAC8 結合以抑制其活性。. 二、新穎 HDAC 抑制劑，HDAC-44 與 HTPB，皆可有效促使組蛋白 H3 和 H4 以及非組蛋白 p53 的乙醯化接著我們想確認新穎的 HDAC 抑制劑，HDAC-44 與 HTPB，是否在短時間內，即可以有效的抑制 HDACs 的活性，以促使蛋白質 44.

(41) 的乙醯化。首先，我們將 CL1-1 肺癌細胞處理不同濃度的 HDAC-44、 HTPB 與 SAHA 作用 6 小時後，萃取蛋白質並且定量，利用西方點墨法分析組織蛋白 H3 和 H4，以及非組織蛋白 p53 的乙醯化程度。發現於短時間 6 小時內，CL1-1 隨著處理的 HDAC-44、HTPB 與 SAHA 藥物劑量的升高，其組織蛋白 H3 和 H4，以及非組織蛋白 p53 的乙醯化程度有上升的趨勢 (Fig. 7A)。此外，利用軟體定量各蛋白質訊號表達程度並繪圖，可發現相較於 SAHA 與 HTPB， HDAC-44 可以最有效的促使組織蛋白 H3 和 H4，以及非組織蛋白 p53 的乙醯化 (Fig. 7B)。接著，我們將 CL1-1、A549 與 H1299 處理 2.5 μM HDAC-44、 5 μM HTPB 或 5 μM SAHA 作用 0、6、12、24、48 小時後，進行蛋白質萃取以及定量後，並利用西方點墨法分析。CL1-1 與 A549 肺癌細胞株經 HDAC 抑制劑處理六小時後，p53、組織蛋白 H3 與 H4 乙醯化程度皆明顯的上升，組織蛋白 H3 與 H4 乙醯化程度可持續增加至 24 ~ 48 小時，但 p53 乙醯化程度於 6 ~ 12 小時 (CL1-1) 或 24 小時 (A549) 達到高峰，之後則有乙醯化程度下降的趨勢 (Fig. 8A)。而 H1299 (p53 null) 的肺癌細胞株經藥物處理 6 小時後，其組織蛋白 H3 與 H4 乙醯化情形也可維持或持續增加至 24 ~ 48 小時. 45.

(42) (Fig. 8A)。但是此三株細胞的 HDAC1 與 HDAC6 的蛋白表達量則不受 HDAC 抑制劑影響 (Fig. 8A)。此外，利用軟體定量各蛋白質訊號表達程度並繪圖，可發現 CL1-1 細胞處理 HDAC-44 作用不同的時間點後，其可以最有效的促使組織蛋白 H3 和 H4，以及非組織蛋白 p53 的乙醯化 (Fig. 8B)。. 三、新穎 HDAC 抑制劑， HDAC-44 與 HTPB，皆可有效促使 p21WAF1/Cip1 與 Tissue inhibitor of metalloproteinase-3 (TIMP3) 的基因轉綠活化我們將 CL1-1、A549 與 H1299 處理 2.5 μM HDAC-44、5 μM HTPB 或 5 μM SAHA 作用 0、6、12、24、48 小時後，萃取 RNA，進行 RT-PCR，利用膠體電泳分析結果；或是將細胞萃取物進行西方點墨法分析。可以發現隨著藥物處理細胞時間的增加，CL1-1 (p53 mutant)、A549 (p53 wild type) 以及 H1299 (p53 null) 等肺癌細胞株，其 p21WAF1/Cip1 mRNA (Fig. 9A) 與蛋白質 (Fig. 9B) 皆有表達上升的趨勢；而 TIMP3 mRNA 也有轉綠活化的現象 (Fig. 9A)。進一步的，將 A549 處理不同 HDAC 抑制劑之 RNA 進行 real-time RT-PCR，可以發現相較於 HTPB 與 SAHA，HDAC-44 其可最有效的增加 p21WAF1/Cip1 mRNA 的表達(Fig. 9)。此外，將 H1299 細胞萃 46.

