首先，我們進行分子模擬分析，認為新穎的 HDAC 抑制劑，HDAC 44 與 HTPB，可以與人類 HDAC 8 活性區結合；因此我們進行 Western blot analysis 希望確認新穎的 HDAC 抑制劑，HDAC-44 與 HTPB 是否
可以有效的促使蛋白質的乙醯化。由實驗結果可知，新穎的 HDAC 抑制劑在短時間 6 個小時內的確可以有效的增加組織蛋白
(Fig. 7A)
與非組織蛋白p53 的乙醯化程度，其中又以 HDAC-44 促使蛋白質乙 醯化的效率最好
(Fig. 7B)。而
HDAC 抑制劑促使的組織蛋白 H3、H4 的乙醯化可以一值維持到 24 小時至 48 小時，但 p53 蛋白的乙醯
化於12 小時到達高峰後卻開始下降
(Fig. 8B)，猜測可能有第三類的
HDAC 蛋白 (SIRT1-7) 恢復了 p53 蛋白的去乙醯化。此外，我們也發 現 HDAC 抑制劑並不會影響第一類的 HDAC 蛋白質 HDAC1 與第二 類的HDAC 蛋白質 HDAC6 的蛋白表達量(Fig. 8A)。推測
HDAC 抑 制劑的確是藉著抑制 HDAC 的活性而非表達以提升蛋白的乙醯化程 度。另外我們也進行 RT-PCR 與 Western blot analysis 確定新穎的 HDAC 抑制劑，HDAC-44 與 HTPB，的確可以有效的將 CL1-1 (p53
化
(Fig. 9-10)，顯示
HDAC 抑制劑的確可以藉由與 p53 無關的路徑 (p53-indepedent) 而是直接促使 p21WAF1/Cip1 基因的啟動子 (promoter)區之組蛋白乙醯化而導致 p21WAF1/Cip1 轉錄活化 (46, 47, 49)，因為 H1299 (p53 -/-)的 p21WAF1/Cip1的轉錄也被活化。 p21WAF1/Cip1 基因的活 化可以抑制癌細胞的增生； 除了 p21WAF1/Cip1外，HDAC 抑制劑也可
促使抑癌基因TIMP-3 的轉錄活化
(Fig. 9A)
(50, 51)，而 TIMP-3 基 因與抑制癌細胞入侵、轉移及血管新生有關 (52)；因此，未來可以進 行 HDAC 抑制劑其抑制癌細胞入侵、轉移及血管新生能力的相關研 究分析。在藥物的細胞毒殺性實驗中，我們使用HDAC-44、HTPB 及已知 的 HDAC 抑制劑 SAHA 處理不同肺癌細胞株 A549、CL1-1、H1299 以及正常肺細胞株 IMR90，結果發現三種 HDAC 抑制劑對肺癌細胞 株有很強的細胞毒殺性，但對正常細胞株的存活率卻沒有明顯影響
(Fig. 11A-C)，此結果與文獻有類似的現象；例如
HDAC 抑制劑可以有效的抑制前列腺癌細胞生長，但正常的前列腺上皮細胞株則對 HDAC 抑制劑較不敏感 (45)。文獻也顯示，TSA 可以專一性的只活 化癌細胞的抑癌基因p21WAF1/Cip1的表達且抑制ErbB2 的基因表達，但 不影響正常細胞的 p21WAF1/Cip1與 ErbB2 表達 (46)；因此我們認為，
HDAC 抑制劑具有良好的細胞毒殺選擇性。推測原因可能是在癌細
胞中 HDACs 的活性或表達具有不正常的增加，但正常細胞則否，而 HDAC 抑制劑即可專一性的針對癌細胞中不正常的 HDAC 活性做 抑制。
新穎的 HDAC 抑制劑 HDAC-44 對三株肺癌細胞的 IC50 值皆 為最低
(Fig. 11D)
，且其對細胞的 IC50 亦較 HTPB 與 SAHA 低了許多，表示其細胞毒殺性最好，可以最有效的毒殺肺癌細胞株；因此，
