第一章 前言
1.3 猪胸膜肺炎放線桿菌之抗原介紹
1.3.2 本實驗研發 DNA 疫苗所選用之目標抗原
猪胸膜肺炎放線菌最主要之毒力因子為RTX toxin，過去有研究指出 將猪胸膜肺炎放線桿菌之 apxIA 與 apx
Ⅱ
A 基因作缺失 (deletion)所產生 之突變菌株，發現菌體之毒力大為降低 (Boekema et al., 2004)。另外有研 究 將 猪 胸 膜 肺 炎 放 線 桿 菌 之 ApxIA 與 ApxⅡA 蛋 白 以 酵 母 菌 (Saccharomyces cerevisiae)表達系統表現，將重組之酵母菌餵食小鼠能降 低小鼠遭受猪胸膜肺炎放線桿菌感染時之死亡率 (Park et al., 2005；Shinet al., 2005)，故本研究選用不具有毒性之 ApxIA 與 ApxⅡA 作為目標抗 原，期望能誘發對抗ApxIA、ApxⅡ之抗體，降低猪胸膜肺炎放線桿菌之 毒力，減少猪隻受感染後之損傷與死亡率。
製作疫苗常以外膜蛋白作為目標抗原，誘發出的抗體與Tc 細胞可直 接對菌體攻擊，消滅病原。OmlA (outer membrane lipoprotein)位於猪胸膜 肺炎放線桿菌之外膜，蛋白質序列在不同的血清型具有很高之同源性，
研究發現以 OmlA 免疫後之猪隻遭受猪胸膜肺炎放線桿菌感染時存活率 較高 (Gerlach et al., 1993)，故本研究選用 OmlA 作為目標抗原，期望能 對抗不同血清型之猪胸膜肺炎放線桿菌，並降低猪隻受感染後之死亡率。
猪胸膜肺炎放線桿菌需要鐵離子才能正常地生長與發揮完整的毒 性，haemoglobin 是猪胸膜肺炎放線桿菌主要的鐵來源之一，haemoglobin 主要由外膜上之接受器蛋白HgbA (haemoglobin-binding protein)所接收，
進而攝取其中之鐵離子。研究指出，將猪胸膜肺炎放線桿菌之 hgbA 基因 作缺失之突變後，菌體雖然依然能接合 haemoglobin，但卻無法利用 haemoglobin 中所含的鐵離子 (Srikumar et al., 2004)。故本研究選用 HgbA 作為目標抗原，期望利用其位於菌體外膜的特性，能誘發細胞免疫反應，
直接殺死菌體，並期望能誘發抗體與 HgbA 結合，降低菌體之鐵離子來 源，進而降低菌體之毒性。
1.3.2.1 ApxIA
ApxI 為分子量 105 kD 之外毒素，有強烈地溶血性 (hemolytic activity) (Frey and Nicolet, 1988a; Frey and Nicolet, 1988b)，對 phagocytic cell 有強 烈地細胞毒性 (cytotoxic activity) (Kamp et al., 1991)。第 1 生物型之第 1、
5、9、10、11 血清型皆會分泌 ApxI (Beck et al., 1994; Frey et al., 1993a; Frey et al., 1993b; Kamp et al., 1994)。apxI operon 可轉譯出 ApxI，包含四段基 因：活化蛋白 (activator)基因 apxIC ，前毒素結構蛋白 (pretoxin structural protein)基因 apxIA，與毒素分泌相關之構造蛋白基因 apxIB 與 apxID (Frey et al., 1994; Gygi et al., 1992)
，
ApxIA 蛋白 (110 kD)需要 ApxIC 對其進行 後修飾作用 (post-translational modification)後才能活化成具有毒性之 ApxI (Gygi et al., 1990)，ApxI 再經過細胞膜上之 ApxIB 與 ApxID 複合體 運送至菌體外，形成外毒素的型態。1.3.2.2 ApxⅡA
ApxⅡ為分子量 103-105 kD 之外毒素，其有輕微的溶血性及細胞毒 性，除了第1 生物型中第 10 血清型外皆會分泌 ApxⅡ (Frey and Nicolet, 1988a; Frey et al., 1992; Kamp et al., 1991)。apx
Ⅱ
operon 可轉譯出 ApxⅡ，其包含兩段基因：活化蛋白 (activator)基因 apxⅡ
C ，前毒素結 構(pretoxin structure)蛋白基因 apxⅡ
A，比較於 apxI operon，apxⅡ
operon缺乏與毒素分泌相關之結構蛋白基因 apx
Ⅱ
B 及 apxⅡ
D， ApxⅡ亦依賴 ApxIB 與 ApxID 將其分泌至菌體外。1.3.2.3 OmlA
OmlA (outer membrane lipoprotein)為一由基因 omlA 轉譯並經過脂質 修飾之外膜蛋白，分子量為40 kD，此蛋白位於猪胸膜肺炎放線桿菌之外 膜上，第 1 生物型中第 1、2、8、9、11 及 12 血清型之 OmlA 有很高的 同源性，猪隻以 OmlA 免疫後可提高猪隻受到猪胸膜肺炎放線桿菌感染 後之死亡率，但於攻毒後一星期存活下來之猪隻肺部仍然有受感染後的 損傷，並有菌體的存在，故以 OmlA 免疫猪隻僅能降低死亡率，而無法 避免猪隻受感染後之傷害。因此本實驗除了以 OmlA 作為目標抗原外，
另選擇其他三種目標抗原，以期增進對猪隻的保護能力。
1.3.2.4 HgbA
HgbA (haemoglobin-binding protein)之分子量約為 105 kD，位於猪胸 膜肺炎放線桿菌之外膜上，主要功能是將菌體所結合的haemoglobin 中之 haem 導入菌體內，功能類似 TbpA 與 TbpB 接收 haem 後將其中的鐵離子 運送至菌體內，鐵離子的充足對於猪胸膜肺炎放線桿菌之正常生長及發 揮完整的毒力非常重要，故若能針對 HgbA 誘發猪隻之免疫反應，使其
無法正常地運作，勢必能削弱菌體生長的能力以及對猪隻之傷害。