(43) 取物進行西方點墨法分析，意外發現其 Bcl-2 蛋白表達量有上升的趨勢 (Fig. 9B)，與 CL1-1 及 A549 其 Bcl-2 蛋白表達量下降的現象不同 (Fig. 15B)。. 四、藥物 HDAC-44 與 HTPB 可有效率的導致肺癌細胞死亡由以上的實驗確定新穎 HDAC 抑制劑確實可以效促使蛋白質乙醯化且促使基因轉錄的活化；因此進而評估新穎 HDAC 抑制劑， HDAC-44 與 HTPB，相較於已知的 HDAC 抑制劑 SAHA 下，他們毒殺 CL1-1 (p53 mutant)、A549 (p53 wild type) 以及 H1299 (p53 null) 等肺癌細胞株的能力，以及他們對 IMR90 正常肺細胞的影響。以不同濃度（0.5 μM 至 10 μM）之 HDAC-44、HTPB 和 SAHA，處理 A549、CL1-1、H1299 以及 IMR90 等四株細胞 48 小時後，利用 Trypan Blue exclusion assay 評估藥物對細胞的毒殺性。這三種 HDAC 抑制劑皆顯示對 A549、CL1-1 與 H1299 等肺癌細胞株的存活率有明顯地抑制，但是對於 IMR90 正常肺細胞株的存活率卻沒有明顯的影響 (Figs. 11A-C)。將結果以回歸曲線推算其 IC50 (Fig. 11D)，可以發現相較於 HTPB 與 SAHA 下，HDAC-44 其對三株肺癌細胞株的 IC50 值最低，表示 HDAC-44 對肺癌細胞的毒殺性最強。. 47.

(44) 五、結合 HDAC 抑制劑與傳統化療藥物 cisplatin，可加成性的抑制肺癌細胞的生長 Cisplatin 為現今癌症的臨床化療藥物，其可與 DNA 形成 DNA adduct，抑制 DNA 複製並促使細胞於分裂時無法正常分離染色體而導致細胞死亡。因此希望了解若將傳統的化療藥物 cisplatin 搭配上新穎的 HDAC 抑制劑 HDAC-44 是否可以加成性的抑制癌細胞的生長。本實驗將 CL1-1 細胞利用低劑量 (1/2 IC50 濃度) 的 cisplatin (4.4 μM) 單獨處理 4 小時或 HDAC-44 (0.3 μM) 單獨處理作用 48 小時，而 A549 則利用低劑量（1/4 IC50 濃度）的 cisplatin (1.6 μM) 單獨處理 4 小時與 HDAC-44 (0.2 μM) 單獨處理 48 小時。可以發現 CL1-1 與 A549 在單獨處理低劑量的 cisplatin 作用 4 小時或 HDAC-44 作用 48 小時後，細胞皆還有 80% 以上的存活率 (Fig. 12)。但是若先將細胞處理低劑量的 HDAC-44 作用 48 小時後，移除含有藥物的培養液，再處理肺癌細胞低劑量的 cisplatin 作用 4 個小時後，換回不含有任何藥物的培養液讓細胞回復生長 48 小時，接著利用 Trypan Blue exclusion assay 評估藥物對細胞的毒殺性。可以發現細胞的存活率大大的降低成 22.2% (CL1-1) 與 50.6% (A549)，有毒殺肺癌細胞的加成功效 (Fig. 12)。. 48.

(45) 六、HDAC-44、HTPB 以及 SAHA 等 HDAC 抑制劑，皆可以有效促使細胞週期停止於 G2/M 期，並且導致細胞凋亡經以上的實驗證實，新穎的 HDAC 抑制劑，HDAC-44 及 HTPB 的確可以有效的抑制肺癌細胞的生長，因此我們希望了解其原因為何。首先我們進行細胞週期的檢測：以 DMSO 控制組、2.5 μM HDAC-44、5 μM HTPB 以及 5 μM SAHA 處理 A549 與 H1299 等肺癌細胞株作用 48 小時後，利用 flow cytometry 觀察其細胞週期變化，並且利用 Modfit 軟體分析細胞週期分佈比例。A549 細胞株經 HDAC 抑制劑處理 48 小時後，其 G2/M 期由 6.24% 增加到 20% ~ 31%，而代表細胞有凋亡現象的 sub-G1 期則由 4.55% 增加到 41%~54% (Fig. 13A)。H1299 細胞株經藥物處理 48 小時後，其 G2/M 期則由 12.45% 增加到 31% ~ 38% ，而 sub-G1 期則由 1.96% 增加到 10% ~ 22% (Fig. 13B)。可以發現 HDAC-44、HTPB 及 SAHA 皆可以有效的促使不同的肺癌細胞珠 A549 或 H1299 的細胞週期停止於 G2/M 期無法分裂生長，此外細胞分佈於 sub-G1 的比例也明顯增加，顯示 HDAC 抑制劑有促進細胞凋亡的現象 (Fig. 13)。此外，利用 2.5 μM HDAC-44 處理 A549 或 H1299 細胞株 24 小時及 48 小時等時間點。藥物處理 A549 細胞株 24 小時下，其 49.