我們對 HDAC-44 毒殺癌細胞的影響具有更深的興趣，故我們選用 HDAC-44 搭配目前臨床上使用的化療藥物 cisplatin 共同處理肺癌
細胞，觀察在此方法下對癌細胞是否具加成性的毒殺性。在此實驗 中，我們刻意使用非常低劑量的 HDAC-44 與 cisplatin 單獨或共同
處理癌細胞；HDAC-44 與 cisplatin 在低劑量下單獨處理肺癌細胞，
肺癌細胞的存活率皆還高達 80% 以上，但可發現若先處理低劑量的 HDAC-44 後，再接著處理低劑量的 cisplatin，癌細胞的存活率會大 大的降低
(Fig. 12)
，對細胞的毒殺有加成性的影響，即使是對cisplatin 有較高抗藥性的 CL1-1 肺癌細胞株也一樣；而目前的文獻將癌細胞 前處理 SAHA 或 TSA 後，再搭配處理 cisplatin，也顯示有加乘的促 使癌細胞死亡結果 (11)。Cisplatin 毒殺癌細胞的原理為，其可與 DNA 形成DNA adduct，抑制 DNA 複製並促使細胞於分裂時無法正常分離活性，而增加組織蛋白乙醯化的程度，導致染色質結構疏鬆。因此先 處理 HDAC-44 打開染色質結構後再處理 cisplatin，即可以幫助 cisplatin 更有效的嵌入 DNA 中，進而誘發癌細胞死亡，因此在臨床
的使用上，或許可以搭配這兩種藥物施予病人，以更有效的抑制病人 的腫瘤生長。另外，HDAC-44 與其他的 DNA-targeting 抗癌藥物或是
拓墣酶抑制劑類的抗癌藥物的結合使用，也極有可能加乘性的抑制癌 細胞的生長。
本研究接著希望了解 HDAC 抑制劑毒殺癌細胞的作用機轉。我 們利用 Flow Cytometry 發現三種 HDAC 抑制劑皆可有效的促使不 同的肺癌細胞株停在 G2/M 期
(Fig. 13)，顯示
HDAC 抑制劑會抑制 肺癌細胞的細胞核或細胞質分裂，與文獻有相似的結果 (41, 47)。而 HDAC 抑制劑也會導致癌細胞的 sub-G1 增加，顯示 DNA 片斷化，但此現象在細胞處理藥物48 小時後，sub-G1 期才會明顯增加，出現 細胞凋亡現象
(Fig. 14)，顯示細胞凋亡為藥物影響細胞晚期的現象
(48)；例如：在 A549 細胞株中發現 48 小時的 G2/M 期比例較 24 小
時的比例為低
(Fig. 14A)
，推測可能是由於細胞分裂受抑制的細胞開 始產生了細胞凋亡，而導致停在 G2/M 期的細胞變少了。此外也發現A549 (p53 +/+) 的肺癌細胞株比 H1299 (p53 -/-) 的
肺癌細胞株對三種 HDAC 抑制劑皆更加敏感 (IC50 值皆較低)，此 結果亦與文獻相同 (47)。而在H1299 細胞株中發現，隨著 HDAC-44
處理細胞的時間增加，其促使的細胞停止在 G2/M 期比例可以更為增 加
(Fig. 14B)。推測可能原因為
H1299 缺乏 p53 基因，而無 DNA 傷 害反應 (DNA damage response)，因而細胞較不容易死亡 (sub-G1 期 比例低) (47)，故有更多的細胞停止於 G2/M 期。此外，我們發現 HDAC 抑制劑會促使 A549 (p53 +/+) 及 CL1-1 (p53 mutant) 肺癌細胞的抗細胞凋亡蛋白 Bcl-2 表達下降(Fig. 15B)，但卻明顯促使 H1299 (p53 -/-) 的肺癌細胞株 Bcl-2 表達上升(Fig. 9B)，推測 H1299 細胞中所