(46) G2/M 期由 12.24% 增加到 42.56%，但其 sub-G1 期則沒有明顯增加，必須等至藥物處理 48 小時後其 sub-G1 才由 0.69% 增加到 26.3% (Fig. 14A)。類似的現象也在 H1299 肺癌細胞株出現，H1299 細胞株經藥物處理 24 小時後，其 G2/M 期由 12.24% 增加到 24.3%，但其 sub-G1 期則沒有明顯增加，必須等至藥物處理 48 小時後其 sub-G1 才由 1.41% 增加到 16.16% (Fig. 14B)。可以發現細胞在經 HDAC-44 處理 24 小時後，即會導致細胞週期開始停止在 G2/M 期，但必須等至 48 小時之後才會出現明顯的 sub-G1，發生細胞凋亡 (Fig. 14)。. 七、HDAC-44、HTPB 與 SAHA 等 HDAC 抑制劑皆可有效的促使肺癌細胞產生 DNA ladder 以及 Bcl-2 表達下降等細胞凋亡的現象除了細胞週期檢測外，我們更進一步的進行其他細胞凋亡現象的檢測：DNA ladder 的產生與抗細胞凋亡蛋白 Bcl-2 表達情形。在 DNA ladder 的實驗中，我們以 DMSO 作為控制組，利用 5 μM HDAC-44、10 μM HTPB、或 10 μM SAHA 處理 A549 肺癌細胞株作用 48 小時後，利用膠體電泳分析細胞凋亡的特徵 DNA ladder。發現三種 HDAC 抑制劑的個別處理下，肺癌細胞皆會出現細胞凋亡的特徵 DNA ladder；而在 DMSO 控制組，則只能看到完整而未受. 50.

(47) 切割的基因組 DNA，不會有 DNA ladder 現象的產生 (Fig. 15A)。此外，以 2.5 μM HDAC-44、5 μM HTPB、或 5 μM SAHA 處理 A549 及 CL1-1 等肺癌細胞株作用 0、6、12、24、48 小時後，進行蛋白質萃取以及定量後，利用西方點墨法分析。可發現在 A549 及 CL1-1 其抗細胞凋亡 (anti-apoptosis) 之蛋白質分子 Bcl-2，隨著藥物處理時間的增加，Bcl-2. 蛋白表達有逐漸下降的趨勢 (Fig. 15B)。. 八、藉由細胞免疫染色再次證實，HDAC-44、HTPB 及 SAHA 可有效促使細胞週期停止於 G2/M 期、染色質分裂抑制、細胞凋亡與細胞骨架不正常等現象利用 DMSO 或 2.5 μM HDAC-44 處理肺癌細胞株 H1299、 A549 與 CL1-1 作用 48 小時後，進行細胞免疫染色。利用 α-tubulin 抗體染細胞骨架蛋白（呈綠色），DAPI 染細胞核（呈藍色）。可發現三株肺癌細胞皆出現細胞質無法分裂的雙核或多核（紅色箭頭）現象，以及細胞週期停止於 G2/M 期（細胞核變大）等現象。而在 H1299 與 CL1-1 等肺癌細胞株，發現其細胞骨架呈現不正常分布（綠色箭頭）。此外在 A549 與 CL1-1 更發現有細胞核濃縮 (condensation)、與破碎 (fragmentation)（藍色箭頭）等細胞凋亡現象 (Fig. 16)。. 51.

(48) 九、ChIP-on-chip data 顯示 HDAC 抑制劑可促使三株肺癌細胞株共 52 個基因座之組蛋白乙醯化程度上升，且共參予 38 條路徑 ChIP-on-chip 分析的結果初步顯示，HDAC-44 可以專一性的促使肺癌細胞某些基因座上的組蛋白乙醯化：A549 共有 602 個基因其組蛋白會被 HDAC-44 乙醯化；CL1-1 共有 1046 個基因其組蛋白會被 HDAC-44 乙醯化；H1299 共有 502 個基因其組蛋白會被 HDAC-44 乙醯化。將三株肺癌細胞株皆受 HDAC-44 影響的基因取交集，共有 52 個基因其組蛋白會被 HDAC-44 乙醯化(Fig. 17A)。此 52. 個. 基. 因. ，. 利. 用. (http://ibs.sinica.edu.tw/~chenyian/crosspath/). 網. 站. CrossPath. 進行路徑 (pathway. analysis) (KEGG)，發現其中有 13 個基因共參予 38 個路徑 (Fig. 17B)。本研究未來將進行 ChIP-PCR 分析，以確定這些基因組蛋白會否會被 HDAC-44 乙醯化，並且將進一步探討 HDAC 抑制劑的抗癌機制之目標基因群。. 52.

(49) 柒、討論首先，我們進行分子模擬分析，認為新穎的 HDAC 抑制劑，HDAC 44 與 HTPB，可以與人類 HDAC 8 活性區結合；因此我們進行 Western blot analysis 希望確認新穎的 HDAC 抑制劑，HDAC-44 與 HTPB 是否可以有效的促使蛋白質的乙醯化。由實驗結果可知，新穎的 HDAC 抑制劑在短時間 6 個小時內的確可以有效的增加組織蛋白 (Fig. 7A) 與非組織蛋白 p53 的乙醯化程度，其中又以 HDAC-44 促使蛋白質乙醯化的效率最好 (Fig. 7B)。而 HDAC 抑制劑促使的組織蛋白 H3、 H4 的乙醯化可以一值維持到 24 小時至 48 小時，但 p53 蛋白的乙醯化於 12 小時到達高峰後卻開始下降 (Fig. 8B)，猜測可能有第三類的 HDAC 蛋白 (SIRT1-7) 恢復了 p53 蛋白的去乙醯化。此外，我們也發現 HDAC 抑制劑並不會影響第一類的 HDAC 蛋白質 HDAC1 與第二類的 HDAC 蛋白質 HDAC6 的蛋白表達量 (Fig. 8A)。推測 HDAC 抑制劑的確是藉著抑制 HDAC 的活性而非表達以提升蛋白的乙醯化程度。. 另外我們也進行 RT-PCR 與 Western blot analysis 確定新穎的 HDAC 抑制劑，HDAC-44 與 HTPB，的確可以有效的將 CL1-1 (p53 mutant)、A549 (p53 +/+) 以及 H1299 (p53 -/-) 的 p21WAF1/Cip1 的轉錄活 53.

(50) 化 (Fig. 9-10)，顯示 HDAC 抑制劑的確可以藉由與 p53 無關的路徑 (p53-indepedent) 而是直接促使 p21WAF1/Cip1 基因的啟動子 (promoter) 區之組蛋白乙醯化而導致 p21WAF1/Cip1 轉錄活化 (46, 47, 49)，因為 H1299 (p53 -/-)的 p21WAF1/Cip1 的轉錄也被活化。 p21WAF1/Cip1 基因的活化可以抑制癌細胞的增生；除了 p21WAF1/Cip1 外，HDAC 抑制劑也可促使抑癌基因 TIMP-3 的轉錄活化 (Fig. 9A) (50, 51)，而 TIMP-3 基因與抑制癌細胞入侵、轉移及血管新生有關 (52)；因此，未來可以進行 HDAC 抑制劑其抑制癌細胞入侵、轉移及血管新生能力的相關研究分析。. 在藥物的細胞毒殺性實驗中，我們使用 HDAC-44、HTPB 及已知的 HDAC 抑制劑 SAHA 處理不同肺癌細胞株 A549、CL1-1、H1299 以及正常肺細胞株 IMR90，結果發現三種 HDAC 抑制劑對肺癌細胞株有很強的細胞毒殺性，但對正常細胞株的存活率卻沒有明顯影響 (Fig. 11A-C)，此結果與文獻有類似的現象；例如 HDAC 抑制劑可以有效的抑制前列腺癌細胞生長，但正常的前列腺上皮細胞株則對 HDAC 抑制劑較不敏感 (45)。文獻也顯示，TSA 可以專一性的只活化癌細胞的抑癌基因 p21WAF1/Cip1 的表達且抑制 ErbB2 的基因表達，但不影響正常細胞的 p21WAF1/Cip1 與 ErbB2 表達 (46)；因此我們認為， HDAC 抑制劑具有良好的細胞毒殺選擇性。推測原因可能是在癌細 54.