觀察到的Bcl-2 表達上升可能是因為 HDAC 抑制劑促使 H1299 細胞之 Bcl-2 基因座之組蛋白乙醯化而導致 Bcl-2 表現量上升。未來，可以利
用 Western blot analysis 的方式，檢查於 H1299 細胞中一些與 G2/M arrest 有關的蛋白質，如：cyclin B、CDC42 等，或其他 anti-apoptosis 類之其他Bcl-2 蛋白成員。
由細胞週期檢測中發現細胞無法進行細胞分裂，因此接著我們進 行細胞免疫染色，利用DAPI 染細胞核，anti-α–tubulin 染細胞質中的 細胞骨架蛋白α–tubulin。本研究發現
(Fig. 16) HDAC-44 會導致細胞
核變大，顯示細胞或許在經過 DNA 複製後卻無法經歷細胞核分裂；分裂卻受到抑制；此外，細胞的骨架也出現不正常分佈的現象；並且 細胞核也發生 condensation 與 fraction 等細胞凋亡的現象。
由細胞週期檢測的實驗中我們發現 HDAC 抑制劑可能促使了
細 胞 凋 亡 ， 因 此 我 們 進 行 了 DNA ladder assay 及 Western blot analysis 以證實細胞凋亡的現象。DNA ladder 為細胞凋亡晚期的重要 指標，由於細胞凋亡的發生而活化內生性核酸水解酶 (endogenous nuclease)，其在 nucleosomes 間的 linker DNA 做切割，造成 DNA 片斷化，為細胞經歷細胞凋亡的有力證據。由實驗結果可知 HDAC 抑制劑的確可以有效的促使癌細胞產生DNA ladder (Fig. 15A)，經歷 細胞凋亡。此外，我們還進行了 Western blot analysis，檢查抗細胞凋 亡的Bcl-2 蛋白的表達情形。發現不同的肺癌細胞株，經處理 HDAC 抑制劑24 小時與 48 小時後，其 Bcl-2 蛋白的表達會下降
(Fig. 15B)
， 進一步支持 HDAC 抑制劑可促使細胞凋亡；未來將檢查更多與細胞 凋亡有關的蛋白質，如：Bad、Bax、Bcl-X、caspase3 及 caspase9 等 蛋白質的表達，以更加確認細胞凋亡的現象。此外，本研究為第一篇利用 ChIP-on-chip 方式廣泛大規模尋找 HDAC 抑制劑直接影響了哪些目標基因其 promoter 之組蛋白被乙醯 化，以免除文獻利用 cDNA microarray 的方式找尋到非 HDAC 抑制劑
在第一時間內影響的基因，這種廣泛大規模 ChIP-on-chip 分析也有助 於尋找新穎之目標基因，以進行後續其基因座組蛋白乙醯化機制分 析。例如：染色質沈澱的聚合酶鏈鎖反應 (ChIP-PCR)，在 DNA 層 次 確 認 目 標 基 因 的 染 色 體 結 構 ； 反 轉 錄 的 聚 合 酶 鏈 鎖 反 應 (RT-PCR) ， 在 RNA 層 次 確 認 目 標 基 因 的 表 現 ； 及 西 方 點 墨 法 (Western blot) 以觀察目標基因蛋白質的表達。在未來，也可使用不
同的 HDACs 抗體進行 ChIP-on-chip 分析，以進一步了解區分不同的 HDACs 是否有其專一影響抑制的基因。
經以上實驗，我們認為新穎的HDAC 抑制劑，HDAC-44 與 HTPB，
極具有潛力成為新穎的抗肺癌藥物，而 HDAC 抑制劑對其他種類的 癌症影響也很值得做進一步的研究。此外，我們也希望篩選中研院的 化學藥物庫以尋找出其他新穎的HDAC 抑制劑做深入研究。