(51) 胞中 HDACs 的活性或表達具有不正常的增加，但正常細胞則否，而 HDAC 抑制劑即可專一性的針對癌細胞中不正常的 HDAC 活性做抑制。. 新穎的 HDAC 抑制劑 HDAC-44 對三株肺癌細胞的 IC50 值皆為最低 (Fig. 11D)，且其對細胞的 IC50 亦較 HTPB 與 SAHA 低了許多，表示其細胞毒殺性最好，可以最有效的毒殺肺癌細胞株；因此，我們對 HDAC-44 毒殺癌細胞的影響具有更深的興趣，故我們選用 HDAC-44 搭配目前臨床上使用的化療藥物 cisplatin 共同處理肺癌細胞，觀察在此方法下對癌細胞是否具加成性的毒殺性。在此實驗中，我們刻意使用非常低劑量的 HDAC-44 與 cisplatin 單獨或共同處理癌細胞；HDAC-44 與 cisplatin 在低劑量下單獨處理肺癌細胞，肺癌細胞的存活率皆還高達 80% 以上，但可發現若先處理低劑量的 HDAC-44 後，再接著處理低劑量的 cisplatin，癌細胞的存活率會大大的降低 (Fig. 12)，對細胞的毒殺有加成性的影響，即使是對 cisplatin 有較高抗藥性的 CL1-1 肺癌細胞株也一樣；而目前的文獻將癌細胞前處理 SAHA 或 TSA 後，再搭配處理 cisplatin，也顯示有加乘的促使癌細胞死亡結果 (11)。Cisplatin 毒殺癌細胞的原理為，其可與 DNA 形成 DNA adduct，抑制 DNA 複製並促使細胞於分裂時無法正常分離染色體而導致細胞死亡；而我們所使用的 HDAC-44 可以抑制 HDAC 55.

(52) 活性，而增加組織蛋白乙醯化的程度，導致染色質結構疏鬆。因此先處理 HDAC-44 打開染色質結構後再處理 cisplatin，即可以幫助 cisplatin 更有效的嵌入 DNA 中，進而誘發癌細胞死亡，因此在臨床的使用上，或許可以搭配這兩種藥物施予病人，以更有效的抑制病人的腫瘤生長。另外，HDAC-44 與其他的 DNA-targeting 抗癌藥物或是拓墣酶抑制劑類的抗癌藥物的結合使用，也極有可能加乘性的抑制癌細胞的生長。. 本研究接著希望了解 HDAC 抑制劑毒殺癌細胞的作用機轉。我們利用 Flow Cytometry 發現三種 HDAC 抑制劑皆可有效的促使不同的肺癌細胞株停在 G2/M 期 (Fig. 13)，顯示 HDAC 抑制劑會抑制肺癌細胞的細胞核或細胞質分裂，與文獻有相似的結果 (41, 47)。而 HDAC 抑制劑也會導致癌細胞的 sub-G1 增加，顯示 DNA 片斷化，但此現象在細胞處理藥物 48 小時後，sub-G1 期才會明顯增加，出現細胞凋亡現象 (Fig. 14)，顯示細胞凋亡為藥物影響細胞晚期的現象 (48)；例如：在 A549 細胞株中發現 48 小時的 G2/M 期比例較 24 小時的比例為低 (Fig. 14A)，推測可能是由於細胞分裂受抑制的細胞開始產生了細胞凋亡，而導致停在 G2/M 期的細胞變少了。. 此外也發現 A549 (p53 +/+) 的肺癌細胞株比 H1299 (p53 -/-) 的. 56.

(53) 肺癌細胞株對三種 HDAC 抑制劑皆更加敏感 (IC50 值皆較低)，此結果亦與文獻相同 (47)。而在 H1299 細胞株中發現，隨著 HDAC-44 處理細胞的時間增加，其促使的細胞停止在 G2/M 期比例可以更為增加 (Fig. 14B)。推測可能原因為 H1299 缺乏 p53 基因，而無 DNA 傷害反應 (DNA damage response)，因而細胞較不容易死亡 (sub-G1 期比例低) (47)，故有更多的細胞停止於 G2/M 期。此外，我們發現 HDAC 抑制劑會促使 A549 (p53 +/+) 及 CL1-1 (p53 mutant) 肺癌細胞的抗細胞凋亡蛋白 Bcl-2 表達下降(Fig. 15B)，但卻明顯促使 H1299 (p53 -/-) 的肺癌細胞株 Bcl-2 表達上升(Fig. 9B)，推測 H1299 細胞中所觀察到的 Bcl-2 表達上升可能是因為 HDAC 抑制劑促使 H1299 細胞之 Bcl-2 基因座之組蛋白乙醯化而導致 Bcl-2 表現量上升。未來，可以利用 Western blot analysis 的方式，檢查於 H1299 細胞中一些與 G2/M arrest 有關的蛋白質，如：cyclin B、CDC42 等，或其他 anti-apoptosis 類之其他 Bcl-2 蛋白成員。. 由細胞週期檢測中發現細胞無法進行細胞分裂，因此接著我們進行細胞免疫染色，利用 DAPI 染細胞核，anti-α–tubulin 染細胞質中的細胞骨架蛋白 α–tubulin。本研究發現 (Fig. 16) HDAC-44 會導致細胞核變大，顯示細胞或許在經過 DNA 複製後卻無法經歷細胞核分裂；或是細胞出現雙核或多核的現象，就算細胞核進行了分裂，細胞質的 57.

(54) 分裂卻受到抑制；此外，細胞的骨架也出現不正常分佈的現象；並且細胞核也發生 condensation 與 fraction 等細胞凋亡的現象。. 由細胞週期檢測的實驗中我們發現 HDAC 抑制劑可能促使了細胞凋亡，因此我們進行了 DNA ladder assay 及 Western blot analysis 以證實細胞凋亡的現象。DNA ladder 為細胞凋亡晚期的重要指標，由於細胞凋亡的發生而活化內生性核酸水解酶 (endogenous nuclease)，其在 nucleosomes 間的 linker DNA 做切割，造成 DNA 片斷化，為細胞經歷細胞凋亡的有力證據。由實驗結果可知 HDAC 抑制劑的確可以有效的促使癌細胞產生 DNA ladder (Fig. 15A)，經歷細胞凋亡。此外，我們還進行了 Western blot analysis，檢查抗細胞凋亡的 Bcl-2 蛋白的表達情形。發現不同的肺癌細胞株，經處理 HDAC 抑制劑 24 小時與 48 小時後，其 Bcl-2 蛋白的表達會下降 (Fig. 15B)，進一步支持 HDAC 抑制劑可促使細胞凋亡；未來將檢查更多與細胞凋亡有關的蛋白質，如：Bad、Bax、Bcl-X、caspase3 及 caspase9 等蛋白質的表達，以更加確認細胞凋亡的現象。. 此外，本研究為第一篇利用 ChIP-on-chip 方式廣泛大規模尋找 HDAC 抑制劑直接影響了哪些目標基因其 promoter 之組蛋白被乙醯化，以免除文獻利用 cDNA microarray 的方式找尋到非 HDAC 抑制劑. 58.

(55) 在第一時間內影響的基因，這種廣泛大規模 ChIP-on-chip 分析也有助於尋找新穎之目標基因，以進行後續其基因座組蛋白乙醯化機制分析。例如：染色質沈澱的聚合酶鏈鎖反應 (ChIP-PCR)，在 DNA 層次確認目標基因的染色體結構；反轉錄的聚合酶鏈鎖反應 (RT-PCR) ，在 RNA 層次確認目標基因的表現；及西方點墨法 (Western blot) 以觀察目標基因蛋白質的表達。在未來，也可使用不同的 HDACs 抗體進行 ChIP-on-chip 分析，以進一步了解區分不同的 HDACs 是否有其專一影響抑制的基因。. 經以上實驗，我們認為新穎的 HDAC 抑制劑，HDAC-44 與 HTPB，極具有潛力成為新穎的抗肺癌藥物，而 HDAC 抑制劑對其他種類的癌症影響也很值得做進一步的研究。此外，我們也希望篩選中研院的化學藥物庫以尋找出其他新穎的 HDAC 抑制劑做深入研究。. 59.

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